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Asian J Beauty Cosmetol > Volume 17(1); 2019 > Article
B16F10 세포에서 증숙도라지 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과

요약

목적

본 연구의 목적은 생도라지에 비해 증숙 공정을 거친 도라지를 여러 농도의 에탄올로 추출하여 생리활성 효과를 비교 및 조사하여 미백 기능성화장품 소재로서의 활용 가능성을 확인하고자 한다.

방법

B16F10 멜라노마 세포에서 도라지 추출물의 세포독성평가를 확인하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium (MTS) assay를 수행하였다. 또한, 미백효과를 확인하기 위하여 멜라닌 생합성 함량 측정과 western blot을 통한 멜라닌 생성 관련 인자들의 단백질 발현을 측정하였다.

결과

도라지 추출물은 B16F10 멜라노마 세포에서 추출물에 의한 독성을 나타내지 않았다. 멜라닌 생합성 함량 측정 결과 생도라지에 비해 증숙 도라지 70% 에탄올 추출물에서 더 효과적으로 멜라닌 합성을 억제하였다. Tyrosinase-related protein-1 (TRP-1), TRP-2, tyrosinase 또한 증숙 도라지 70% 에탄올 추출물에서 효과적으로 멜라닌 생성 관련 인자들의 발현을 억제하였다.

결론

이러한 결과는 증숙 공정을 거친 도라지 추출물은 α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH)에 의해 자극을 받은 B16F10 멜라노마 세포에서 멜라닌 생성을 억제하고, 이에 관련된 인자들의 발현을 억제함으로써 잠재적으로 미백효과에 효과적일 수 있음을 시사한다.

Abstract

Purpose

This study aimed to investigate and compare effects of bioactive constituents in ethanol extracts of Platycodon grandiflorum (PG) using a three-step steaming process.

Methods

The cell viability of PG and steamed PG extracts in α-MSH-induced B16F10 melanoma cells was investigated. Melanin content was determined, and western blotting was performed to examine the whitening effect of the steamed PG extracts.

Results

Treatment of α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH)-induced B16F10 melanoma cells with steamed PG (25–200 μg/mL) did not affect the cell viability. The steamed PG extracts effectively protected melanin formation. Furthermore, the steamed PG extract inhibited well-known melanin generation-related factors, such as tyrosinase and tyrosinase-related protein-1 (TRP-1) and TRP-2.

Conclusion

The steamed PG extracts are potentially effective in suppressing melanin generation and related factors in α-MSH-induced B16F10 cells.

中文摘要

目的

本研究旨在通过三步蒸汽过程研究和比较生物活性成分在桔梗(Platycodon grandiflorum ,PG)乙醇提取物中的作用。

方法

研究了在α-melanocyte-stimulating hormone(α-MSH)诱导的B16F10黑色素瘤细胞 中,PG和蒸汽PG提取物的细胞活力,测定黑色素含量,并利用蛋白质印迹法来检查蒸制的PG提取物的增白效果。

结果

用蒸汽PG(25-200 μg/ mL)处理α-MSH诱导的B16F10黑色素瘤细胞时,显示不影响细胞活力。蒸汽PG提取物有效地保护了黑色素的形成。此外,蒸汽PG提取物抑制了众所周知的黑色素生成相关因子,如酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白1和2。

结论

蒸汽PG提取物可能有效抑制α-MSH诱导的B16F10黑素瘤细胞的黑素生成和相关因子的表达,从而具有潜在的美白功效。

Introduction

도라지(Platycodon grandiflorum )는 초롱꽃과에 속하는 여러해살이풀로 한국, 일본 및 중국에 분포하며 산과 들에서 자생한다. 도라지의 뿌리는 전통약재로 예전부터 거담, 진해, 배농, 해열, 진통, 기관지염, 천식 등에 이용되어 왔으며, 현재는 항염증, 항암, 항균, 항산화, 면역력 증진 등의 다양한 기능성 연구가 진행되고 있다(Lee et al ., 2000; Lee et al ., 2013a). 도라지 뿌리는 triterpenoid계 saponin인 platycodin A, C 및 D 등 함유하고 있으며(Hwang et al ., 2011), 특히, 도라지에서 분리한 platycodin D는 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)인자를 억제하여 멜라닌 생성을 억제, 항고혈압, 항암 등의 기능성이 보고되었다(Jung et al ., 2011; Lin et al ., 2018). 도라지의 건조방법, 저장방법 및 다양한 가공방법을 이용하여 사포닌의 함량의 변화에 대한 연구도 보고 되었다(Lee et al ., 2014a; Lee et al ., 2014b; Kim et al ., 2015). 흑도라지는 품질평가 연구를 통하여 항산화 활성 및 항균 활성에 대한 연구가 진행되었지만(Lee et al ., 2013b), 증숙 횟수에 따른 흑도라지의 미백 효과에 대한 연구가 밝혀진 바가 없다.
피부의 표피는 가장 바깥쪽에 존재하는 층으로 외부의 다양한 자극으로부터 노출되기 쉽다. 피부의 노화는 나이를 먹을수록 피부의 구조가 자연적으로 변하는 내인성 노화와 자외선 노출에 의한 외인성 피부노화인 광노화가 함께 진행된다(Park et al ., 2008). 최근 자외선의 농도가 높아 지면서 자외선에 노출이 되면 화상, 염증, 면역반응의 억제, 그리고 피부결합조직의 손상을 일으킬 수 있고, 지속적인 자외선 노출은 피부의 구조를 파괴하고 궁극적으로 광노화 및 피부암을 야기한다(Jung et al ., 2014). 멜라닌은 이러한 자외선을 일정량 이상 흡수하여 자외선이 인체 내로 침투하는 것을 차단하여 보호하는 역할을 한다(Park, 2015). 멜라닌의 합성은 멜라닌 세포의 세포질내의 멜라노좀(melanosome)에서 합성되며 자외선, 사이토카인(cytokine), 성장인자(growth factor) 및 호르몬 등에 의해 조절되고 세포내의 다양한 기전을 통해 이루어진다(Jeon et al ., 2016). 하지만 비정상적인 멜라닌 생성은 피부에 흑색종 및 색소침착을 일으켜 심할 경우 피부암의 원인이 되기도 한다(Jin et al ., 2005). Tyrosinase는 아미노산의 일종인 L-tyrosine이 L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)로 수산화 되고 L-DOPA가 dopaquinone으로 산화되는데 촉매작용을 하고 최종적으로 melanin polymer 중합체를 생성하는데 중요한 역할을 하는 효소이다(Oh et al ., 2017). 또한 TRP-1 및 TRP-2는 멜라닌 생성 과정에서 tyrosinase와 함께 멜라닌 생합성 과정에서 많은 관여를 하는 중요한 인자다(Jang & Park, 2017). 현재 화장품 분야에서 사용되는 미백제는 tyrosinase의 활성을 억제하는arbutin, kojic acid 등이 있고 melanin 합성을 억제하는 L-ascorbic acid, glutathione 등이 있다. 그러나 이러한 물질들은 분해되거나 안정성 문제 등이 있어 첨가제로써 제한된 양만 사용하므로, 천연소재를 이용한 미백소재 개발이 필요하다(Seo et al ., 2010).
따라서, 우리는 증숙 횟수에 따른 도라지의 미백 효과에 대한 연구가 밝혀진 바가 없기 때문에 천연소재인 도라지의 증숙 횟수에 따른 미백효능을 비교 및 검정하고 기능성화장품 소재로서의 활용 가능성을 확인하고자 한다.

Methods

1. 추출물 준비

본 연구에서 사용된 도라지는 한국생약협회에서 2016년 이천에서 수집한 것을 구입하여 사용하였다. 생도라지(none steamed-PG, NS-PG)와 증숙 도라지(steamed-PG, oncesteamed PG (1S-PG), twice-steamed PG (2S-PG), thrice-steamed PG (3S-PG))는 각 시료 5 kg을 0, 30% 및 70% 에탄올(시료/용매 비율, 1:10)로 실온에서 1일 동안 추출하였다. S-PGs는 도라지를 증기선에서 90-95℃에서 4 h 동안 찌고 1일 동안 30℃의 건조 오븐에서 건조시킨 다음 1-3번 반복하여 제조하였다. 실온에서 NS-PG와 S-PG를 물, 30%와 70% 에탄올(시료/용매 비율, 1:10)로 24 h 교반 추출 하였다(Kim et al ., 2013). 샘플 추출 후, 추출물을 여과하고, 진공 증발시켰다(Lee et al ., 2018). 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, USA)에 용해되었다.

2. 세포배양

멜라노마(B16F10)세포는 american type culture collection (ATCC, USA)에서 구입하였다. B16F10 세포의 생육배지로 1% penicilin/streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)가 포함된 Dulbecco's modified eagles medium (DMEM; Gibco, Canada)을 사용하였고 37℃, 5% CO2조건하에서 배양하였다.

3. 세포 생존율

B16F10 세포를 96-well plate에 1×104 cell/well로 분주하여 24 h 배양한 후 도라지 추출물(PGs)을 25-200 μg/mL 농도로 처리하고 1 h 후 멜라닌생성호르몬(α-melanocytestimulating hormone, α-MSH; Sigma-Aldrich)을 200 nM 농도로 처리하였다. 48 h 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium (MTS; Promega, USA) assay를 수행하여 multi plate reader (Biotek, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4. Melanin contents

멜라닌 함량 측정은 Hosoi 방법(Hosoi et al ., 1985)을 변형하여 사용하였다. B16F10 세포를 6-well plate에 1.0×105 cell/well로 분주하여, 24 h 배양한 후 PGs를 200 μg/mL 농도로 처리하고 1 h 후 α-MSH을 200 nM 농도로 처리하였다. 48 h 후 Dulbecco`s phosphate-buffered saline (DPBS; Gibco)로 세포를 회수하여 1N sodium hydroxide (NaOH)로 90℃에서 1 h 동안 가열하여 세포를 용해하였다. Multi plate reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. Western blot analysis

B16F10 세포를 6-well plate에 1.0×105 cell/well로 분주하여, 24 h 배양한 후 PGs를 200 μg/mL로 처리하고 1 h 후 α-MSH 200 nM 농도로 각각 처리하였다. 시료 처리 48 h 후 PBS로 두 번 세척한 후, radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (Cell Signaling Technology, USA)로 용해한 후 얼음에서 30 min 반응시켰다. 세포 용해용매를 4℃, 13,000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고, 상층액을 bradford 시약(Bio-Rad, USA)을 이용하여 단백질 정량을 하였다. 세포용해용매를 5X laemmli buffer (iNtRON, Korea)와 혼합하여 95℃에서 5 min 가열 후 각 20 μg 단백질량에 해당하는 시료를 10% SDS-PAGE에서 전기영동 하여 분리하였다. 전기영동 된 단백질은 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF; Millipore, Germany) 막에 옮겨 상온에서 30 min동안 blocking (5% skim milk in TBST) 하였다. 1차 항체(tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2; Cell signaling, Santa-Cruz, USA)를 1:1,000으로 희석하여 4% 에서 overnight 처리하였다. 이후 TBST로 10 min씩 3회 세척하고, 2차 항체(cell signaling technology) 1:2,000으로 희석하여 1 h 동안 반응시켰다. 이후 10 min 간격으로 TBST로 3회 세척하고 enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection kit (Bio-Rad)로 반응하였다. 단백질 발현은 chemiluminescence imaging systems (CAS-400MF; Davinch-K, Korea)로 확인하였다.

6. 통계학적 분석

모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표기하였다. One-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시하였고, Tukey Multiple Comparison test로 사후검증을 실시하였다. p <0.05 일 때, 통계적으로 유의하다고 분석하였다.

Results and Discussion

1. PGs의 세포독성

PGs에 의한 B16F10 세포에 독성을 확인하기 위하여 B16F10 세포에 추출물을 각각 25, 50, 100 및 200 μg/mL의 농도로 처리한 후 MTS assay를 실시하였다. 본 실험결과, NS-PG는 95-108%, 1S-PG는 95-112%, 2S-PG는 93-106% 그리고 3S-PG는 96-104%의 세포 생존율로 확인되었다(Figure 1). 모든 PGs 추출물은 200 μg/mL에서도 세포의 독성이 없는 것이 확인되었으며, 이러한 결과를 바탕으로 세포생존율에 영향을 주지 않는 농도인 200 μg/mL를 최종 농도로 사용하여 이후 연구를 진행하였다.

2. PGs의 멜라닌 생성 저해 효과

B16F10 세포에서 PGs의 미백 효과를 확인하기 위해 세포 내에서 생성되는 멜라닌 생합성 억제능을 확인하였다(Figure 2). 멜라닌의 생성을 촉진하기 위해 α-MSH 200 nM을 처리하였을 때, α-MSH 무처리군(27.2%)에 비해 처리군(100%)에서 멜라닌 양이 유의성 있게 증가하였으며, NS-PG 물 추출물, 30%, 70% 에탄올 추출물 순서로 각각 103.2%, 98.4%, 77.1%, 1SPG 105.0%, 106.0%, 77.5%, 2S-PG 87.1% 98.2%, 80.8% 그리고 3S-PG 92.9%, 100.5%, 53.4%의 발현양을 확인하였다. 특히, 3S-PG 70% 에탄올 추출물에서 46.6%의 가장 높은 멜라닌 생성 억제를 하였다. NS-PG에 비해 증숙 횟수가 늘어날수록 멜라닌 저해 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있고 물 추출물에 비해 70% 에탄올 추출물에서 멜라닌 생성을 더 효과적으로 억제하였다. 3S-PG의 70% 에탄올 추출물이 양성대조군인 kojic acid 100 μg/mL (21.1%)에 비해 높은 저해 활성을 보였다(Ahn & Min, 2014). 3S-PG 70% 에탄올 추출물은 흑색종 및 색소침착을 일으키는 멜라닌 합성을 억제하는데 효과적인 것으로 판단된다.

3. B16F10 cells에서 PGs의 멜라닌 관련 단백질 발현 억제 효과

멜라닌의 생성은 멜라노좀에서 형성되는 과정과 멜라닌 생성에 관련된 효소의 발현에 의해서도 조절되며(Choe & Choe, 2014), 멜라닌 생성 초기반응에서 작용하는 효소는 tyrosinase로 L-tyrosine을 L-DOPA로 하이드록실화 하고 L-DOPA는 TRP-1, TRP-2 등의 효소가 관여하여 최종적으로 멜라닌이 합성된다(Yoon et al ., 2013). 따라서 본 연구에서는 PGs 처리시 멜라닌 생합성 과정에서 중요한 역할을 하는 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 발현양의 변화를 확인하기 위해 western blot을 통해 단백질 발현양을 확인하였다(Figure 3). 200 μg/mL의 농도에서 PGs 처리시 멜라닌 생성에 필수적인 인자인 tyrosinase의 발현은 NS-PG, 1S-PG 그리고 2S-PG 추출물은 억제활성이 없는 것으로 보였다. NS-PG 추출물은 에탄올 농도가 증가하여도 오히려 발현양이 증가하였다. 2S-PG의 추출물은 에탄올 농도가 증가할수록 tyrosinase의 발현이 줄어드는 경향을 보이긴 하였으나 70% 에탄올 추출물에서 발현양이 약 113%로 억제활성이 없는 것으로 나타났다. 3S-PG의 30%와 70% 에탄올 추출물에서는 tyrosinase의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 특히 3S-PG 70% 에탄올 추출물에서 14.9%의 억제활성을 보였다. DHICA oxidase로 작용하는 멜라닌 합성 관여 인자인 TRP-1은 NS-PG 와 1S-PG 추출물에서는 억제 활성이 없는 것으로 보였다. 2S-PG는 30%와 70% 에탄올 추출물이 각각 18.4%와 33.0% 의 억제 활성을 나타났다. 특히, 3S-PG의 30% 와 70% 에탄올 추출물에서 66.7%와 65.1%로 가장 높은 억제 활성을 보였다. Dopachrome tautomerase로 작용하는 TRP-2는 NS-PG에서 물 추출물, 30% 에탄올 추출물 순으로 각각 11.9%, 9.7%의 억제활성을 보였지만 에탄올 농도가 증가할수록 발현양이 오히려 증가하였다. 1S-PG 에탄올 추출물에서는 발현양이 줄어들었으나 효과는 미미하였다. 2SPG물 추출물에서는 발현양이 증가하였지만 30% 에탄올 추출물과 70% 에탄올 추출물에서 각각 2.2%, 26%의 억제활성을 보였으며, 특히 3S-PG 추출물은 각각 35.9%, 43.0%, 46.5%로 가장 높은 억제활성을 보였다. 2S-PG과 3S-PG 추출물에서는 에탄올의 농도가 증가할수록 효과적으로 발현양이 줄어들었다. TRP-2는 TRP-1과 유사하게 30%와 70% 에탄올 추출물에서 46.5%의 가장 높은 억제 활성을 보였다. 멜라닌 합성 단백질의 발현 활성의 결과를 정리하면, 3S-PG의 에탄올 추출물이 tyrosinase, TRP-1, TRP-2를 가장 높게 억제하는 것을 알 수 있었다. 이는 생도라지에 비해 증숙 도라지의 활성이 좋은 이유는 열처리를 하게 되면 다양한 화학적 변화가 일어나 생리활성 물질이 증가한다는 연구결과(Song et al ., 2018)와 증숙에 의하여 추출 효율이 증가하여 조사포닌 함량이 증가한다는 연구결과에 의해 유추할 수 있다(Lee et al ., 2013b). 또한 70% 에탄올 추출물의 활성이 좋은 이유는 에탄올의 농도가 증가할수록 조사포닌의 추출 수율 또한 증가했기 때문이라고 판단된다(Sung & Yang, 1985). 이에 따라 도라지를 증숙 할수록 증가된 사포닌 함량에 의해 미백 효과를 포함한 다양한 생리활성 효과가 증가한 것으로 생각된다(Jung et al., 2011).

Conclusion

본 연구에서는 생도라지와 증숙 횟수에 따른 도라지 추출물의 미백활성을 비교하기 위하여 B16F10 cells에서의 세포독성평가, 멜라닌 생성 저해 효과 및 멜라닌 생성 관련 인자의 발현을 확인하였다. PGs는 200 μg/mL까지 세포독성을 나타내지 않았으며, 멜라닌 생성 저해능 측정결과, 3S-PG 70% 에탄올 추출물에서 멜라닌 생성을 약 46.6% 억제하여 미백제로 알려진 kojic acid 100 μg/mL (21.1%)에 비해 높은 저해 활성을 보였다. 또한 3S-PG 70% 에탄올 추출물 처리시 멜라닌 생성 관련 인자인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2를 각각 14.9%, 65.2%, 그리고 46.5%의 억제하였다.
결과를 종합하면 증숙 도라지 추출물은 멜라닌 형성을 억제할 뿐만 아니라 멜라닌 생성 관련 인자들의 발현 또한 조절하여 미백효과를 가지는 것으로 판단되며 이는 미백 기능성 화장품의 원료로써 이용 가능할 것이라고 예측된다.

Acknowledgements

본 논문은 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ01273003)의 지원에 의해 이루어진 것임을 밝힙니다.

Figure 1.

Cell viability of S-PG on α-MSH-treated B16F10 cells.

(A) NS-PG, (B) 1S-PG, (C) 2S-PG, and (D) 3S-PG. The B16F10 cells were incubated with cell viability was examined using MTS assay. Result are means±SD of three independent experiments. Significance was determined using ANOVA. S-PG, steamed Platycodon grandiflorum; NSPG, non-steamed PG; 1S-PG, once-steamed PG; 2S-PG, twice-steamed PG; 3S-PG, thrice-steamed PG; α-MSH, α-melanocyte-stimulating hormone; ANOVA, analysis of variance; SD, standard deviation.
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Figure 2.

Inhibitory effect of S-PG on melanin synthesis on α-MSH-treated B16F10 cells.

(A ) NS-PG, (B) 1S-PG, (C) 2S-PG, and (D) 3S-PG. The B16F10 cells were incubated with α-MSH (200 nM) and PG extracts (200 μg/mL) for 48 h. Result are means±SD of three independent experiments. Significance was determined using ANOVA. * p<0.05, ***p<0.001 vs. α-MSH-treated control; ###p<0.001 vs. non-treated control; S-PG, steamed Platycodon grandiflorum; NS-PG, non-steamed PG; 1S-PG, once-steamed PG; 2S-PG, twice-steamed PG; α-MSH, α-melanocyte-stimulating hormone; 3S-PG, thrice-steamed PG; ANOVA, analysis of variance; SD, standard deviation.
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Figure 3.

Inhibitory effect of S-PG on the protein expression related melanin synthesis on α-MSH-treated B16F10 cells.

(A) Western blot tests denoting the related protein expression levels of tyrosinase, TRP-1, and TRP-2. (B-D) The graphs of the respective densitometric quantification of protein expression have been normalized against β-actin. The B16F10 cells were incubated with α-MSH (200 nM) and PG extracts (200 μg/mL) for 48 h. The cells were lysed with RIPA buffer. All the extract concentrations were 200 μg/mL. Results are given as mean±SD of three independent experiments. The significance was determined using ANOVA; * p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 vs. α-MSH-treated control; ###p<0.001 vs. non-treated control; S-PG, steamed Platycodon grandiflorum; NS-PG, non-steamed PG; 1S-PG, once-steamed PG; 2S-PG, twice-steamed PG; 3S-PG, thrice-steamed PG; TRP-1, tyrosinase-related protein-1; TRP-2, tyrosinaserelated protein-2; α-MSH, α-melanocyte-stimulating hormone; ANOVA, analysis of variance; SD, standard deviation.
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