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Asian J Beauty Cosmetol > Volume 18(3); 2020 > Article
이너뷰티 소재로서의 가능성을 알아보기 위한 베리류의 생리활성 평가

요약

목적

본 연구에서는 국내에서 다소비 되고 있는 아로니아, 블루베리, 복분자, 블랙베리, 오디 및 체리 등 6종 베리류의 이너뷰티 소재로서의 활용 가능성을 평가하고자 하였다.

방법

6종 베리류를 동결건조 후 일반성분, 비타민 C 및 베타카로틴 함량을 측정하였으며, 항산화 관련 생리활성(총 폴리페놀 함량, DPPH radical 소거능), 안전성 및 항염증 효능(MTT assay, NO 생성량)을 측정하였다. 또한 베리의 생리활성 물질과 생리활성 간의 상관관계를 분석하였으며 베리 혼합물을 제조하여 각각의 생리활성을 비교분석 하였다.

결과

비타민 C, 베타카로틴, total polyphenol 함량은 각각 오디, 아로니아, 복분자가 가장 높게 나타났다. DPPH radical 소거능은 복분자, 아로니아 순으로 높았으며, NO 생성 억제 효과는 아로니아, 블루베리, 복분자 순으로 높게 나타났다. 6종 베리류의 생리활성 물질과 생리활성 간의 상관관계를 분석한 결과 total polyphenol이 생리활성(NO 생성 억제, 항산화 효능)과 높은 정의 상관성이 있음을 알 수 있었다.

결론

6종 베리류 중 항산화 활성과 항염증 효능이 우수한 복분자와 아로니아 혼합물에서 각각의 효능이 모두 상승되어 상호보완적 시너지 효과가 나타나 향후 inner beauty 소재로 개발 가능성을 확인하였다.

Abstract

Purpose

It has investigated the applicability of berries, which are significantly used in Korea, such as aronia (Aronia melanocarpa, AM), blueberry (Vaccinium corymbosum, VC), raspberry (Rubus coreanus Miquel, RCM), blackberry (Rubus fruticosus L, RFL), mulberry (Morus bombycis Koidz, MBK), and cherry (Prunus avium L, PA) as Inner Beauty Ingredients.

Methods

After freeze-drying of these six berries, we measured the contents of Vitamin C and β-Carotene. We also measured MTT assay, NO (nitric oxide) assay, total polyphenol assay, and 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate (DPPH) free radical-scavenging activities to evaluate safety and biological activity (anti-inflammatory and antioxidation) using freeze-dried hotwater extracts from the berries. Besides, we obtained the correlation between active ingredients from the berries and biological activities.

Results

It showed the highest results: mulberry for Vitamin C, aronia for β-carotene, and raspberry for total polyphenol assay, raspberry followed by aronia for DPPH free radical-scavenging activities; and aronia, blueberry, followed by raspberry for NO inhibitory effect. From these results, we confirmed that total polyphenol was highly associated with biological activities such as NO inhibition and antioxidant activity.

Conclusion

Berry compounds will bring a synergistic effect as a tea or mist type, and we anticipate seeing future studies about antibacterial, whitening, and anti-wrinkle effects.

中文摘要

目的

研究了在韩国大量使用的6中浆果类例如浆果(Aronia melanocarpa ,AM),蓝莓(Vaccinium corymbosum ,VC),覆盆子(Rubus coreanus Miquel,RCM),黑莓(Rubus fruticosus L, RFL),桑(Morus bombycis Koidz,MBK)和樱桃(Prunus avium L,PA)等作为内在美容成分的适用性。

方法

将这六 种浆果冷冻干燥后,我们测量了维生素C和β-胡萝卜素的含量。我们还测量了MTT测定,NO测定,总多酚测定法 和DPPH清除自由基的活性,以评估安全性和生物活性。 此外,我们还获得了浆果中有效成分与生物活性之间的 相关性。

结果

维生素C,β-胡萝卜素和总多酚的含量分别在奥迪,浆果和覆盆子中最高。DPPH自由基清除活性 最高的顺序为覆盆子和蓝莓,而NO生成的抑制作用最高的顺序为浆果,蓝莓和覆盆子。从这些结果,证实总多酚 与诸如NO抑制和抗氧化剂活性的生物活性高度相关。

结论

在6种浆果中,具有出色的抗氧化活性和抗炎作用的 覆盆子和浆果的混合物均提高了功效,产生了互补的协同效应,从而证实了将来有可能发展成为内部美容原料。

Introduction

현대사회는 의학과 과학의 발달로 삶의 질 개선과 함께 100세 혹은 그 이상의 고령화 시대에 접어들면서 항노화에 대한 관심이 늘어나고 있다(Choi et al., 2017). 또한 현대인들은 영양섭취 불균형, 운동부족 및 스트레스로 인한 여러 만성질환에 시달리고 있으며, 외부환경에 의해 체내 대사과정 중 발생하는 활성산소는 만성질환, 암 등 다양한 질병의 원인이 된다(Jung et al., 2019).
최근에는 시대적 흐름에 맞추어 이너 뷰티 푸드(inner beauty food)는 기능성을 가진 식품을 통해 건강을 관리하는 식품으로 연구가 이루어지고 있다(Jung et al., 2019). Inner beauty는 인위적인 방법으로 피부 표면만을 일시적으로 좋게 만드는 것이 아닌, 식습관 및 생활습관을 통해 피부 노화를 예방 및 개선하는 방법으로 ‘먹는 화장품’이라고도 불린다(Lee et al., 2017). 건강과 아름다움을 유지하고자 외부로부터 영양을 공급받는 outer nutrition과 함께 inner nutrition의 중요성이 부각되면서 화장품과 식품의 중간형태의 이너뷰티, 미용기능식품(nutri-cosmetics, beauty foods)이라는 개념이 등장하였으며, 과일, 채소, 베리류 및 곡류의 생리활성 소재에 대한 관심이 높아지면서 이들의 항산화, 항염증 효능 등이 과학적으로 입증되고 있다(Kim, 2018).
그 가운데, 베리류에는 phenolic류, flavonoid류, anthocyanin과 같은 페놀 화합물이 풍부하게 함유되어 있으며, 그에 따라 다양한 생리활성 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Heinrich et al., 2011; Kang et al., 2015). 베리류 중 Vaccinum 속(cranberry, blueberry)과 Rubus 속(raspberry, blackberry)이 섭취량이 많으며, 그 중 복분자(Rubus coreanus), 블루베리(Vaccinium corymbosum), 오디(Morus alba L)의 소비가 증가되고 있다. 또한 체리(Prunus avium)는 국내에서 소비량이 비교적 높고, 아로니아(Aronia melanocarpa)는 다른 베리류에 비해 안토시아닌과 프로안토시아닌 함량이 매우 높아 최근 국내에서 관심을 받고 있다(Yang et al., 2015b; Park et al., 2016; Choi, 2019).
아로니아(Aronia melanocarpa; black chokeberry)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 다년생 낙엽관목의 열매로 블랙 쵸크베리(black chokeberry), 블랙 베리(black berry), 아로니아 베리(aronia berry) 등으로 불린다(Jang et al., 2018). 아로니아의 과육과 껍질에는 생리활성 기능 및 강력한 항산화 효능이 있는 페놀성 식물 화합물인 anthocyanin, proanthocyanidin, chlorogenic acid, neochlorogenic acid 등을 함유하고 있으며, cyanidin-3-0-arabinoside, cyanidin-3-0-galactoside가 다량 함유되어 있어 식품과 의약품으로도 널리 활용되고 있다(Shin & Choe, 2015).
블루베리(Vaccinium corymbosum; blueberry)는 진달래과(Ericaceae)에 속하는 관목의 열매로 전 세계적으로 약 400여 종이 있는 것으로 알려져 있다(Jeon et al., 2011; Park et al., 2014). 블루베리는 당, 유기산, 비타민이 풍부할 뿐만 아니라 페놀성 화합물질을 다량 함유하고 있어 항산화, 항염증, 항암 등의 다양한 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다(Giovanelli et al., 2013; Kwon et al., 2018).
블랙베리(Rubus fruticosus L; blackberry)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 관목의 열매로 나무딸기 중 한 종으로 분류된다(Lee et al., 2018). 블랙베리는 강한 항산화 활성이 있는데, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 불활성화 하여 제거함으로써 심혈관계 질환을 개선하는 효과가 있다고 보고된 바 있다(Ryu et al., 2016; Cho et al., 2005).
체리(Prunus avium L)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 벚나무속의 열매로 주로 과실이 포함하고 있는 맛을 기준으로 단 체리(sweet cherry)와 신 체리(sour cherry)로 구분된다(Gu, 2012). 체리는 다량의 페놀화합물과 안토시아닌을 함유하고 있어 항산화, 항염증 효과(Mulabagal et aI., 2009), 신경세포 보호 효과(Kim et al., 2005), 항균 활성(Ahn et al., 2009) 등이 보고되었다.
오디(Morus alba L; mulberry fruit)는 뽕나무과(Moraceae)에 속하는 뽕나무 열매로 국내에서 재배된 대표적인 베리류 과실 중 하나이다(Lee et al., 2015). 오디의 cyaniding-3-O-b-Dglucopyranoside(C3G) 성분이 마우스의 뇌경색을 억제하고, 기억력 향상에 도움을 주는 것으로 보고된 바 있다(Kang et al., 2006; Kaewkaen et al., 2012).
복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 복분자딸기의 과실로 국내에서 자생하는 대표적인 베리류 과실 중 하나이다(Kim et al., 2002). 복분자는 플라보노이드를 다량 함유하고 있어 간 기능 개선효과가 있는 것으로 보고되었다(Lee & Park, 2011; Ko & Hong, 2011).
이와 같이 베리류에 대한 연구는 주로 만성질환 저감화 소재로 연구가 활발히 진행되어 왔으나 (Samak et al., 2009; Hogan et al., 2010), 이너뷰티 소재화로 이용되기 위한 연구는 드문 현실이다.
따라서 본 연구에서는 베리류의 이너뷰티 소재로의 활용 가능성을 규명하고자 국내 다소비 6종 베리류의 생리활성(항산화, 항염증 효과)을 평가하고자 하였다.

Methods

1. 실험재료

본 연구에서는 아로니아, 블루베리, 블랙베리, 체리, 오디 및 복분자 등 6종의 베리류를 가락동 농수산물 시장(Seoul, Korea)에서 일괄 구입하여 시료로 사용하였다. 모든 시료는 흐르는 물에 세척한 후 -70℃ 냉동고(NIHON, freezer, Japan)에서 24 h 냉동시킨 후 120 h 동안 동결건조(Ilsin Biobase, Kyunggi-do, Korea)한 후 분말화 하여 냉동보관 하면서 시료로 사용하였다.

2. 이화학적 성분 분석

1) 일반성분

6종 베리류의 일반성분은 Horwitz & Latimer (2005)에 준하여 분석하였다. 수분은 105℃ 상압가열건조법, 조단백질은 semimicro kjeldhal법, 조지방은 majonnier법, 조회분은 550℃ 직접회화법으로 측정하였다. 탄수화물 함량은 시료의 무게를 100%로 하여 수분, 조단백질, 조지방, 조회분 총 함량(%)을 감한 것으로 산출하였다.

2) 비타민 C 및 베타카로틴 함량

비타민 C의 함량 분석은 시료 2 g에 동량의 10% metaphosphoric acid (Sigma-Aldrich, USA)를 가하여 10 min간 현탁 시킨 후 적당량의 5% metaphosphoric acid를 넣어 균질화 한 다음 시료를 100 mL mass flask에 옮기고 소량의 5% metaphosphoric acid 용액을 용기를 씻은 후 mass flask에 합하여 100 mL로 정용한 다음 4,000 rpm에서 10 min간 원심분리(Supra 22K, Hanil science Industrial, Korea)하여 상등액을 0.2 μm membrane filter (Pall Gelman Laboratory, AnnArbor, USA)로 여과하여 HPLC용 분석시료로 사용하였으며, Vitamin C 정량을 위한 표준물질은 L(+)-ascorbic acid (Samchun pure chemical Co. Ltd., Anyang, Korea)를 사용하였다. 피크의 높이와 면적을 표준 검량곡선(R2=0.998)에 대입하여 베리 시료 중의 함량(mg %)을 산출하였다. 베타카로틴 함량 분석은 Thomas et al. (2001)의 방법에 따라 알칼리 비누화법으로 추출한 후 HPLC로 분석하였다. 즉 시료와 60% KOH 용액 8 mL를 추출관에 넣어 잘 혼합한 후 추출관의 상부 공기를 질소로 치환시켰다. 치환 시킨 추출관을 75℃, 100 rpm으로 조절된 shaking water bath (HB-205SW, Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea)에서 1 h 동안 검화 처리한 후 찬물에 냉각하고 2% NaCl 용액 20 mL를 가하여 반응을 종결시켰다. 검화액에 추출용매(hexane:ethyl acetate=85:15, v/v, 0.01% butylated hydroxytoluene, BHT) 15 mL를 가한 다음 정치시켜 층을 분리했다. 층이 분리된 상층액을 KOH가 채워진 유리관에 통과시켜 수분을 제거하여 플라스크에 수집했다. 과정을 3회 반복하여 추출용액을 수집한 후 추출 용매를 이용하여 50 mL로 정용하였다. 추출액을 취한 후 질소 농축한 다음 잔류물을 CHCl3로 용해한 후 HPLC (Agilent, USA)를 이용하여 베타카로틴 함량을 측정하였다.

3. 항산화 활성 측정

1) 추출물 제조

6종 베리류의 항산화 활성 측정을 위한 시료는 동결 건조한 6종의 시료 무게 대비 각각 20 배 부피의 증류수를 첨가한 후 환류 냉각관을 부착한 80℃의 heating mantle (HM250C, Sercrim Lab Tech, Korea)에서 2 h 추출시킨 후 3회 여과(No. 2, Whatman, England)하여 분석용 시료로 사용하였다.

2) Total polyphenol 함량 측정

Total polyphenol 함량 측정은 Singleton & Rossi의 방법(Singleton & Rossi, 1965)을 변형하여 측정하였다. 전처리 시료 1 mL에 1N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL을 가하고 3 min 정치시킨 후 1 mL의 2% Na2CO3 용액을 가하고 이 혼합액을 1 h 동안 정치한 다음 분광광도계를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid를 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 환산하였다.

3) DPPH radical 소거능 측정

1,1-dipheny1-2-picrylhy drazyl (DPPH; Sigma-Aldrich, USA) 라디칼 소거능은 Blois의 방법(Blois, 1958)을 변형하여 시료 0.1 mL에 1.5×10-4 M DPPH 용액 0.1 mL를 가한 후 실온의 암실에서 30 min 반응 시켜 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4. 안전성 및 항염증 활성 평가

1) 시료 전처리

추출 시료를 원물 무게 기준 200 μg/mL, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL 농도로 DMEM을 이용하여 희석한 후 syringe filter(SM25P020SS; Hyundai Micro, Korea)로 여과 및 멸균 처리하여 분석용 시료로 사용하였다.

2) 세포배양

RAW 264.7 대식세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank: KCLB, Korea)에서 구입하여 사용하였다. DMEM (Gibco, USA)에 10% (v/v)의 FBS (Gibco, USA)와 penicillin (100 unit/mL)을 첨가하여 배지로 사용하였으며 37℃, 5% CO₂조건으로 humidified incubator (Thermo Fisher Scientific, USA)에서 배양하였다.

3) MTT assay

세포독성을 평가하기 위해 배양한 RAW 264.7 세포에 각 시료를 다양한 농도(200 μg/mL, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL)로 처리하고 37℃, 5% CO2조건으로 humidified incubator에 24 h 동안 배양하였다. 24 h 배양 후 상층액을 제거하고 1 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Invirtrogen, USA)를 각 well에 첨가한 뒤 4 h 동안 반응시켰다. 반응 후 MTT 용액을 제거하고 DMSO를 300 uL/well에 분주하여 formazan crystal을 용해시킨 뒤 ELISA에서 540 nm 흡광도로 측정하였고, 결과는 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율(%)로 표시하였다.

4) NO 생성량 측정

Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성을 측정하기 위해 RAW 264.7 세포를 5×104 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂조건으로 humidified incubator에 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 다양한 농도(200 μg/mL, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL)의 각 시료와 동량의 LPS를 1 μg/mL 농도로 처리한 뒤 37℃, 5% CO2 조건으로 humidified incubator에 24 h동안 배양하였다. 24 h 배양 후 배양액 100 uL와 동량의 greiss reagent를 96 well plate에 각각 첨가한 뒤 10 min 동안 반응시킨 후 ELISA에서 540 nm 흡광도로 측정하였다. 결과는 nitrite standard를 이용하여 세포배양액의 NO 농도를 구한 후 대조군에 대한 샘플 처리군의 NO 농도를 백분율(%)로 표시하였다.

5. 통계처리

모든 자료는 SPSS statistics 24 (SPSS Institute, USA)를 이용하여 평균과 표준편차를 구하였으며, 시료 간의 유의성은 ANOVA를 실시한 후, Duncan's multiple range test로 각 시료의 평균 차이에 대한 사후 검정을 5% 유의수준에서 실시하였다.

Results and Discussion

1. 6종 베리류의 이화학적 성분

1) 일반성분

아로니아(AM), 블루베리(VC), 블랙베리(RFL), 체리(PA), 오디(MBK) 및 복분자(RCM) 등 6종 베리류의 일반성분을 분석한 결과는 Table 1에 제시된 바와 같다.
아로니아(AM)의 수분은 5.17±0.15%, 탄수화물은 83.63±0.25%, 조단백질은 5.83±0.06%, 조지방은 2.40±0.00%, 조회분은 2.97±0.06%로 나타났다. 블루베리(VC)의 수분은 7.47±0.15%, 탄수화물은 86.96±1.00%, 조단백질은 3.37±0.06%, 조지방은 1.07±0.06%, 조회분은 1.13±0.06%로 나타났다. 블랙베리(RFL)의 수분은 8.50±0.20%, 탄수화물은 78.48±1.18%, 조단백질은 8.03±0.21%, 조지방은 2.43±0.15%, 조회분은 2.56±0.15%로 나타났다. 체리(PA)는 수분은 7.63±0.15%, 탄수화물은 83.80±1.45%, 조단백질은 4.30±0.17%, 조지방은 0.87±0.06%, 조회분은 3.40±0.10%로 나타났다. 오디(MBK)는 수분은 7.87±0.06%, 탄수화물은 70.33±0.12%, 조단백질은 10.43±0.12%, 조지방은 6.97±0.12%, 조회분은 4.40±0.30%로 나타났다. 복분자(RCM)의 수분은 6.57±0.15%, 탄수화물은 78.93±0.70% 조단백질은 7.17±0.21%, 조지방은 4.00±0.17%, 조회분은 3.33±0.21%로 나타났다.
베리류의 수분함량은 5.17-8.50%의 범위로 대부분 수분함량이 낮았는데 이는 모두 건조된 형태로 구입하여 시료로 사용하였기 때문이며, 탄수화물 함량의 경우 모든 성분 중 비중이 가장 크게 나타났는데 이는 다른 베리류에 비해 단맛이 강하고 신맛이 적은 특징을 지니고 있는 블루베리(VC)가 가장 높았고 오디(MBK)가 가장 낮게 나타났다.
조단백질 함량은 블루베리(VC)가 3.37 g/100 g으로 가장 낮았고, 영양 과실(Kim et al., 2003)인 오디(MBK)가 10.43 g/100 g으로 가장 높게 나타났다. 조지방 함량의 경우, 체리(PA)가 0.87 g/100 g으로 가장 낮았고, 오디(MBK)가 6.97 g/100 g으로 가장 높게 나타났다. 조회분 함량의 경우 복분자(1.13%)가 가장 낮았고 오디(4.40%)가 가장 높았다.

2) 비타민 C 및 베타카로틴 함량

아로니아(AM), 블루베리(VC), 블랙베리(RFL), 체리(PA), 오디(MBK) 및 복분자(RCM) 등 6종 베리류의 비타민 C와 베타카로틴 함량은 Table 2에 제시된 바와 같다.
비타민 C의 함량은 아로니아(AM) 15.06±0.09 mg/100 g, 블루베리(VC) 0.35±0.01 mg/100 g, 블랙베리(RFL) 25.32±0.88 mg/100 g, 체리(PA) 6.28±0.17 mg/100 g, 오디(MBK) 134.67±1.53 mg/100 g, 복분자(RCM) 0.30±0.01 mg/100 g으로 오디의 비타민 C 함량이 가장 높게 나타났고, 복분자가 가장 낮게 나타났다. 블루베리(VC), 복분자(RCM)는 100 g당 1 mg 이하의 함량을 보여 비타민 C 함량이 낮은 편에 속했고, 오디(MBK)는 134.67 mg/100 g으로 다른 베리류에 비해 매우 높은 수치를 나타냈다.
베타카로틴 함량은 지용성 비타민으로 비검화물(unsaponifiable compound)에 속하는 색소 성분이다. 주로 야채와 과일류에 노란색, 주황색, 녹황색의 색소로 나타난다. 베타카로틴의 주된 항산화 능력으로는 in vitro 실험에서 lipid radical scavenger와 singlet oxygen quencher로서 주된 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Grune et al., 2010).
베타카로틴 함량의 경우 아로니아(AM)는 3809.33±9.29 μg/100 g, 블루베리(VC)는 141.33±3.06 μg/100 g, 블랙베리(RFL)는 522.67±8.50 μg/100 g, 체리(PA)는 537.67±2.52 μg/100 g, 오디(MBK)는 258.33±4.04 μg/100 g, 복분자(RCM)는 57.67±1.15 μg/100 g 으로 베타카로틴 함량이 나타났다. 베타카로틴 함량은 아로니아가 3809.33 μg/100 g으로 다른 베리류보다 함량이 크게 높았으며, 복분자(57.67 μg/100 g)에서 가장 낮게 나타났다.

2. 항산화 활성

6종 베리류의 열수 추출물과 혼합물의 항산화 관련 생리활성 평가로 total polyphenol 함량과 DPPH radical 소거능을 측정하였으며 그 결과를 Table 3에 제시하였다.
Total polyphenol 함량은 복분자(RCM)가 26.22 mg TAE/g, 아로니아(AM)는 11.95 mg TAE/g, 블루베리(VC)는 9.59 mg TAE/g, 오디(MBK)는 9.48 mg TAE/g, 블랙베리(RFL)는 8.99 mg TAE/g, 체리(PA)는 2.75 mg TAE/g 순으로 높게 나타났다. Kang et al.(2015)의 연구에서 복분자가 10.81 mg/g으로 오디와 블루베리보다 높게 나타나 본 연구 결과와 유사하였다. 또한 복분자는 다른 식물에 비해 polyphenol 함량이 높아 항산화 효능이 뛰어나다고 보고된 것(Kim et al., 2010)과 일치하였다.
DPPH radical 소거능의 경우 복분자가 93.78%로 가장 높았고, 아로니아(80.84%), 블랙베리(73.80%), 블루베리(67.93%), 오디(67.53%), 체리(27.67%) 순으로 높게 나타났다. Total polyphenol 함량이 가장 높았던 복분자가 DPPH radical 소거능도 가장 높게 나타나 베리류의 폴리페놀과 DPPH radical 소거능간에 유의한 상관관계가 있다고 한 Kim et al. (2018)의 연구 결과와 일치하였다. 또한 블랙베리보다 복분자의 DPPH radical 소거능이 높게 나타난 Kim et al. (2019)의 연구 결과와도 일치하였다.

3. 안전성 및 항염증 활성

1) 세포 생존율

6종 베리류의 열수 추출물에 대한 세포독성을 측정하기 위해 시료를 농도별(200 μg/mL, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL)로 RAW 264.7 cell에 처리하였고, 그 결과를 Figure 1에 제시하였다.
아로니아의 경우 200 μg/mL, 500 μg/mL에서 독성을 보이지 않았고 1,000 μg/mL 에서도 84% 이상의 생존율을 보였다.
블루베리는 1,000 μg/mL 농도에서 76.02%, 500 μg/mL 농도에서 77.92%, 200 μg/mL 농도에서 78.93%의 생존율을 보였다.
블랙베리는 200 μg/mL 농도에서도 80.39%의 생존율을 보였고, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL에서는 74.54%, 72.62%의 생존율을 보였다.
체리는 200 μg/mL 농도에서는 80.05%의 생존율을 보여 블랙베리와 유사하였지만, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL에서는 79.61%, 78.42%로 농도가 높아져도 생존율이 크게 감소하지 않아 블랙베리와는 다른 경향을 보였다.
오디는 200 μg/mL 농도에서 109.65%, 500 μg/mL 농도에서 107.71%, 가장 고농도인 1,000 μg/mL 농도에서 92.49%의 생존율을 보여 모든 농도에서 독성이 나타나지 않았다.
복분자는 200 μg/mL 농도에서 101.15%, 500 μg/mL에서는 87.26%, 1,000 μg/mL에서는 72.49%의 생존율을 보였다.
본 연구결과 동결 건조한 6종 베리류의 열수 추출물 시료의 세포생존율은 베리의 당성분으로 인해 생존율이 다소 떨어지긴 하였으나, 실험 농도인 1,000 μg/mL까지는 대체로 독성이 나타나지 않았다.

2) NO 생성 억제 활성

일반적인 iNOS에 의한 NO 생성은 종양이나 세균을 제거하기도 하지만 과도하게 생성될 경우 염증을 유발하여 조직이나 신경의 손상, 유전자 변이 등을 일으킨다(Weisz et al., 1996). NO는 아민류와 반응하여 발암물질인 nitrosamine을 생성하는데, nitrosamine은 superoxide (O2-)와 반응하여 강한 독성 산화제인 peroxynitrite (ONOO)를 생성한다(Yang et al., 2015a).
따라서 본 연구에서는 동결 건조한 6종 베리류의 열수 추출물 시료의 농도별(200 μg/mL, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL) NO 생성량을 측정 후 Figure 2에 제시하였다.
아로니아의 경우 200 μg/mL 농도에서 100.43%, 500 μg/mL 농도에서 80.02%, 1,000 μg/mL 농도에서 47.8% 수준으로 나타나 농도 의존적으로 NO 생성 억제 효과가 커짐을 확인할 수 있었다. Yang et al. (2015a) 역시 아로니아 열수 추출물이 0-500 μg/mL 농도에서 농도 의존적으로 염증성 사이토카인 분비를 억제하여 염증반응을 조절하였다고 하여, 본 연구 결과와 일치하였다.
블루베리는 200 μg/mL 농도에서는 107.02%로 NO 생성이 억제되지 않았으나, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL 농도에서는 각각 81%, 64.1% 수준을 보여 농도 의존적으로 NO 생성이 억제되었다.
블랙베리와 체리는 모든 농도에서 NO 생성억제 효과를 확인할 수 없었다.
오디는 200 μg/mL, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL 농도에서 각각 119.85%, 113.65%, 99.6% 수준으로 나타나 1,000 μg/mL 이하의 농도에서는 NO 생성이 억제되지 않았다.
복분자는 200 μg/mL 농도에서는 101.15%로 NO 생성 억제 활성이 나타나지 않았으나, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL 농도에서는 각각 87.26%, 72.49%로 나타나 농도 의존적으로 뛰어난 활성을 보였다. Polyphenol의 뛰어난 항산화 효능은 염증 억제 효과가 있는 것으로 알려져 있는데(Cilla et al., 2009; Seymour et al., 2009), 본 연구에서도 아로니아와 복분자가 polyphenol 함량과 항산화능이 다른 베리류 보다 높게 나타나 연구 결과와 일치하는 것을 알 수 있었다.

4. 베리의 생리활성물질과 생리활성 간의 상관관계

6종 베리의 추출물 시료들의 생리활성물질과 생리활성 간의 상관관계를 분석하여 Table 4에 제시하였다.
6종 베리의 추출물 시료의 NO 생성량은 비타민 C와 0.435로 양의 상관관계를 보였으나 유의하지 않았다. 베타카로틴은 -0.463, total polyphenol 함량과는 -0.680으로 유의한 음의 상관관계를 보였다.
DPPH radical 소거능의 경우 비타민 C가 -0.013으로 유의하지 않은 음의 상관관계를 보였다. 베타카로틴은 0.176으로 양의 상관관계를 보였으나 유의하지 않았다. Total polyphenol 함량과는 0.828로 유의한 양의 상관관계를 보였다.
이러한 결과를 볼 때 베리 추출물에 포함된 베타카로틴과 total polyphenol과 같은 항산화물질이 NO 생성을 억제했고, 그중 total polyphenol은 DPPH radical 소거능을 향상시키는 역할을 한 것이라 생각된다.

5. 베리 혼합물의 생리활성 효과

6종 베리의 추출물 시료 중 항산화능이 가장 높은 복분자와 항염증 활성이 가장 높은 아로니아를 혼합한 시료의 total polyphenol 함량, DPPH radical 소거능, NO 억제 활성 분석 결과는 Figure 3에 제시된 바와 같다.
Total polyphenol 함량의 경우 복분자(RCM)가 26.22 mg TAE/g, 아로니아(AM)는 11.95 mg TAE/g, 복분자와 아로니아 혼합물(RCM1AM1)은 20.90 mg TAE/g이었으며, 혼합물(RCM1AM1)의 total polyphenol 함량이 복분자(RCM)에 비해 낮았으나, 아로니아(AM)에 비해서는 높은 것을 알 수 있었다(Figure 3A).
DPPH radical 소거능의 경우 복분자(RCM)가 93.78%, 아로니아(AM) 80.84%, 복분자와 아로니아 혼합물(RCM1AM1)은 88.31%로 나타났으며, 혼합물(RCM1AM1)의 DPPH radical 소거능이 복분자(RCM)에 비해 낮았으나, 아로니아(AM)에 비해서는 높은 것을 알 수 있었다(Figure 3B).
NO 생성량의 경우 1,000 μg/mL 농도에서 아로니아(AM)가 47.8%로 NO 생성 억제 효과가 가장 높았고, 혼합물(RCM1AM1) 61.35%, 복분자(RCM) 72.49% 순으로 나타났다. 또한 혼합물(RCM1AM1)의 NO 생성 억제 효과가 아로니아(AM)에 비해서는 낮았으나, 복분자(RCM)에 비해서는 높은 것을 알 수 있었다(Figure 3C).
본 연구 결과, 6종 베리류 중 항산화 효능이 가장 높은 복분자(RCM)와 항염증 활성이 가장 높은 아로니아(AM)를 혼합하였을 때, 혼합물(RCM1AM1)의 항산화 관련 생리활성은 복분자(RCM)에 비해, 항염증 활성은 아로니아(AM)에 비해 상대적으로 낮은 것을 알 수 있었다. 그러나, 단일물 보다 혼합하였을 때 항산화 효능과 항염증 효능 모두 상승되어 상호보완적 시너지 효과가 있는 것으로 보여진다.

Conclusion

본 연구에서는 국내에서 다소비 되고 있는 아로니아, 블루베리, 복분자, 블랙베리, 오디 및 체리 등 총 6종의 베리류를 선정하여 이너뷰티 소재로 그 활용 가능성을 평가하고자 하였다. 따라서 이화학적 성분 분석(일반성분, 비타민 C 및 베타카로틴), 항산화 관련 생리활성(total polyphenol 함량, DPPH radical 소거능), 그리고 안전성 및 항염증 효능(MTT assay, NO 생성 억제 활성)을 측정하였으며, 6종 베리류 중 항산화 효능과 항염증 효능이 각각 우수한 복분자와 아로니아 혼합물을 제조하여 각각의 생리활성을 비교분석 하였다.
비타민 C와 베타카로틴 함량은 각각 오디, 아로니아가 가장 많은 것으로 나타났고 항산화 관련 생리활성 평가인 total polyphenol 함량은 복분자가 26.22 TAE/g, 아로니아가 11.95 TAE/g로 높게 나타났다. DPPH radical 소거능 역시 복분자가 93.78%, 아로니아가 80.84%로 높게 나타나 total polyphenol 함량과 같은 경향으로 나타났다.
6종 베리류의 안전성을 MTT assay로 측정한 결과, 1,000 μg/mL 농도까지는 75%-110% 수준의 세포 생존율을 보여 특이한 세포독성은 관찰되지 않았다. NO 생성량은 1,000 μg/mL 농도에서 아로니아(47.8%), 블루베리(64.1%), 복분자(72.49%)순으로 아로니아의 NO 억제 효과가 가장 크게 나타났다.
6종 베리류의 생리활성 물질과 생리활성 간의 상관관계를 분석한 결과, 총 폴리페놀 함량이 생리활성(NO 생성 억제, 항산화 효능)과 높은 정의 상관성이 있음을 알 수 있었다. 또한 6종 베리류 중 항산화 효능과 항염증 효능이 각각 우수한 복분자와 아로니아 혼합물의 total polyphenol 함량, DPPH radical 소거능, NO 억제 활성을 비교분석한 결과, 혼합물에서 각각의 효능이 모두 상승되어 상호보완적 시너지 효과가 나타나 향후 inner beauty 소재로 개발할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.

NOTES

Author's contribution
YRK as the first author, contributed to all aspects of analysis and experimental design, and wrote the manuscript. AJK as the second author, contributed to all the experimental design in detail and correcting the errors directly.

NOTES

Author details
Ye-Rin Kim (Graduate student), Department of Alternative Medicine, Kyonggi University, 24, Kyonggidaero-9 gil, Seodaemun-gu, Seoul 03746, Korea; Ae-jung Kim (Professor), Department of Nutrition Therapy, The Graduate School of Alternative Medicine, Kyonggi University, 24, Kyonggidaero-9 gil, Seodaemun-gu, Seoul 03752, Korea.

Figure 1.

Cell viability of freeze-dried extract of six berries (by MTT assay).

Extracts of six berries were treated at different concentrations (200, 500, and 1,000 μg/mL) in RAW 264.7 cells. Data are presented as mean±SD (n=4). AM, aronia (Aronia melanocarpa); VC, blueberry (Vaccinium corymbosum); RFL, blackberry (Rubus fruticosus L.); PA, cherry (Prunus avium L); MBK, mulberry fruit (Morus bombycis Koidz); RCM, Korean raspberry (Rubus coreanus Miquel); MTT, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide.
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Figure 2.

Suppressive effect of freeze-dried extract of six berries on nitric oxide production in LPS (1 μg/mL)-induced RAW 264.7 cells.

Extracts of six berries were treated at different concentrations (200, 500, and 1,000 μg/mL) in RAW 264.7 cells. Data are presented as mean±SD (n=4). Means with different letters (a–d) are significantly different at p<0.05 according to Duncan’s multiple range test. ***p<0.001 compared with LPS. NO, nitric oxide; LPS, lipopolysaccharide; AM, aronia (Aronia melanocarpa); VC, blueberry (Vaccinium corymbosum); RFL, blackberry (Rubus fruticosus L.); PA, cherry (Prunus avium L); MBK, mulberry fruit (Morus bombycis Koidz); RCM, Korean raspberry (Rubus coreanus Miquel).
ajbc-18-3-375f2.jpg
Figure 3.

Physiological effect of the combination of RCM and AM.

Means with different letters (a–c) are significantly different at p<0.05 according to Duncan’s multiple range test. RCM, Korean raspberry (Rubus coreanus Miquel); RCM1AM1, mixture of RCM and AM; AM, aronia (Aronia melanocarpa); NO, nitric oxide; DPPH, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl; TAE, tannic acid equivalent.
ajbc-18-3-375f3.jpg
Table 1.
Comparative content of the general composition of six berries (g/100 g)
Variables Moisture Carbo-hydrate Crude protein Crude fat Crude ash
Samples
AM 5.17±0.151)e2) 83.63±0.25b 5.83±0.06d 2.40±0.00c 2.97±0.06c
VC 7.47±0.15c 86.96±1.00a 3.37±0.06f 1.07±0.06d 1.13±0.06e
RFL 8.50±0.20a 78.48±1.18c 8.03±0.21b 2.43±0.15c 2.56±0.15d
PA 7.63±0.15bc 83.80±1.45b 4.30±0.17e 0.87±0.06e 3.40±0.10b
MBK 7.87±0.06b 70.33±0.12d 10.43±0.12a 6.97±0.12a 4.40±0.30a
RCM 6.57±0.15d 78.93±0.70c 7.17±0.21c 4.00±0.17b 3.33±0.21b

AM, aronia (Aronia melanocarpa); VC, blueberry (Vaccinium corymbosum), RFL, blackberry (Rubus fruticosus L.); PA, cherry (Prunus avium L); MBK, mulberry fruit (Morus bombycis Koidz); RCM, Korean raspberry (Rubus coreanus Miquel).

1) Mean±SD (n=3).

2) Different superscripts differ significantly according to Duncan’s multiple range test at p<0.05

Table 2.
Comparative content of vitamin C and β-carotene of six berries
Variables Vitamin C (mg/100 g) β-carotene (μg/100 g)
Samples
AM 15.06±0.092)c3) 3809.33±9.29a
VC 0.35±0.01e 141.33±3.06e
RFL 25.32±0.88b 522.67±8.50c
PA 6.28±0.17d 537.67±2.52b
MBK 134.67±1.53a 258.33±4.04d
RCM 0.30±0.01e 57.67±1.15f

AM, aronia (Aronia melanocarpa); VC, blueberry (Vaccinium corymbosum), RFL, blackberry (Rubus fruticosus L.); PA, cherry (Prunus avium L); MBK, mulberry fruit (Morus bombycis Koidz); RCM, Korean raspberry (Rubus coreanus Miquel).

1) Mean±SD (n=3).

2) Different superscripts differ significantly according to Duncan’s multiple range test at p<0.05.

Table 3.
Total polyphenol content and DPPH radical scavenging activity of six berries
Variables Total polyphenol content (mg TAE)/g) DPPH radical scavenging activity (%)
Samples
AM 11.95±0.321)b2) 80.84±1.85b
VC 9.59±0.12c 67.93±1.34d
RFL 8.99±0.04d 73.80±0.74c
PA 2.75±0.12e 27.67±0.39e
MBK 9.48±0.08c 67.53±2.05d
RCM 26.22±0.23a 93.78±1.10a

AM, aronia (Aronia melanocarpa); VC, blueberry (Vaccinium corymbosum), RFL, blackberry (Rubus fruticosus L.); PA, cherry (Prunus avium L); MBK, mulberry fruit (Morus bombycis Koidz); RCM, Korean raspberry (Rubus coreanus Miquel)); TAE, tannic acid equivalent; DPPH, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.

1) Mean±SD (n=3).

2) Different superscripts differ significantly according to Duncan’s multiple range test at p<0.05.

Table 4.
Correlation coefficients between functional materials and biological activities of berry extracts
Variables NO production DPPH radical scavenging activity
Samples
Vitamin C 0.435 -0.013
β-carotene -0.463* 0.176
Total polyphenol -0.680** 0.828***

Correlation is significant at levels of ***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05; NO, nitric oxide; DPPH, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.

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