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Asian J Beauty Cosmetol > Volume 16(3); 2018 > Article
더덕 껍질 추출물의 항산화 및 항염증 효과

요약

목적

더덕 껍질 추출물의 생리활성 및 화장품 소재로서의 가능성과 산업적 활용가치를 확인하고자 하였다.

방법

더덕 껍질 열수 그리고 에탄올 추출물을 이용하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거활성 및 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량, superoxide dismutase (SOD) 유사활성을 조사하여 항산화 효과를 확인하고, HaCaT 세포에서 H2O2에 대한 세포 보호 효과를 측정하였다. LPS로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포를 통해 nitric oxide (NO) 생성 억제 효과를 Griess의 방법으로 조사하였다.

결과

항산화 효과 측정 결과, DPPH 소거활성은 500 μg/mL에서 열수 추출물은 74.93%, 에탄올 추출물은 85.25% 소거능이 확인 되었으며, 열수 및 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 각각 70.22, 75.27 μg/mL 이고, 총 플라보노이드 함량은 16.12, 22.65 μg/mL으로 확인되었다. SOD 유사활성 측정 결과, 500 μg/mL에서 열수 추출물은 62.20%, 에탄올 추출물은 69.93%의 활성이 확인되었다. HaCaT 세포에서 H2O2에 대한 세포 보호 효과 측정결과, 100μ g/mL 농도에서 열수 및 에탄올 추출물은 각각 30, 36%의 보호 효과가 확인 되었다. Lipopolysaccharides (LPS)로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포를 통해 NO 저해 효과 측정 결과, 100 μg/mL 농도에서 열수 및 에탄올 추출물의 NO 생성량은 각각 14.57 μM, 11.45 μM로 감소하였다.

결론

더덕 껍질 에탄올 추출물은 열수 추출물보다 항산화 효과 및 세포 보호 효과 그리고 항염증 효과가 더 우수하였으며, 천연 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 있다고 판단된다.

Abstract

Purpose

The aim of this study was to investigate the biological and cosmetic properties and industrial value of Codonopsis lanceolata (C. lanceolata, Deodeok) skin extract.

Methods

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging activity, total polyphenol content, flavonoid content and superoxide dismutase (SOD)-like activity were measured to investigate the anti-oxidative effect of C. lanceolata skin extract, while its cytoprotective effect was studied on HaCaT cells treated with hydrogen peroxide. Nitric oxide (NO) production inhibition was evaluated using Griess’ method, after inducing an inflammatory response in RAW 264.7 cells using lipopolysaccharides (LPS).

Results

DPPH radical-scavenging ability at 500 μg/mL was 74.93% and 85.25% for hot water and ethanol extracts, respectively, while total polyphenol contents were 70.22 and 75.27 μg/mL and total flavonoid contents were 16.12 and 22.65 μg/mL; SOD-like activities of the extracts were 62.2% and 69.93% at 500 μg/mL. The extracts exhibited a 30% and 36% protective effect at 100 μg/mL on hydrogen peroxide-treated HaCaT keratinocytes, respectively, and NO inhibition in RAW 264.7 cells induced with LPS was 14.57 and 11.45 μM at 100 μg/mL concentration.

Conclusion

These results suggest that the ethanol extract of C. lanceolata skin has higher anti-oxidative, cytoprotective, and anti-inflammatory effects than the hot water extract, and is a candidate for a natural, functionalcosmetic material.

中文摘要

目的

调查沙参皮提取物的生理活性,作为化妆品原料的可行性以及产业应用价值。

方法

利用沙参皮热水和 乙醇提取物测定2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)自由基消除活性,总多酚和类黄酮含量,以及以调 查superoxide dismutase (SOD)活性来确认抗氧化作用,对HaCaT细胞的细胞保护作用。通过Griess方法 检测由LPS诱导的RAW 264.7细胞对nitric oxide (NO)产生的抑制。

结果

抗氧化测定结果,在提取物浓度为 500 μg/mL时,热水和乙醇提取物的DPPH清除活性分别为74.93%,85.25%;热水和乙醇提取物的总多酚 含量分别为70.22和75.27 μg/mL,总类黄酮含量分别为16.12,22.65 μg/mL。SOD样活性测量结果,在浓 度为500 μg/mL时,热水提取物和乙醇提取物的活性能分别检测到62.20%和69.93%。在提取物浓度为100 μg/mL时,热水和乙醇提取物对过氧化氢处理的HaCaT角质形成细胞的保护作用分别为30%和36%。通过 lipopolysaccharides (LPS)诱导炎症反应的RAW 264.7 细胞,测定NO抑制效果结果显示,在浓度为100 μg/mL时,热水和乙醇提取物的NO生成量降低为14.57 μM,11.45 μM。

结论

沙参皮乙醇提取物比热水提取物具 有更高的抗氧化,细胞保护和抗炎作用,并且作为天然功能性化妆品原料充分具有可行性。

Introduction

현대 사회의 급격한 산업 발달로 인해 생활환경 및 식생활의 변화 그리고 이에 따른 스트레스가 증가하고 있다. 이로 인해 여드름, 아토피, 과민성 피부, 천식 등의 만성 염증 질환이 증가하면서 다양한 요인으로 인한 면역 조절 이상으로 유발된 염증이 지속되고 있다. 그러나 지속적으로 또는 과도하게 발생된 만성염증반응은 조직의 손상을 유발하며 이와 관련한 활성 산소종과 염증성 cytokine은 내독소 자극을 포함한 다양한 질병의 매개체로써 중요한 역할을 한다(Kim et al., 2015a). 항산화 물질(antioxidant)은 불포화지방산의 자동산화에 의해 생성되는 지질과 산화물을 억제하여 식품의 산패를 억제해 줄 뿐만 아니라 생체 내에서 생성되는 각종 활성산소종(1O2, O2-, H2O2, ∙OH)에 의한 지질과산화반응을 억제하여 암, 동맥경화증, 염증, 당뇨, 및 노화를 예방해주는 생리활성물질로서 크게 각광을 받고 있다(Leem et al., 2011). 천연물질로부터 생리활성 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 항산화제로는 α-tocopherol, vitamin C, carotenoids, flavonoids와 같은 천연 항산화제와 butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA) 및 t-butylhydroquinone (TBHQ) 등과 같은 여러 합성 항산화제가 널리 사용되고 있으나, 천연 항산화제의 높은 가격 및 낮은 항산화 활성, 그리고 합성 항산화제의 발암성 및 독성 등의 안전성 문제가 제기되면서 보다 안전하고 효과 있는 천연 항산화제의 개발이 요구되고 있다(Kim et al., 2015b). 세포사는 노화나 염증 등의 질병으로 진행이 되며 특히 염증성 질환과 밀접한 관계를 갖고 있는데 산화적 손상 및 자극에 대하여 염증성 사이토카인이나 단백질이 발현하여 염증을 유발한다고 알려져 있다(Kang, 2012). 염증반응은 생체에 이물질이 감염 또는 침입하였거나 물리 화학적 손상을 입었을 때 이를 방어하기 위한 국소적 현상이지만, 과잉의 생체 방어 반응은 염증 국소 주위에 있는 정상조직을 손상시켜 염증질환을 일으킨다(Kim & Ryu, 2017; Park et al., 2011). 염증반응과 관련하여 혈관이 확장되어 감염부위로 혈류량이 증가함에 따라 혈관의 투과성이 향상되고, 면역 세포들이 손상된 조직으로 이동하면서 발열, 통증, 홍반 및 부종 등의 증상이 나타난다. 염증반응에 관여하는 주요 세포는 대식세포로 알려져 있으며, 여러 자극이나 면역세포들이 분비하는 사이토카인 등에 의해 활성화된다(Park & Kang, 2016). 생체 내 염증을 촉진하는 효소로는 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 lipoxygenase (LOX)가 잘 알려져 있으며, 이들 효소를 저해하는 물질은 염증성 질환을 저해하는 항염증제로서 개발 가능성이 높다(Kim & Jeong, 2014). 지금까지 개발된 항염증제는 크게 스테로이드계(히드로코르티손, 프레드니솔론, 베타메타손)와 비스테로이드계(아스피린, 인도메타신, 이부프로펜)로 나눌 수가 있는데, 모두 염증반응의 주요 매개체인 프로스타글란딘의 생합성을 억제해줌으로써 항염증 작용을 나타내는 약제이다. 그러나 이들 항염증제는 위염, 신장염 및 심장질환 등을 초래함으로써 인체 안전성 면에서 대부분 문제점을 안고 있어 그 사용이 일부 제한되고 있기에 현재 천연으로부터 보다 안전한 항염증 치료제의 개발이 활발히 이루어지고 있다(Lee et al., 2017). 더덕(沙蔘, Codonopsis lanceolata)은 한국, 중국 및 일본의 산간지방에서 야생하는 다년생 초본으로 도라지와 함께 일반식용으로 널리 이용되고 있는 산채식품이다. 더덕은 기호품으로도 상당한 호평을 받는 식품일뿐 아니라 진해(鎭咳), 거담(祛痰) 등의 약효가 있다고 古來부터 식이요법이 전해지며, 혈적(血積), 경기(驚氣), 두통(頭痛) 및 소화약(消炎藥)으로 또는 인삼의 대용약으로 사용되어 왔으며, 더덕의 성분에 관해서는 일종의 saponin이 존재한다는 것이 확인되었다(Kim & Chung, 1975; Kim et al., 2010a). 더덕의 국내 연구는 항산화 효과(Maeng & Park, 1991; Park et al., 2010), 면역효과(Suh, 1996), 미백효과(Kim et al., 2010b; Lee et al., 2002) 등이 진행되고 있지만 더덕 껍질을 이용한 연구는 미비한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 더덕 껍질 열수 그리고 에탄올 추출물을 이용하여 DPPH radical 소거활성 및 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량, SOD 유사활성을 조사하여 항산화 효과를 확인하고, HaCaT 세포에서 H2O2에 대한 세포 보호 효과를 측정하였다. 그리고 LPS로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포를 통해 NO 생성을 억제하는 효과를 Griess의 방법으로 조사하였다.

Methods

1. 시약 및 기기

본 연구에 사용한 시약은 DPPH (Sigma-Aldrich, USA), BHT (Sigma-Aldrich), ascorbic acid (vitamin C; Sigma-Aldrich), Folin-Denis' reagent (Sigma-Aldrich), sodium carbonate (Sigma-Aldrich), sodium hydroxide (Sigma-Aldrich), tannic acid (Sigma-Aldrich), diethylene glycol (Sigma-Aldrich), pyrogallol (Sigma-Aldrich), naringin (Sigma-Aldrich), hydrogen peroxide solution (Sigma-Aldrich), 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich), trypan blue (Sigma-Aldrich), lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 (LPS; Sigma-Aldrich)이고, 세포배양에는 Dulbeccos modified Eagle smedium (DMEM; Gibco BRL, USA), 10% 우태아혈청 fetal bovine serum (FBS; Sigma-Aldrich), penicillin-streptomycin (P/S; Gibco BRL)을 구입하여 사용하였다.

2. 시료 제조

전라도 화순에서 재배한 더덕(Codonopsis lanceolata)을 채취하여, 더덕 표면에 있는 흙은 충분히 털어낸 후 증류수로 세척하여 껍질과 육질을 분리하여 껍질은 자연 건조하여 사용하였다. 열수 추출방법(water extraction, WE)은 더덕 껍질을 60℃에서 증류수를 가해서 24 h 추출하였으며, 에탄올 추출방법(ethanol extraction, EE)은 더덕 껍질을 60℃에서 70% 에탄올을 가해서 24 h 추출하고, 추출액을 여과(Whatman filter paper No.1; Whatman, UK)한 후에 회전식 감압농축기(EYELA N-1000; Tokyo Rikakikai Co, Japan)로 농축한 후, 동결건조기(PVTFA 10AT; ILSIN, Korea)에 72 h 동안 동결 건조하여 분말로 만들어 실험을 진행하였다.

3. 전자 공여능

DPPH radical을 이용한 항산화 활성은 Blois (1958) 방법을 약간 변형하여 사용하였다. 1 mM DPPH 용액 100 μL와 추출물(15.7-500 μg/mL)을 100 μL씩 취하여 혼합한 후 30 min 암 상태에서 방치한 후 잔존 radical 농도를 Microplate Reader (iMARK™; BIO-RAD, USA)를 이용하여 517 nm에서 측정하였다. 활성비교를 위하여 항산화 물질로 잘 알려진 BHT, ascorbic acid와 비교하였다. 전자공여능(%)은 (1-시료의 흡광도/대조군의 흡광도)×100에 의하여 산출하였다.

4. 총 폴리페놀 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin & Denis (1915) 방법에 따라, 추출물(1 mg/mL) 50 μL에 증류수 650 μL 넣고 Folin-Denis' reagent 50 μL를 가하여 3 min 동안 실온에서 반응시킨다. 반응시킨 후 10% sodium carbonate (Na2CO3; Sigma-Aldrich) 포화용액을 100 μL 첨가하고, 최종 볼륨을 1 mL 맞추기 위해 증류수 150 μL 넣어 잘 혼합시켰다. 37℃ water bath에 1 h 반응시킨 후 Microplate Reader (iMARK™)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 tannic acid 농도 0-500 μg/mL이 되도록 하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.

5. 총 플라보노이드 함량

총 플라보노이드 함량은 추출물(1 mg/mL) 100 μL에 1 mL diethylene glycol을 첨가하고, 다시 1 N sodium hydroxide (NaOH; Sigma-Aldrich) 100 μL 넣어 잘 혼합시켜 37℃ water bath에 1 h 반응시킨 후 Microplate Reader (iMARK™)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 naringin 농도를 0-300 μg/mL이 되도록 하여 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

6. SOD 유사활성

SOD 유사활성은 Marklund & Marklund (1974)의 방법에 따라 과산화수소(H2O2)로 전화시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 추출물(15.7-500 μg/mL) 2 mL에 Tris-HCl의 완충용액(50 mM Tris+10 mM EDTA, pH 8.5) (Sigma-Aldrich) 3.0 mL과 7.2 mM pyrogallol (Sigma-Aldrich) 0.2 mL을 가하여 25℃에서 10 min 반응시킨 후 1N HCl 0.1 mL을 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 %로 나타내었다.

7. HaCaT 세포에서 H2O2에 대한 세포 보호 효과 측정

1) 세포배양

HaCaT 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea)에서 분양 받아 사용하였으며 세포는 10% FBS과 P/S을 첨가한 DMEM 배지에 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포 배양배지는 세포가 80% 이상 자란 시점에서 2-3일마다 교환하였다.

2) 세포 생존율 측정

HaCaT 세포의 생존율 측정은 96 well plate의 각 well에 logarithmic phase에 도달한 세포를 1×105 cells/well의 농도가 되도록 조절하여 분주하여 24 h 배양하여 부착화 및 안정화를 시행하였다. 24 h 배양이 끝난 후 추출물을 최종 농도 5-200 μg/mL가 되도록 배양액에 희석하여 부착 및 안정화된 세포에 공급하고 24-48 h 동안 배양하였다. 배양완료 후 well에 MTT 용액(5 mg/mL in phosphate buffered saline)을 10 μL씩 가해주고, 다시 37℃, 5% CO2의 습윤 배양기에서 4 h 동안 반응하여 MTT가 환원되도록 하였다. 각 well에 생성된 formazan 결정을 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) 150 μL로 잘 녹여서 Microplate Reader (iMARK™)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) H2O2에 대한 세포 보호 효과 측정

24 well plate에 HaCaT 세포를 각 well 당 1×105 cell/well로 분주하고, 24 h을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다. 24 h의 배양이 끝난 후, 더덕 열수 추출물과 에탄올 추출물을 세포 독성이 없는 5, 10, 50, 25 μg/mL의 농도로 4 h 전 처리하여 배양액을 씻어낸 후, hydrogen peroxide solution (H2O2; Sigma-Aldrich) 500 μM를 투여하여 24 h 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 배양액을 제거하고 각 well에 생성된 formazan 결정을 DMSO를 첨가하여 녹인 후 Microplate Reader (iMARK™)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

8. RAW 264.7 세포에서LPS에 대한 항염증 효과 측정

1) 세포배양

마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였으며 세포는 10% FBS과 P/S을 첨가한 DMEM 배지에 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포 배양배지는 세포가 80% 이상 자란 시점에서 2-3 일마다 교환하였다.

2) 세포 생존율 측정

RAW 264.7 대식세포의 생존율 측정은 96 well plate의 각 well에 logarithmic phase에 도달한 세포를 1×105 cells/well의 농도가 되도록 조절하여 분주하여 24 h 배양하여 부착화 및 안정화를 시행하였다. 24 h 배양이 끝난 후 추출물을 최종 농도 5-200 μg/mL가 되도록 배양액에 희석하여 부착 및 안정화된 세포에 공급하고 24 h 동안 배양하였다. 배양완료 후 well에 MTT 용액(5 mg/mL in phosphate buffered saline)을 10 μL씩 가해주고, 다시 37℃, 5% CO2의 습윤 배양기에서 4 h 동안 반응하여 MTT가 환원되도록 하였다. 각 well에 생성된 formazan 결정을 dimethyl sulfoxide 150 μL로 잘 녹여서 Microplate Reader (iMARK™)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) RAW 264.7 세포에서 NO 저해 효과 측정

최근 자외선과 같은 외부 환경요인에 의해 과다 생성되어 과색소 생성 및 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성(Bu & Lee, 2016)에 대한 더덕 추출물의 효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고 더덕 열수 추출물과 에탄올 추출물을 세포 독성이 없는 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다.

9. 통계처리

본 연구의 모든 실험 결과는 3회 이상 반복하여 평균값으로 나타내었으며, 통계학적 유의성은 Student's t-test로 분석하였으며, p value가 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다(*p<0.05, **p<0.01).

Results and Discussion

1. DPPH radical 소거능

전자공여능 측정은 DPPH radical 소거 활성을 이용하여 측정하였다. DPPH는 비교적 안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 방법이다(Jin et al., 2013). 더덕 껍질 열수, 에탄올 추출물을 농도 별(15.7-500 μg/mL)로 DPPH 용액에 첨가하여 free radical 소거 활성 능력을 측정한 결과, 열수 추출물은 12.6, 21.95, 34.55, 49.72, 69.91, 74.93%의 소거능이, 그리고 에탄올 추출물은 17.26, 27.75, 38.22, 59.14, 72.21, 85.25%의 소거능이 확인 되었다. 양성대조군으로 사용된 Vit C의 DPPH radical 소거능은 78.81, 89.84, 91.81, 92.29, 92.3, 92.5%로 확인되었고, BHT의 경우 2.08, 6.32, 28.36, 50.49, 68.31, 84.38%로 확인되었다(Figure 1). 더덕 껍질 에탄올 추출물은 Vit C 보다는 소거능이 낮지만 500 μg/mL의 농도에서는 BHT 보다 높은 소거능이 확인되었다.

2. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

폴리페놀계 물질들은 다양한 구조와 분자량을 가지며, 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl (OH) 기를 가진 benzene 화합물을 가리킨다. 이는 색소 화합물인 플라보노이드와 탄닌이 주성분으로 항산화, 항균, 항암, 충치예방 등의 생리기능을 가지는 것으로 알려져 있다(Eun et al., 2016). 본 실험에서는 더덕 껍질 추출물에 존재하는 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 각각 tannic acid, naringin을 기준 물질로 하여 측정하였다. 더덕 껍질 열수, 에탄올 추출물 1 mg/mL 농도에서 총 폴리페놀 함량은 tannic acid 표준 곡선으로 하여 측정한 결과, 70.22±1.03, 75.27±1.23 μg/mL으로 나타났다(Table 1). Naringin을 표준곡선으로 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 더덕 껍질 열수, 에탄올 추출물 1 mg/mL 농도에서 16.12±1.01, 22.65±1.13 μg/mL로 나타났다(Table 1). 이는 Kim et al. (2010a)의 연구결과, 즉, 총 페놀화합물 함량은 24.65 μg/mL, 플라보노이드 함량은 6.19 μg/mL에서 보다 높은 함량을 보였다.

3. SOD 유사활성

SOD는 자유 라디칼을 근본적으로 제거하는 효소이고 다른 종류의 항산화제보다 우수한 효과를 나타내기 때문에 의약제재로서 많은 관심을 일으키고 있으며, 현재 항염증 제제나 피부 노화방지를 위한 미용제재로 화장품 등에 이용 되고 있다(Shin et al., 2006). Superoxide (O2-)의 산화 억제작용을 알아보기 위하여 superoxide와 반응하여 갈변물질을 내는 pyrogallol의 자동산화 반응을 측정한 결과, 500 μg/mL에서 열수 추출물의 경우 62.20% 유사활성을 나타내었고, 에탄올 추출물의 경우 69.93%의 유사활성을 나타내었다(Figure 2). 더덕 껍질의 열수 및 에탄올 추출물의 농도가 증가할수록 SOD 유사활성이 증가함을 볼 수 있고, 열수 추출물보다는 에탄올 추출물에서 더 효과적인 것을 확인할 수 있었다.

4. HaCaT 세포에서 더덕 껍질 추출물의 H2O2에 대한 세포 보호 효과

1) 세포 생존율

MTT 방법으로 더덕 껍질 추출물이 사람각질형성세포에 대한 세포독성을 확인함으로써 실험에 사용될 시료의 농도범위를 결정하였다. 5-200 μg/mL까지 다양한 농도로 처리하여 세포생존율을 확인한 결과, 시료의 처리 농도 의존적으로 세포 독성이 더 강해지는 것을 관찰하였으며, 다음 실험에 적용할 더덕 껍질 추출물의 농도는 생존율이 90% 이상(열수 추출물: 91.63%, 에탄올 추출물 90.8%)이 되는 100, 50, 20, 10, 5 μg/mL 농도를 적용하였다(Figure 3). Kim et al. (2013)의 연구 결과에 따르면 더덕 추출물의 경우 인간 피부 섬유아세포 CCD-986sk에서 1,000 mg/mL의 농도에서 10% 내외의 세포독성을 보여 더덕 추출물의 경우 세포독성이 높지 않은 것을 확인할 수 있었다.

2) 과산화수소로 유도된 세포손상에 대한 세포 보호 효과

과산화물 음이온(superoxide anion), 과산화수소(H2O2), 수산기 라디칼(hydroxyl radical, ∙OH) 등과 같은 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 산화적 스트레스를 유발한다. 반응성 산소종은 염증, 노화, 암 발생과 같은 다양한 병리학적인 요인으로 알려져 있다(Jeong, 2017; Shin et al., 2006). 더덕 껍질 추출물이 과산화수소로 유도된 HaCaT 세포의 보호효과를 Figure 4에 나타내었다. 실험결과, 과산화수소를 처리한 실험군은 처리하지 않은 군에 비하여 약 49%의 생존율을 나타내었다. 더덕 껍질 열수 추출물 처리군의 세포생존율은 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL의 농도에서 각각 51.22, 55.32, 60.41, 71.41, 79.90%의 생존율이 확인 되었으며, 더덕 껍질 에탄올 추출물은 55.18, 59.21, 67.21, 74.12, 85.24%의 생존율이 확인되었다. 위의 실험결과 더덕 껍질 추출물은 50, 100 μg/mL의 농도에서 유의성 있는(p<0.05) 보호 효과를 보였으며, 특히 더덕껍질 에탄올 추출물이 보호효과가 더 뛰어난 것으로 추측할 수 있다(Figure 4).

5. RAW 264.7 세포에서 LPS에 대한 항염증 효과

1) 세포 생존율

더덕 껍질 추출물이 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 5-200 μg/mL까지 다양한 농도로 처리하여 세포생존율을 확인한 결과, 시료의 처리 농도 의존적으로 세포 독성이 더 강해지는 것을 관찰하였으며, 다음 실험에 적용할 더덕 추출물의 농도는 생존율이 90% 이상(열수 추출물: 90.63%, 에탄올 추출물: 90.8%)이 되는 100, 50, 20, 10, 5 μg/mL 농도를 적용하였다(Figure 5).

2) RAW 264.7 세포에서 NO 저해 효과 측정

산화질소(nitric oxide, NO)는 세포 사이의 작용을 매개하는 물질로 대식세포나 간세포에서 면역적인 자극에 의해 생성된다(Jang et al., 2011). NO의 생성량은 RAW 264.7 세포의 배양액 중에 LPS 자극으로 유도된 NO의 함량을 측정하는 것으로 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL의 농도에서 더덕 껍질 추출물을 처리하여 배양한 후, 세포 배양액에 Griess 시약을 반응시켜 확인하였다. 시료는 5-100 μg/mL의 농도로 처리하였으며, 대조군으로는 시료대신 PBS를 사용하여 LPS를 처리 한 control과 시료 및 LPS를 처리하지 않은 blank를 사용하였다. LPS를 처리한 control은 NO 생성량이 19.21 μM로 높게 나타났으며, LPS를 처리하지 않은 blank는 NO의 생성량이 0.21 μM로 상대적으로 매우 낮게 나타났다. LPS에 의해 염증 반응이 유도된 세포에 더덕 껍질 추출물을 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL로 처리한 결과, 열수 추출물에서는 농도별로 각각 20.14, 18.78, 16.25, 16.08, 14.57 μM까지 NO 생성량이 감소하였고, 에탄올 추출물에서는 농도별로 각각 16.15, 14.18, 14.05, 13.58, 11.45 μM까지 NO 생성량이 감소하였다. LPS에 의해 NO의 생성량이 19.21 μM까지 증가된 것에 비해 더덕 껍질 에탄올 추출물 100 μg/mL의 농도에서는 11.45 μM까지 감소된 것으로 보아, 더덕 껍질 에탄올 추출물이 유의성(p<0.05) 있는 NO 생성 억제 효과를 확인할 수 있었다(Figure 6).

Conclusion

본 연구에서는 더덕 껍질의 생리활성 물질 중 천연 기능성 화장품 소재로서의 사용 가능성에 대하여 확인하고자 하였다. 더덕껍질 열수 그리고 에탄올 추출물을 이용하여 DPPH radical 소거활성 및 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량, SOD 유사활성을 조사하여 항산화 효과를 확인하고, HaCaT 세포에서 H2O2에 대한 세포 보호 효과를 측정하였다. 그리고 LPS로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포를 통해 NO 생성 저해 효과를 알아보았다. 항산화 효과 측정 결과, DPPH 소거활성은 500 μg/mL에서 열수 추출물은 74.93%, 에탄올 추출물은 85.25%의 소거능이 확인 되었으며, 총 폴리페놀 함량은 각각 70.22, 75.27 μg/mL 이고, 총 플라보노이드 함량은 16.12, 22.65 μg/mL 의 함량이 확인 되었다. SOD 유사활성 측정 결과, 500 μg/mL에서 열수 추출물은 62.20, 에탄올 추출물은 69.93%의 활성능이 확인 되었다. HaCaT 세포에서 H2O2에 대한 세포 보호 효과 측정결과, 100 μg/mL 농도에서 각각 30, 36%의 보호 효과가 확인 되었다. LPS로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포를 통해 NO 저해 효과 측정 결과, 100 μg/mL 농도에서 열수 및 에탄올 추출물의 NO 생성량은 각각 14.57, 11.45 μM 이었다. 이러한 결과, 더덕 껍질 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 항산화 효과 및 세포 보호 효과 그리고 항염증 효과가 더 우수하였으며, 천연 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 있다고 판단된다.

Acknowledgements

본 연구는 2017년도 남부대학교 학술연구비의 지원을 받아 연구되었음.

Figure 1.

DPPH radical scavenging activities of C. lanceolata skin extracts.

DPPH radical scavenging assays were conducted to investigate the anti-oxidant effects of C. lanceolata skin in water and ethanol extracts at varying concentrations of 15.7, 31.3, 62.5, 125, 250, and 500 μg/mL, respectively. WE, water extracts, EE, 70% ethanol extracts; Vit C, ascorbic acid; BHT, butylated hydroxytoluene group; DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; C. lanceolata, Codonopsis lanceolata.
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Figure 2.

SOD-like activity of C. lanceolata skin extracts.

SOD-like activity assays were conducted to investigate the antioxidant effects of C. lanceolata skin in WE and EE at varying concentrations of 15.7, 31.3, 62.5, 125, 250, and 500 μg/mL, respectively. SOD, superoxide dismutase; WE, water extracts, EE, 70% ethanol extracts; Vit C, ascorbic acid; BHT, butylated hydroxytoluene group; C. lanceolata, Codonopsis lanceolata.
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Figure 3.

Effect of C. lanceolata skin extracts on human HaCaT keratinocytes viability.

Human HaCaT cells were incubated with C. lanceolata skin extracts at varying concentrations (5, 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h and cell viability was measured using MTT assay. Values represent the mean standard deviation of three independent experiments. Statistically significant differences are indicated with an asterisk (*p<0.05, compared with untreated control cells). WE, water extracts; EE, 70% ethanol extracts; MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; C. lanceolata, Codonopsis lanceolata.
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Figure 4.

Protective effect of the C. lanceolata skin extracts against oxidative stress induced by H2O2 in human HaCaT keratinocytes.

Human HaCaT cells were incubated with C. lanceolata skin extracts for 2 h followed by treatment with 500 μM H2O2 for 24 h and cell viability was measured using MTT assay. Results are represented as mean standard deviation of the three independent experiments. Statistically significant differences are indicated with asterisks (*p<0.05, compared with controls). WE, water extracts; EE, 70% ethanol extracts; H2O2, hydrogen peroxide; MTT, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide; C. lanceolata, Codonopsis lanceolata
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Figure 5.

Effects of C. lanceolata skin extracts on the viability of RAW 264.7 cells.

RAW 264.7 cells were incubated with C. lanceolata skin extracts at varying concentrations (5, 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values represent the mean standard deviation MS.D. of three independent experiments. Statistically significant differences are indicated with an asterisk (*p<0.05 compared with control). WE, water extracts; EE, 70% ethanol extracts; C. lanceolata, Codonopsis lanceolata.
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Figure 6.

Effects of C. lanceolata skin extracts on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.

RAW 264.7 cells were treated with varying concentrations of C. lanceolata skin extracts for 1 h, and then treated with or without LPS (1 μg/mL) for 24 h. NO concentration in the medium was determined using the Griess’ assay. Results are represented as the mean standard deviation of three independent experiments. Statistically significant differences are indicated with asterisks (*p<0.05, compared with controls). WE, water extracts; EE, 70% ethanol extracts; LPS, lipopolysaccharide; NO, nitric oxide; C. lanceolata, Codonopsis lanceolata.
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Table 1.
Total phenolic and flavonoid contents of water and ethanol extracts from C. lanceolata shells
Component WE EE
Total phenolic 70.22±1.03 μg/mL 75.27±1.23 μg/mL
Total flavonoid 16.12±1.01 μg/mL 22.65±1.13 μg/mL

Values represent the M±S.D. of three independent experiments.

WE, water extraction; EE, 70% ethanol extraction; C. lanceolata, Codonopsis lanceolata; M±S.D., mean±standard deviation.

References

Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200. 1958.
crossref pdf
Bu HJ, Lee S. Antioxidation and anti-inflammation activity of Isodon inflexus (ThunbKudo extract and its isolated substance. Journal of the Society of Cosmetic Scientists of Korea 42: 257-268. 2016.
crossref pdf
Eun CS, Hwang EY, Lee SO, Yang SA, Yu MH. Anti-oxidant and anti-inflammatory activities of Barley sprout extract. Journal of Life Science 26: 537-544. 2016.
crossref pdf
Folin O, Denis W. A colorimetric method for the determination of phenols (and phenol derivatives) in urine. Journal of Biological Chemistry 22: 305-308. 1915.

Jang JR, Hwang SY, Lim SY. Inhibitory effect of extracts of Platycodon grandiflorum (the Ballon flower) on oxidation and nitric oxide production. Korean Journal of Food Preservation 18: 65-71. 2011.
crossref pdf
Jin KS, Oh YN, Lee JY, Son BY, Choi WB, Lee EE, Kwon HJ, Kim BW. Anti-oxidative and anti-inflammatory activities of seven medicinal herbs including Tetrapanax papyriferus and Piper longum Linne. Microbiology and Biotechnology Letters 41: 253-262. 2013.
crossref
Kang HW. Antioxidant and anti-inflammatory effect of extracts from Flammulina velutipes (Curtis) Singer. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 41: 1072-1078. 2012.
crossref pdf
Kim KS, Ryu MJ. Physiological activity of the Glycyrrhiza uralensis extracts as a cosmetic product. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 15: 11-22. 2017.
crossref pdf
Kim SJ, Jang TW, Kim DW, Park JH. Study on antioxidant and anti-inflammatory activities of Persicaria tinctoria. The Korea Journal of Herbology 30: 17-24. 2015a.
crossref pdf
Kim SG, Byun HD, Kim SC, Yang KW, Kim JH, Han JH. Antioxidative and anti-inflammatory activities of Carrot flower. Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30: 77-81. 2015b.

Kim ES, Jeong NH. Anti-inflammatory effect of germinated mung bean and hairdye applications. Journal of the Korean Oil Chemists’Society 31: 23-30. 2014.
crossref
Kim CH, Chung MH. Pharmacognostical studies on Codonopsis lanceolata. Korean Journal of Pharmacognosy 6: 43-47. 1975.

Kim NY, Chae HS, Lee IS, Kim DS, Seo KT, Park SJ. Analysis of chemical composition and antioxidant activity of Codonopsis lanceolata skin. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 39: 1627-1633. 2010a.
crossref pdf
Kim JS, Kim JW, Kwon HS, Lim HW, Lee HY. Screening of skin whitening activity of Codonopsis lanceolata extract by complex steaming process. Korean Journal of Medicinal Crop Science 21: 54-60. 2013.
crossref pdf
Kim BH, Lee YT, Kang KH. Codonopsis lanceolata inhibits inflammation through regulation of MAPK in LPSstimulated RAW 264.7 cells. Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine 24: 80-84. 2010b.

Jeong SH. Anti-oxidant activities of phytol on keratinocytes. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 15: 457-465. 2017.
crossref pdf
Lee JY, Yoo DH, Jo DH, Kim SR, Jo HS, Joo SH, Chae JW. Antiinflammatory effects of Amelanchier asiatica fruits ethanol extract. Journal Society of Cosmetic Scientists of Korea 43: 19-26. 2017.
crossref pdf
Lee SY, Kim JM, Oh HC, Im SJ, Hwang CY, Mun YJ, Woo WH. The effect of Codonopsis lanceolata on the melanogenesis. The Journal of Herbal Formula Science 10: 199-211. 2002.

Leem HH, Kim EO, Seo MJ, Choi SW. Antioxidant and antiinflammatory activities of Eugenol and its derivatives from clove (Eugenia caryophyllata Thunb). Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 40: 1361-1370. 2011.
crossref pdf
Maeng YS, Park HK. Antioxidant activity of ethanol extract from Dŏdŏk (Codonopsis lanceolata). Korean Journal of Food Science and Technology 23: 311-316. 1991.

Marklund S, Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. European Journal of Biochemistry 47: 469-474. 1974.
crossref pmid
Park GH, Lee JY, Kim DH, Cho YJ, An BJ. Anti-oxidant and antiinflammatory effects of Rosa multiflora Root. Journal of Life Science 21: 1120-1126. 2011.
crossref pdf
Park MJ, Kang YH. Anti-oxidant and anti-inflammatory activities of various organ extracts from Trichosanthes kirilowii Maxim. Korean Journal of Pharmacognosy 47: 327-332. 2016.

Park SJ, Park DS, Lee SB, He X, Ahn JH, Yoon WB, Lee HY. Enhancement of antioxidant activities of Codonopsis lanceolata and fermented Codonopsis lanceolata by ultra high pressure extraction. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 39: 1898-1902. 2010.
crossref pdf
Suh JS. Effect of Codonopsis lanceolatae Radix water extract on immunocytes. The Korean Journal Food and Nutrition 9: 379-384. 1996.

Shin SH, Kim DS, Kim MJ, Kim SH, Jo SK, Byun MW, Yee ST. Protective effects of a herbal composition (HemoHIM) against apoptosis induced by oxidative stress of hydrogen peroxide. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 35: 1127-1132. 2006.
crossref pdf
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