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Asian J Beauty Cosmetol > Volume 14(2); 2016 > Article
유산균 발효한 현미상황버섯균사체 추출물의 β-Glucan 함량 및 주름개선 효과

요약

목적:

본 연구는 주름개선 효과검정을 통해 현미상황버섯균사체의 주름개선 기능성 화장료 소재로서의 가능성을 확인하는데 그 목적이 있다.

방법:

Lactobacillus plantarum으로 현미상황버섯균사체를 배양하여 얻어진 추출물의 β-glucan 함량, β-glucan 분자량 측정, 세포독성평가, MMP-1 저해활성 측정, 콜라겐생합성 효과를 시험하였다.

결과:

현미상황버섯균사체의 β-glucan 함량 분석결과 미발효군, 발효군에서 각각 8.1, 12.8 g/100 g의 결과로 함량이 58% 증가 하는 것을 입증하였으며, β-glucan의 분자량 측정을 실시한 결과, 2,500 m/z 이하의 저분자 β-glucan을 확인하여 발효공정이 고분자의 β-glucan을 저분자로 분해하는 것을 확인하였다. 추출물의 세포독성은 미발효군, 발효군 모두 2,000 μg/mL이하 농도에서 세포독성이 나타나지 않아 독성에 대한 안전성을 확인하였다. 자외선(UVB) 조사에 의한 세포생존률은 미발효군, 발효군 모두 800 μg/mL 농도에서 가장 높은 세포생존율 효과를 나타냈다. Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 생성억제를 확인한 결과 미발효군, 발효군 모두 400 μg/mL 이상의 농도에서 MMP-1의 생성억제의 효과가 나타내는 것을 확인하였으며, 발효군 1,000 μg/mL 이상의 농도에서는 adenosine 400 μg/mL 과 유사한 효과로 높은 저해활성을 나타내어 collagenase 저해활성이 우수함을 확인하였다. Pro-collagen type Ⅰ의 생합성량을 측정한 결과 대조군 대비 미발효군, 발효군 모두 3배 이상의 collagen 생합성 증가를 나타내었다.

결론:

위의 내용을 종합하여 주름개선용 기능성 화장료로서 현미상황버섯균사체 유산균 발효 배양물의 활용가능성을 제시하였다.

Abstract

Purpose:

This study aimed to investigate the potential of brown rice Phellinus linteus as an anti-wrinkle material for cosmetics through examining anti-wrinkle effects.

Methods:

To check the anti-wrinkle effects of brown rice Phellinus linteus mycelium, we performed various experiments such as β-glucan content, β-glucan molecular weight, cell viability, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) inhibitory activity, and pro-collagen synthesis assay.

Results:

The β-glucan contents from brown rice Phellinus linteus mycelium extracts unfermented and fermented were 8.1, 12.8 g/100 g, rose up respectively and the fermented increased 58% compared with unfermented extract. The low molecular weights of the β-glucan such as less than 2500 m/z from the fermented was measured by MALDI-TOF mass spectrometry. We found that high molecular weight of β-glucan decomposed low molecular weight through fermentation. Measuring cytotoxicity of brown rice Phellinus linteus extracts in HS27 cells, cytotoxicity of both unfermented and fermented was not observed under 1,500 μg/mL concentration. After irradiating UVB treatment, HS27 cell viability of unfermented and fermented both showed the highest effect at 800 μg/mL concentration. The inhibitory activity of collagenase (MMP-1) of unfermented and fermented both showed the highest effect at a concentration of 400 μg/mL and the inhibitory activity of collagenase (MMP-1) of the fermented at a concentration of 1000 μg/mL had similar effects with adenosine at a concentration of 400 μg/mL. The amounts of biosynthesis of pro-collagen type I of the unfermented and fermented both increased more than three times compared with those of control.

Conclusion:

Through results, we identified anti-wrinkle effects of the brown rice Phellinus linteus and we anticipated the brown rice Phellinus linteus develop the functional cosmetic ingredient as anti-wrinkle effects.

中文摘要

目的:

通过研究糙米桑黄菌丝提取物的抗皱功效,确认糙米桑黄菌丝提取物作为化妆品原料的可行性。

方法:

在乳酸菌Lactobacillus plantarum培养的糙米桑黄菌丝体提取物中测量其β-glucan含量及分子量, 细胞毒性评价, 测定 MMP-1的抑制活性, 胶原蛋白的合成效果, 进而确认糙米桑黄菌丝提取物的抗皱功效。

结果:

通过测定糙米桑黄菌丝体提取物的β-glucan 含量分析结果, 未发酵群和发酵群分别其含量为8.1, 12.8 g/100 g, 发酵群 的含量明显增加58%。对β-glucan进行质普分析测定其分子量, 发现分子量小于2,500 m/z以下的低分子β-glucan, 从中确定 通过发酵工程高分子的β-glucan分解为低分子。在提取物的细胞毒性试验中, 当浓度为2,000 μg/mL以下时, 未发酵群和发 酵群都没有显现细胞毒性。在紫外线照射下未发酵群和发酵群的浓度为800, g/mL 时, 都显现出最高的细胞生存率 。Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)抑制效果实验, 未发酵群和发酵群的浓度为400 μg/mL以上时, 显现出抑制效果。发酵群的浓 度为1000 μg/mL以上时, 与浓度为 400 μg/mL adenosine 具有相似的抑制活性效果。Pro-collagen type Ⅰ的合成量测定结 果与对照群相比未发酵群和发酵群都增加了3倍以上。

结论:

通过以上结果, 乳酸菌发酵的糙米桑黄菌丝体作为抗皱功效性化妆品材料具有充分的可行性。

Introduction

상황버섯(Phellinus linteus)은 담자균류에 속한 고등균류로 소나무비늘버섯과(Hymenochaetaceae) 진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 백색부후균으로 이와 유사한 종류로는 마른진흙버섯(Phellinus gilvus), 말똥진흙버섯(Phellinus isniarius), 찰진흙버섯(Phellinus robustus), 검은진흙버섯(Phellinus nigricans), 낙엽송충버섯(Phellinus pini) 등이 있으며, 주로 뽕나무와 활엽수 줄기에 자생하며 삿갓표면을 제외하고는 모두 황색이므로 상황이라고 불린다(Lyu et al., 2007; Ren et al., 2006). 현미상황버섯(Brown rice Phellinus linteus, PL)은 발아현미에 상황버섯 종균을 접종시키는 새로운 배양 및 재배 방법으로, 본 재배법을 이용하여 암세포 성장억제 및 항종양 활성효과에 대한 연구가 진행되었다. 또한, 상황버섯의 한 종류인 목질진흙 버섯의 종균을 채취하여 발아된 현미에 접종시켜 만든 발아현미 상황버섯 또한 항염증 및 항산화 효과를 나타낸다고 보고하고 있다(Choi, 2008). 버섯의 주요 유효성분인 β-glucan을 비롯한 glucuronoxylomannan, glucomannan 등의 각종 다당체가 강력한 보습작용을 기반으로 세포활성 및 콜라겐의 생합성을 촉진함으로써 피부의 노화방지 효과를 나타냈다(Kim et al., 2009).
피부는 시간이 지남에 따라 호르몬 분비가 감소하고, 면역세포기능의 활성이 저하되며 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 내인성 노화가 발생하고, 그 밖에 외적으로는 오염된 공기와 약물 등의 환경인자에 의해 발생하는 노화와, 자외선에 의한 광노화가 진행된다(Ha, 2006). 노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 collagen, elastin, hyaluronic acid 등 구조 단백질을 생성하는 능력이 감소하고 matrix metalloproteinases (MMPs), elastase 등의 구조단백질 분해효소의 발현이 증가하며 이러한 구조단백질 분해효소는 진피 내 교원 섬유, 탄력 섬유, fibronectin 및 laminin과 같은 다양한 기질 단백질 분해를 유도하여 피부탄력을 떨어뜨리고 피부 주름생성을 야기한다(Brenneisen et al., 2002). 특히 MMPs는 피부의 keratinocytes, fibroblasts를 비롯한 많은 세포들로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix)과 기저막(basement membrane)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 잘 알려져 있다(Wang et al., 1999). 최근 피부 주름 개선 효과가 있는 다양한 소재 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 주름개선으로 쓰이고 있는 물질로는 retinol, retinyl palmitate, adenosine, epigallocatechin gallate 등이 있다(Maeda & Fukuda, 1991; Kim et al., 2010).
발효는 미생물의 효소작용을 이용하여 식품 내 성분을 분해 또는 변화시켜 특유의 최종산물을 만들어내는 현상을 이용한 가공기술이다. β-Glucan과 식이섬유는 인체 내 소화 효소로는 분해되지 않는 고분자 화합물로 열수 등을 이용한 추출 시 수율이 떨어지는 문제점이 알려져 있지만, 유산균을 이용한 발효시 β-glucan과 식이섬유 등의 저분자화가 가능하여 추출효율을 향상시킬 수 있다(Lim et al., 2012). 이 같은 다당체를 중심으로 하는 버섯 추출물은 기능성 화장품으로 활발하게 응용되고 있으며, 이의 산업적 생산체제도 점차 확대되고 있는 실정이다(Kim et al., 2009).
본 연구는 현미상황버섯균사체를 유산균 배양함으로써 버섯의 주요 유효성분인 β-glucan과 주름개선 효과를 검증하여 새로운 기능성 추출물 소재로서의 가능성을 확인하였다.

Methods

1. 실험재료 및 방법

1) 실험재료

본 실험에 사용한 현미상황버섯균사체는 경북 안동소재의 (주)류충현약용버섯(Korea)에서 제공받아 사용하였다. 균사체 배양은 물에 불린 현미를 121℃, 1.2기압에서 1 h 고압 살균 후 현미고체배지로 사용하여 균사체를 접종하여 25℃에서 15일간 정치 배양하여 현미상황버섯균사체를 제조하고, 또한 현미상황버섯균사체 500 g에 Lactobacillus plantarum (L. plantarum)을 10% 수준으로 접종하여 35℃에서 48 h 배양하여 현미상황버섯균사체 유산균 배양물(현미상황 유산균 배양물)을 제조하였다.

2) 추출물의 제조

추출용매는 증류수로 희석된 35% 에탄올을 사용하였으며, 현미상황균사체 추출물(이하 미발효군, Brown rice Phellinus linteus extracts, PLE)과 현미상황균사체 유산균 배양물(이하 발효군, Brown rice Phellinus linteus fermented, PLF) 시료 500 g에 각각 용매 5 L를 가하고 80℃에서 5 h 동안 환류 추출하였다. 그 후 3,000 rpm에서 15 min 원심분리한 상등액을 동결건조하여 시료로 사용하였다.

2. 추출물의 β-glucan 분석

1) 저분자 β-glucan 질량분석

MALDI-TOF/TOF 4800 PLUS (ABSCIEX, USA) 질량 분석기를 사용하여 저분자 β-glucan의 질량 분석을 진행하였다. 시료와 matrix (2,5-dihydroxybenzoic acid, 2,5-DHB)를 1:1 (v/v)로 섞고, 이온화를 촉진하기 위해 10 mM NaCl을 일부 첨가하여 OptiTOF MALDI stainless steel plate (ABSCIEX) 에 1 μL을 적용하였다. 분석조건은 MS Reflector positive ion mode로 spectrum을 획득하였고, laser intensity는 6500에 2000 shot으로 수행하였다. MS range는 850-6,000 m/z, MS data결과는 Data explorer (ABSCIEX)를 이용하여 분석하였다.

2) β-Glucan 함량 측정

시료의 β-glucan 함량은 mushroom and yeast beta-glucan assay procedure kit (Megazyme, Ireland)를 이용하여 측정하였다. 시료 100 mg에 37% HCl 1.5 mL를 넣고 30℃ 항온수조에서 45 min 교반한 후 3차 증류수 10 mL를 가하고 100℃ 항온수조에서 다시 2 h 교반하였다. 이 반응액을 상온에서 식힌 후 2 N KOH 10 mL를 가하여 혼합하였다. 이 혼합물에 0.2 M sodium acetate buffer (pH 5.0)를 가하여 100 mL로 정용한 후 원심분리(1,500×g, 10 min)하여 상등액을 얻었다. 상등액 0.1 mL에 exo-1,3-β-glucanase (20 U/mL)과 β-glucosidase (4 U/mL) 용액 0.1 mL를 가하고 40℃ 항온수조에서 60 min 반응시켰다. 이 반응액에 glucose oxidase/peroxidase (GOPOD; Megazyme, Ireland) 시약 3 mL를 넣고 40℃에서 20 min 반응 시킨 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 total glucan 함량 계산에 사용하였다. 또한 시료 100 mg에 2 N KOH 2 mL를 넣고 얼음을 채운 항온수조에서 20 min 교반 하였다. 이 반응액에 1.2 M sodium acetate buffer (pH 3.8) 8 mL amyloglucosidase (1,630 U/mL)과 invertase (500 U/mL) 용액 0.2 mL를 가하고 40℃ 항온수조에서 30 min 교반한 후 원심분리(1,500×g, 10 min)하여 상등액을 얻었다. 상등액 0.1 mL에 0.2 M sodium acetate buffer (pH 5.0) 0.1 mL와 GOPOD 시약 3 mL를 넣고 40℃에서 20 min 반응 시킨 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. α-Glucan의 흡광도는 표준물질인 glucose용액(1 mg/mL)을 GOPOD 시약과 반응시킨 반응액의 흡광도를 이용하여 각각 함량(g/100 g)값으로 계산하였다. β-Glucan 함량은 total glucan 함량에서 α-glucan 함량을 뺀 값으로 계산하였다.

3. 세포 배양

본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco, USA)와 100 U/mL penicillin and streptomycin (P/S; Gibco) 1%를 첨가한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Gibco) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.

4. 세포 생존율 측정

세포 생존율 측정은 EZ-cytox enhanced cell viability kit (Daeil Lab, Korea)를 이용하여 측정하였다(Park et al., 2003). 본 실험에는 인간섬유아세포 HS-27 (American Type Culture Collection, USA)를 사용하였으며 96 well plate에 5×104 cells/well 및 24 well plate에 1×105 cells/well이 되도록 분주한 후 24 h 배양하였다. 이 후, 배지를 제거하고 FBS와 P/S 무첨가 배지를 처리하여 3 h 배양한 후 시료를 농도별로 처리하고 24 h 배양 후 추가배양을 진행하였고, Ezcytox 용액을 total volume의 10%의 양으로 첨가한 후 1 h동안 37℃ 배양기에서 반응시켰다. 세포생존율은 iMark microplate absorbance reader (Bio-Rad, USA)를 이용하여 450 nm의 흡광도로 측정하였다.

5. 자외선 조사

실험에 사용된 자외선은 UVB로서 30 mJ/cm2의 자외선을 CL-1000 Ultraviolet Crosslinker (UVP, USA)를 사용하여 조사하였다. 자외선 조사 전 DMEM 배지를 제거 후 phosphate buffered saline (PBS)로 2회 씻어주었다(Wang et al., 1998).

6. Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) 저해활성 측정

인간 진피섬유아세포인 HS27 세포에 소재를 농도별로 처리했을 때 MMP-1의 저해활성을 측정하기 위해 Human Pro-MMP-1 Quantikine ELISA kit (R&D systems Inc., USA)를 이용하였다. 세포를 1×105 cells/well 농도로 24 well plate에 접종하여 24 h 배양하였다. 이 후, 배양된 배지를 제거하고 FBS와 P/S 무첨가 배지를 처리 후 3 h 배양한 후 시료를 농도 별로 처리하고 24 h 배양하였다. 각 well로부터 상층액을 회수하여 Human Pro-MMP-1 Quantikine ELISA kit 제조사의 방법에 따라 Pro-MMP-1의 총 양을 측정하였다.

7. Procollagen type-Ⅰ 생합성 측정

HS27 세포에 소재를 농도별로 처리했을 때 collagen type Ⅰ의 합성양을 측정하기 위해 procollagen typeⅠC-peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio, Japan)를 이용하였다. 세포를 1×105 cells/well 농도로 24 well plate에 접종하여 24 h 배양하였다. 이 후, 배양된 배지를 제거하고 FBS와 P/S 무첨가 배지를 처리 후 3 h 배양한 후 시료를 농도별로 처리하고 24 h 배양하였다. 각 well로부터 상층액을 회수하여 PIP EIA kit 제조사의 방법에 따라 procollagen typeⅠC-peptide의 총 양을 측정하였다.

8. 통계처리

결과의 통계처리는 SPSS 12.0 (SPSS Inc., USA) 프로그램을 사용하였고, 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 한 후 Duncan의 다중범위검증으로 5% 수준에서 최소유의차 검정(least significant difference test)을 실시하였다.

Results and Discussion

1. 저분자 β-glucan 질량분석

β-D-Glucan s tandard (S igma-a ldr ich, USA)와 발효추출물에서 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)를 이용한 질량분석 측정 결과 sodiated ions이 결합된 형태의 저분자 β-D-glucan 피크들을 검출하였다(Figure 1). β-D-Glucan 표준시약과 추출물 분석결과에서 1,013.1, 1,175.1, 1,337.1, 1,449.1, 1,661.2, 1,823.2, 1,985.2, 2,147.2, 2,309.2, 2,471.3 m/z로 분자량이 2,500 m/z 이하의 감도 높은 피크들을 검출하였으며, 분자량 차이가 162 m/z로 연속적으로 차이가 나는 [hexosen+Na]+ 형태임을 확인하였다. 본 결과는 영지버섯 추출물에서 저분자 β-D-glucan을 분리 농축한 시료에서의 질량분석 측정결과와 동일하며(Kao et al., 2012), β-D-glucan 표준시약에 비해 발효추출물의 저분자 피크 감도가 상대적으로 높은 것으로 볼 때, 발효에 의해 저분자화가 된 것으로 사료된다.

2. β-Glucan 함량분석

Table 1에서와 같이 미발효군, 발효군에서 β-glucan 함량은 각각 8.1 g/100 g과 12.8 g/100 g으로 나타났으며 유산균 발효를 통해 β-glucan함량이 증가하였다. Lee & Lee (2009)의 연구에서 현미상황버섯균사체의 β-glucan 함량을 18.4%로 보고하였는데 본 연구는 버섯 자실체가 아닌 균사체를 이용하여 유산균 발효 과정을 거쳤기 때문에 β-glucan 함량이 다소 적게 검출이 된 것으로 보인다. 또한 꽃송이버섯에 유산균 미발효, 발효군의 β-glucan 함량은 각각 24.0, 21.9%로 유의적인 차이가 없다고 보고하였다(Lim et al., 2012). 하지만 본 실험에서는 유산균 발효한 시료에서 β-glucan 함량이 약 58%가 증가되어 유산균 종에 따라 β-glucan 함량이 달리 나타나고 L. plantarum에 의한 발효가 β-glucan의 함량을 크게 증가시킴을 확인하였다.

3. 소재처리에 의한 섬유아세포(HS27)의 생존률 확인

미발효군, 발효군 추출물이 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 시료를 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000 μg/mL의 농도로 처리하고, 24 h 배양한 후에 EZ-cytox enhanced cell viability kit를 이용하여 세포의 생존율을 관찰하였다. 미발효군, 발효군 모두 2,000 μg/mL이하에서 세포독성이 나타나지 않았으며, 특히 발효군의 경우 2,000 μg/mL이상의 농도에서도 세포독성이 관찰되지 않았다(Figure 2). 따라서 본 연구의 주름 개선 효과 분석에는 추출물 100, 400, 800, 1,000, 1,500 μg/mL의 소재 처리 농도로 사용하기로 하였다.

4. 자외선(UVB) 조사 후 섬유아세포(HS27)의 생존율 확인

Procollagen type Ⅰ은 일반적으로 자연노화 또는 광노화 피부에서 큰 폭으로 감소를 보인다(Yokoyama et al., 2014). UVB에 의한 광노화의 경우 탄력섬유의 변성이 심하며 collagenase 발현이 증가하여 피부가 두꺼워지고 변형된 탄력 섬유가 증가하는 특징을 갖고 있다(Waller & Maibach, 2006). 자외선에 의한 스트레스를 유도하기 위하여 피부에 UVB를 24 h 노출시킨 다음 0.04% β-glucan을 적용하여 세포생존율을 확인해 본 결과 피부의 세포생존율이 실험군은 48.65%, 대조군은 26.82%로 나타났다. UVB에 대한 피부세포 손상을 보호한다는 선행 연구결과를 인용하여 UVB 조사로 인해 유발되는 산화스트레스에 미발효군, 발효군의 농도별 처리에 의한 섬유아세포의 재생 및 생존율을 측정하였다(Hart et al., 1998). 미발효군 100, 400, 800 μg/mL농도에서 소재를 처리하지 않은 대조군에 비하여 세포재생 및 생존율 증가가 나타났으며, 발효군에서는 모든 처리구간에서 대조군에 비해 세포재생 및 생존율이 증가하였고 특히 800 μg/mL 농도에서 가장 높은 효과를 나타냈다(Figure 3). 반면 식품의약품안전처 고시 주름개선 소재인 adenosine (A9251-1G, Sigma-aldrich, USA) 처리군의 결과 전 농도 구간에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 세포재생 및 생존율이 증가하였으며, 특히 1,000 μg/mL 처리군에서 가장 높은 효과를 확인 하였다. Adenosine 처리군에 비해 다소 낮은 효과를 보이지만 발효군 800 μg/mL 농도에서 세포 생존율이 대조군 대비 41% 증가를 보이며 adenosine 100 μg/mL 이하 농도보다 효과가 높은 것으로 나타나 피부노화 및 피부주름을 억제할 수 있을 것으로 예상할 수 있다.

5. Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) 저해활성 측정

Matrix metalloproteinases-1 (MMP-1)은 interstitial collagenase로 피부 노화 과정에서 진피의 collagen 분해에 중요한 역할을 한다(Uitto et al., 1989). 미발효군, 발효군 2가지 시료가 HS27에서 콜라겐 분해 효소(collagenase)인 MMP-1 생성량을 저해시키는지 알아보기 위해 Pro-MMP-1 ELISA kit를 사용하여 시료처리 후 반응시킨 세포배양액내 Pro-MMP-1 함량을 측정하였다. MMP-1은 섬유아세포, 콘드로사이트, 대식세포, 케라티노사이트 등에서 생성되며, epidermal growth factor (EGF), 인터루킨, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 등의 자극에 의해 발현된다. 미발효군, 발효군 2가지 처리군 모두 400 μg/mL 이상의 농도에서 Pro-MMP-1의 농도가 감소되었으며, 미발효군의 경우 대조군 100% 대비 100, 400, 800, 1,000, 1,500 μg/mL 소재 처리 배지에서 각각 101%, 86%, 78%, 73%, 82%로 측정되었으며, 발효군의 경우 81%, 65%, 66%, 56%, 61%로 발효군이 미발효군보다 MMP-1의 발현을 보다 억제하는 것으로 확인되었다(Figure 4). 양성대조군(adenosine 400 μg/mL)의 경우, 대조군 대비 50%로 측정되었으며, 특히 발효군 1,000 μg/mL 농도에서 adenosine 400 μg/mL 과 유사한 효과로 높은 MMP-1 저해활성을 나타내어 collagen의 분해를 보호하는 것을 확인할 수 있었다.

6. 섬유아세포(HS27)에서의 pro-collagen type Ⅰ 생합성량 확인

Procollagen은 아미노 말단과 카르복시 말단에 propeptide라는 peptide 염기서열을 포함하며, propeptide는 소포체에서 procollagen 분자의 접힘(folding)을 도와줌과 동시에 collagen의 중합반응이 일어날 때 collagen 분자로부터 절단, 분리된다고 알려져 있다. 분리된 propeptide의 양을 측정함으로써, 세포 내에서의 collagen 생합성 정도를 파악할 수 있다(Talwar et al., 1995). 본 연구에서는 정상 섬유아세포(HS27)에 collagen 생합성 증가를 확인할 수 있는 procollagen type I carboxy-terminal peptide (PIP) kit를 이용하여 현미상황 추출물의 collagen 생합성량을 나타내었다(Figure 5). 미발효군, 발효군의 처리군 모두 100 μg/mL 이상의 농도에서 PIP 농도가 증가하였으며, 처리를 하지 않은 대조군의 PIP 함량대비 3배 이상의 증가를 보였다. 대조군 대비 미발효군의 경우 100, 400, 800, 1,000, 1,500 μg/mL 농도에서 각각 3.5, 3.9, 4.1, 3.7, 3.2배이며, 발효군은 각각 4.3, 4.6, 4.6, 4.3, 4.2배로 증가하였다. 이러한 결과는 버섯의 β-glucan이 collagen 생합성 능력이 높으며 또한, 발효를 진행함으로써 β-glucan 함량이 증가하여 발효군이 미발효군보다 procollagen I 합성 유도효과가 높은 것으로 사료된다.

Conclusion

본 연구는 현미상황버섯균사체에서 유산균 배양공정을 거쳐 생성된 소재를 발효 전, 후 β-glucan 함량 분석 및 피부 재생 효과 검정을 실시하여 주름개선 기능성 화장료 소재로서의 가능성을 검토하고자 하였다. 버섯의 주요 유효성분으로 알려진 β-glucan의 함량을 측정하기 위해 mushroom and yeast beta-glucan assay procedure kit로 분석을 실시하여 미발효군, 발효군에서 각각 8.1, 12.8 g/100 g의 결과를 확인하였으며 이를 통해 현미상황버섯균사체를 유산균 발효 시킴으로써 β-glucan 함량이 58% 증가하는 것을 입증하였다. β-Glucan의 분자량을 확인하기 위해 MALDI-TOF mass spectrometry를 이용하여 분석을 실시한 결과, 2,500 m/z 이하의 저분자 β-glucan을 확인하여 발효공정이 고분자의 β-glucan을 저분자로 분해하는 것을 확인하였다. 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 농도별 시료를 EZ-cytox enhanced cell viability kit로 실험하여 인간 섬유아세포 (HS27)의 생존농도를 확인한 결과 미발효군, 발효군 모두 2,000 μg/mL이하 농도에서 세포독성이 나타나지 않아 독성에 대한 안전성을 확인하였으며 자외선(UVB)에 의한 세포생존률을 실험하기 위해 HS27에 자외선을 30 mJ/cm2 조사하여 세포생존율을 확인하였더니 미발효군, 발효군 모두 800 μg/mL 농도에서 가장 높은 세포생존율 효과를 나타냈다. Collagen 분해 효소인 matrix metallopoteinase-1 (MMP-1)의 생성억제를 확인한 결과 미발효군, 발효군 모두 400 μg/mL 이상의 농도에서 MMP-1의 생성억제의 효과가 나타내는 것을 확인하였으며, 발효군 1,000 μg/mL 이상의 농도에서는 adenosine 400 μg/mL 과 유사한 효과로 높은 저해활성을 나타내어 collagenase 저해활성이 우수함을 확인하였다. Procollagen type Ⅰ의 생합성량을 측정한 결과 대조군 대비 미발효군, 발효군 모두 3배 이상의 collagen 생합성 증가를 보여 주름개선 효과가 있는 것으로 나타났다. 위의 내용을 종합하여 주름개선용 기능성 화장료로서 현미상황버섯균사체 유산균 발효 배양물의 활용가능성을 제시하였다.

Acknowledgements

본 논문은 산업통상자원부의 경제협력권산업육성사업(과제번호 : R0003617) 연구비를 지원받아 수행되었음.

Figure 1.

Molecular mass analysis of β-D-glucan standard and PLE.

MALDI-TOF with 2,5-DHB as matrix, determined the molecular mass of β-D-glucan standard (A) and PLF (B, C).
ajbc-14-2-127f1.tif
Figure 2.

Cell viability of PLE (A) and PLF (B).

Extracts on fibroblast cell (HS27). Values are means of 3 replicates and those with different alphabet letter are significantly different at p<.05.
ajbc-14-2-127f2.tif
Figure 3.

Cell viability of PLE (A), PLF (B) and adenosine (C).

The UVB irradiated fibroblast cell (HS27). Values are means of 3 replicates and those with different alphabet letter are significantly different at p<.05.
ajbc-14-2-127f3.tif
Figure 4.

Effect of PLE and PLF extracts on the production of MMP-1 in fibroblast cell (HS27).

Results are means±S.D. of triplicate data. Values are means of 3 replicates and those with different alphabet letter are significantly different at p<.05.
ajbc-14-2-127f4.tif
Figure 5.

Pro-collagen synthesis of PLE and PLF extracts on fibroblast cell (HS27).

Results are means±S.D. of triplicate data. Values are means of 3 replicates and those with different alphabet letter are significantly different at p<.05.
ajbc-14-2-127f5.tif
Table 1.
β-Glucan content of brown rice Phellinus linteus
Sample β-Glucan content (g/100 g)
Brown rice Phellinus linteus extracts (PLE) 8.1±1.6
Brown rice Phellinus linteus fermented (PLF) 12.8±1.1

The data is shown as mean±S.D. (n=3)

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