Introduction
피부의 진피층은 섬유성 단백질인 교원섬유(collagen fibers)와 탄력섬유(elastic fibers)가 존재하여 피부의 탄력과 장력을 조절하게 된다. 진피층의 이런 섬유성 단백질은 진피섬유아세포에 의해 만들어지고 다양한 세포간 물질들과 함께 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 구조를 형성한다(Yoon et al., 2013; Lee et al., 2008; Alberts et al., 2008). 진피층에는 타입 I 콜라겐(type I collagen)과 타입 III 콜라겐 type III collagen)이 각각 80-85%, 15-20%의 비율로 존재한다.
피부 노화는 진피섬유아세포의 작용이 특정 요인에 의해 이상이 생기는 것으로 크게 나이가 들어가면서 피부 세포의 활성이 저해되어 생기는 내인성 노화와 자외선, 공해 등 외부 환경 요인에 의해서 발생하는 외인적 노화로 나누어진다. 진피섬유아세포의 기능 이상은 collagen의 생성 저해와 collagen 분해 효소인 matrixmetalloproteases (MMPs)의 활성 증가로 이어지게 된다. 내인적 노화는 나이가 들어가면서 발생되는 자연스러운 노화 현상으로 체내 활성 산소 생성량이 증가하면서 피부세포들의 기능이 저하되어 발생한다. 외인적 노화는 흡연, 과음, 자외선 등에 의한 외부요인에 의하여 발생되는 것으로 피부세포들의 기능저하 현상이 발생하게 된다(Yoon et al., 2013). 이러한 피부노화가 진행되면 진피섬유아세포의 콜라겐 합성 저해로 인해 세포외기질 부족현상이 발생하여 진피망상층의 구조 변형이 일어나게 된다. 콜라겐과 엘라스틴 섬유 주변을 교차하여 진피층의 구조를 지탱하는 glycosaminoglycans (GAGs)은 주로 히알루론산과 무코다당류들로 이루어져 있다. 노화가 진행됨에 따라 히알루론산이 감소하여 콜라겐과 엘라스틴의 해리가 일어나며 수분 결합이 감소하여 피부에 주름이 생기고 탄력이 줄어들게 된다. 이러한 구조 변형은 피부의 탄력 감소와 주름 생성을 초래하게 된다. 콜라겐은 신체 곳곳에 존재하는 대표적인 섬유상 단백질로서 14개의 type이 존재하며 (Uitto et al., 1989), 두 개의 α1 사슬과 한 개의 α2 사슬이 3중 나선 형태로 꼬여서 생성되며 이 사슬들은 각각 COL1A1, COL1A2 유전자로부터 발현된다(Paul, 2011). 진피섬유아세포에서 발현된 프로알파1 (pro-alpha 1)과 프로알파2 (pro-alpha 2) 사슬(chain)은 삼중나선(triple helix) 구조를 이루면서 콜라겐의 전구체인 프로콜라겐(procollagen)으로 만들어서 세포 밖으로 분비되고, 다른 프로콜라겐과 결합하여 완전한 형태의 타입 I 콜라겐을 생성한다(Kim & Yoon, 2013; Lee et al., 2008; Alberts et al., 2008). 타입 I 콜라겐의 생성은 정상적인 피부조직 내에서 균형을 이루고 있어 피부 탄력이 조절되지만, 내•외부적인 요인에 의해 균형이 무너지게 되면 진피층 내 콜라겐의 양이 감소하면서 탄력이 감소하고 주름이 생성되는 노화현상이 발생한다.
히알루론산 합성을 촉진하는 효소(hyaluronic acid synthase, HAS) 중 HAS2가 히알루론산 합성에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 히알루론산은 물 분자의 결합과 유지에 관여하여 수분을 함유할 수 있는 특징을 지니고 있다. 즉, 자신의 건조 무게보다 약 1000배의 수분과 결합하여 피부장벽 기능의 조절과 세포외기질을 수화시키고, 조직 내 수분의 항상성을 유지시키는 역할을 수행한다. 특히 피부는 체내 히알루론산의 50% 이상을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 특히 표피의 세포 간 간격과 진피의 세포외기질에 분포되었다고 한다. 이들은 수분 균형유지, 세포간 간격유지, 세포 성장 인자 및 영양성분의 저장과 확산에 관여하고, 삼투압과 이온의 흐름 등 피부 구조의 안정화에 관여할 뿐만 아니라, 상처의 회복에도 관여하고 있다(Song et al., 2013). 히알루론산의 양은 노화와 함께 감소하는데, 이는 피부의 주름 발생, 탄력감소 및 수분 함유량 감소의 원인 중 하나이다(Song et al., 2013).
이러한 피부노화 현상을 방지하기 위해서 피부 진피층에 존재하는 진피섬유아세포의 기능을 활성화시켜 콜라겐 및 히알루론산 합성효소 생산을 촉진시킴으로써 진피 망상층의 구조를 회복시킬 수 있는 성분 개발이 필요하다. 진피섬유아세포에서 히알루론산 합성효소(HAS2)의 양을 증가시킴으로써 히알루론산의 합성을 촉진하는 연구(Kage et al., 2013; Honda et al., 2020), 진피섬유아세포의 collagen의 생성과 collagen 분해 효소인 matrix-metalloproteases, MMPs)에 대한 연구 결과들이 보고된 바 있으며, 피부의 주름 개선을 위해 다양한 관리법과 효능 물질에 대한 연구가 진행되고 있다(Kim & Yoon, 2013; Kim et al., 2013; Lee, 2012; Suk & Lee, 2010; Lim et al., 2009).
선행연구에 의하면 피부활성물질로 잘 알려져 있는 ascorbic acid (비타민 C)는 강력한 항산화제(Cha et al., 2022)로 콜라겐(Gref et al., 2020; DePhillipo et al., 2018) 및 히알루론산(Schachtschabel & Binninger, 1993) 합성 촉진효능으로 인한 피부 항노화 및 주름 개선 효과(Crisan et al., 2015), 자외선 차단, 상처치유 등 효능을 갖고 있다(Park et al., 2008). 하지만 ascorbic acid는 수분, 공기, 열, 빛에 불안정하여 쉽게 산화된다는 단점이 있다(Yoon, 2013; Park et al., 2008). 이 문제를 해결하기 위해 다양한 비타민 유도체, 화장품 용기도 개발되었지만 비타민 C의 불안정성을 해결하면서 그 효능을 나타내기에는 부족한 점이 많았다(Park et al., 2008; Pinnell et al., 2001; Yoon, 2013).
한편 리포좀은 화장품산업에서 가장 많이 사용되는 기술로서(Kim et al., 2020), 활성 성분을 효율적으로 피부에 침투 시킬 수 있는 전달체로 세포막 또는 각질층의 세포 간 지질과 구조적으로 유사한 지질 이중층으로 구성되어 있어 세포막과 융합하여 리포좀 내부의 활성 성분을 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있다(Han et al., 2014). 최근에는 음전하를 띤 리포좀에 캡슐화된 ascorbic acid의 피부 투과, 유지 및 섬유아세포에 의한 콜라겐 합성 증가에 대한 연구(Maione-Silva et al., 2019)가 보고되었지만, 관련 연구는 매우 미흡하다.
따라서 본 연구는 당아욱꽃추출물, 하이드로제네이티드레시틴, 락토코쿠스발효용해물, 콜라겐추출물 및 ascorbic acid 성분을 독자적인 특허기술로 리포좀 형태로 제조한 화장품인 '네오젠 브이 바이옴리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOMETM)'을 시험제품으로 인간진피섬유아세포에 적용하여 콜라겐 생성 및 히알루론산 합성효소생성에 대한 세포효능을 평가하여 주름개선 기능성화장품으로의 사용여부를 확인하고자 한다.
Methods
1. 세포주 선택 및 세포 배양
본 시험에 사용된 세포주는 인간진피섬유아세포인 Normal Human Dermal Fibroblasts (HDFs)를 CELLnTEC (Switzer-land)에서 구매하여 사용하였다. HDFs 세포는 Fibroblast Basal Medium (Lonza, USA)에 FGMTM-2 single QuotsTM (Lonza)을 첨가한 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 세포배양기 내에서 배양하였다.
2. 시약 및 재료
본 시험에 사용된 시료인 '네오젠 브이 바이옴 리포좀TM (NEOGEN V.BIOME LIPOSOMETM)'은 ㈜아우딘퓨쳐스에 의해 액상 형태로 제공되었으며, 해당 물질은 PBS로 희석하여 사용하였다. 네오젠 브이바이옴 리포좀TM (NEOGEN V.BIOME LIPOSOMETM)은 ascorbic acid 유효성분을 함유하는 리포좀 제형 기술을 활용하여 제조하였으며, 전성분은 글리세린, 카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드, 당아욱꽃추출물, 하이드로제네이티드레시틴, 락토코쿠스발효용해물, 아스코빅애씨드, 콜라겐추출물로 구성되었다. 양성대조군은 transforming growth factor-beta (TGF-β; Sigma-Aldrich, USA) 와 retinoic acid (Sigma-Aldrich)를 사용하였다.
3. 세포독성실험
HDFs 세포를 96-well plate에 4×103 cells/well로 분주하고 24시간 배양 후, 시험 용액을 적정 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 WST-1 assay solution (DOGEN, Korea)을 배지 양의 10%씩 첨가하여 추가적으로 1시간 37℃에서 반응시킨 뒤, microplate reader system (Molecular Devices, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Reference 흡광도는 650 nm에서 측정하여 결과값을 보정하였다.
4. qRT-PCR를 이용한 유전자 발현 분석
HDFs 세포 내 유전자의 발현 변화를 측정하고자 qRT-PCR 분석법을 이용하였다. HDF 세포를 6-well culture plate에 3×105 cells/well 로 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 일정농도의 시험용액을 처리하여 24시간 동안 추가배양하였다. 배양된 세포를 수확한 후, 1 mL TRIzolreagent (Invitrogen, USA)을 첨가하여 세포 용해 및 total mRNA 추출을 수행하였다. Total mRNA의 농도 및 순도는 MaestroNano® Micro-Volume Spectrophotometer (Maestrogen, USA)를 이용하여 측정하였으며, M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, USA)으로 cDNA를 합성한 후, qRT-PCR에 사용하였다. qRT-PCR은 SYBRTM Green Master Mix (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였으며, StepOnePlusTM Systems software (Applied Biosystems)를 이용하여 해당 유전자의 발현을 분석하였다. PCR반응 조건은 94℃에서 12 min간 denaturation 시킨 후 denaturation (94℃, 20 s), annealing (60℃, 30 s), polymerization (72℃, 30 s) 과정을 40 cycle 동안 진행하였다. 유전자 발현량은 threshold cycle (Cт) 값을 이용하여 2-ΔΔCt 방법으로 분석하였으며, 실험에 사용된 primer 정보는 Table 1과 같다.
Results and Discussion
1.시험 물질의 검액 농도 설정
시험 물질인 '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOMETM)'의 검액 농도를 설정하고자 WST-1 assay를 이용하여 세포독성평가를 실시하였다. HDF 세포에 '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'을 0에서 0.5% 농도로 24시간 처리한 후, WST-1 assay를 실시하여 나타나는 세포생존율을 확인한 결과는 Figure 1과 같다. 시험물질 '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'을 0.25% 이하(0.025, 0.05, 0.1, 0.25%) 농도로 처리하였을 시, 세포생존율은 음성대조군 대비 각각 100.34%, 98.56%, 97.99%, 91.81%로 나타나 세포생존율이 감소하지 않았으므로(p>0.05), 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 그러나 시험 물질 처리 농도 0.5%에서의 세포생존율은 음성 대조군 대비 유의적으로 감소 하였으므로(p<0.05) 세포 독성이 있음을 확인하였다. 따라서, 이후 효력시험에서는 0.25% 이하 농도의 ' 네오젠 브이 바이옴 리포좀TM (NEOGEN V.BIOME LIPOSOMETM)'을 검액 농도로 설정하였다.
2. ' 네오젠 브이 바이옴 리포좀 ™ (NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'의 콜라겐 발현량 평가
피부 내 콜라겐의 감소는 피부 노화 현상과 밀접한 관련이 있으며, 콜라겐은 주로 진피섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 '네오젠 브이 바이옴 리포좀TM (NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'이 HDF 세포 내 콜라겐 생성에 미치는 영향을 확인하고자 qRT-PCR 법을 이용하였다. 시험결과의 신뢰도 향상을 위하여 TGF-β를 양성대조물질로 사용하였다.
네오젠 브이 바이옴 리포좀TM (NEOGEN V.BIOM LIPOSOMETM)'을 0.05%, 0.1%, 0.25% 농도로 처리하여 24 h 동안 배양한 후, qRT-PCR법을 통해 COL1A1 mRNA의 발현량을 측정 하였다. Figure 2와 같이, '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'은 COL1A1 mRNA 발현이 증가됨을 확인 하였다. 특히, 0.25% 농도에서는 COL1A1 mRNA 발현이 음성대조 군과 비교하여 37.05±4.03% 증가됨을 확인하였다(p<0.05).양성대 조군으로 사용한 TGF-β (5 ng/mL)는 COL1A1 mRNA 발현이 음성 대조군 대비 55.88±4.76% 증가되었다(p<0.05).
3. ' 네오젠 브이 바이옴 리포좀 ™ (NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'의 히알루론산 합성효소 발현량 측정
히알루론산의 감소는 피부의 탄력 감소 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나로 알려져 있다. 히알루론산은 히알루론산 합성 효소(hylauronan synthase)에 의해 합성되며, 주로 각질형성세포와 진피섬유아세포에 의해 생성된다. 본 연구에서는 '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'이 HDF 세포 내 히알루론산 합성효소 생성에 미치는 영향을 확인하고자 qRT-PCR법을 이용하였다. 시험결과의 신뢰도 향상을 위하여 retinoic acid를 양성대조물질로 사용하였다.
' 네오젠 브이 바이옴 리포좀TM (NEOGEN V.BIOME LIPOSOMETM)'을 0.05%, 0.1%, 0.25% 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양한 후, qRT-PCR법을 통해 HAS2 mRNA의 발현량을 측정하였다. Figure 3과 같이, '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOMETM)'은 HAS2 mRNA 발현이 증가되었으며, 0.25% 농도에서는 음성대조군과 비교하여 275.60±10.96% 증가됨을 확인하였다(p<0.05). 양성대조군으로 사용한 retinoic acid (50 nM)는 HAS2 mRNA 발현이 음성대조군 대비 123.72±4.22% 증가되었다(p<0.05). 특히, '네오젠 브이 바이옴 리포좀TM (NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'의 0.1%, 0.25% 농도에서 양성대조군인 retinoic acid (50 nM) 보다 더 높은 HAS2 mRNA 발현량 증가를 나타내었다.
Conclusion
본 논문에서는 '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'이 HDFs 세포에서 콜라겐 유전자 및 히알루론산 합성효소 유전자 발현량을 측정함으로써 피부 주름개선 효과에 미치는 영향을 연구하였다.
피부 세포인 HDF 세포를 대상으로 독성 평가를 진행한 결과, '네오젠 브이 바이옴 리포좀TM (NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)' 은 0.25% 이하 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'에 의한 콜라겐 및 히알루론산 합성효소 유전자 발현 변화를 확인한 결과, COL1A1 mRNA 및 HAS2 mRNA 발현량이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히, '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'은 양성대조군인 retinoic acid (50 nM) 보다 더 높은 HAS2 mRNA 발현량 증가를 나타내었다. 따라서, 본 연구 결과를 통해 '네오젠 브이 바이옴 리포좀™(NEOGEN V.BIOME LIPOSOME™)'은 콜라겐 및 히알루론산 합성효소 생성 증가를 촉진시키는 피부 주름개선 소재로써 화장품에 활용될 수 있다고 사료된다.
PDF Links
PubReader
ePub Link
Full text via DOI
Download Citation 
E-Mail 
Print 
