흰색 무궁화 뿌리 추출물의 기능성 화장품 소재로서의 가능성

Effects of White Hibiscus syriacus L. Root Extracts as Functional Cosmetic Materials

白色无穷花根提取物作为功能性化妆品原料的可行性

Article information

Asian J Beauty Cosmetol. 2018;16(4):477-486
Publication date (electronic) : 2018 November 14
doi : https://doi.org/10.20402/ajbc.2018.0229
1Department of Health and Cosmetics, Dongduk Women’s University, Seoul, Korea
2Department of Cosmetic and Aesthetic, Dongduk Women’s University, Seoul, Korea
3Department of Applied Chemistry, Dongduk Women’s University, Seoul, Korea
김미정1, 김연정2, 박세연3,
1동덕여자대학교 보건향장학과, 서울, 한국
2동덕여자대학교 향장에스테틱학과, 서울, 한국
3동덕여자대학교 응용화학과, 서울, 한국
*Corresponding author: Seyeon Park, Department of Applied Chemistry, Dongduk Women’s University, 60 Hwarang-ro, 13-gil, Seongbuk-gu, Seoul 02748, Korea Tel.: +82 2 940 4514 Fax: +82 2 940 4510 Email: sypark21@dongduk.ac.kr

Mijung Kim and Yeonjung Kim contributed equally to this work.

Received 2018 June 26; Revised 2018 September 27; Accepted 2018 October 12.

Abstract

목적

본 연구는 흰색 무궁화 뿌리 추출물이 기능성 화장품 원료로서 가능성이 있는지를 알아보고자 진행하였다.

방법

흰색 무궁화 뿌리 에탄올 추출물을 유기층과 수층으로 분리하여 클로로포름 추출물과 물 추출물을 얻었다. 항균 효과는 흰색 무궁화 뿌리 클로로포름 추출물과 물 추출물을 0.1, 0.2 mg/mL 농도로 하여 Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)와 Staphylococcus aureus (S. aureus)에 대해서 측정하였다. 세포 독성 실험은 흰색 무궁화 뿌리 클로로포름 추출물과 물 추출물을 HaCaT cell과 Hs68 cell에서 10, 20, 40 μg/mL의 농도로 처리하여 확인하였다. 항산화 효과는 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) assay를 통해서 진행하고 콜라겐 합성 효과는 western blotting으로 측정하였다.

결과

클로로포름 추출물이 두 균에 대해 농도의존적으로 항균효과가 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 두 추출물은 HaCaT cell과 Hs68 cell에 대해 세포 독성이 크지 않게 나타났다. 항산화 효과를 측정한 결과는 클로로포름 추출물과 물 추출물이 양성대조군인 gultathione 보다 우수한 항산화력을 보였다. 마지막으로, 콜라겐 합성 효과에서는 미약한 정도로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

결론

본 연구를 통해서 흰색 무궁화 추출물이 기능성 화장품 원료로서의 가능성을 확인할 수 있었다.

Trans Abstract

Purpose

The present study aimed to investigate the potential application of white Hibiscus syriacus (H. syriacus) L. root extracts as functional cosmetic materials.

Methods

Total extracts of white H. syriacus L. roots were fractionated into an oil layer and an aqueous layer and named chloroform (CHCl3) extract and water extract, respectively. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and Staphylococcus aureus (S. aureus) were used to investigate anti-microbial effects of white H. syriacus L. root CHCl3 and water extracts at concentrations of 0.1 and 0.2 mg/mL, respectively. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt (MTS) assay was conducted to evaluate cytotoxicity of white H. syriacus L. root CHCl3 and water (10, 20, and 40 μg/mL) extracts. Anti-oxidant effects were examined using 2',7'–dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) assay and the effects on collagen synthesis were investigated using western blotting.

Results

CHCl3 extracts exhibited dose-dependent anti-microbial effects on P. aeruginosa and S. aureus. In addition, both CHCl3 and water extracts exhibited no cytotoxicity on HaCaT and Hs68 cell lines. Anti-oxidant effects of the CHCl3 and water extracts were superior to that of glutathione, a human innate antioxidant positive control. The white H. syriacus L. root extracts slightly restored collagen synthesis, which had been decreased by ultraviolet stimulation.

Conclusion

We have revealed, through the present study, the potential application of white H. syriacus L. root extracts as components of functional cosmetics.

Trans Abstract

目的

探索白色无穷花根提取物作为功能性化妆品原料的可行性。

方法

将白色无穷花根的总提取物分离成油层和水层,分别命名为氯仿(CHCl3)提取物和水提取物。在0.1,0.2 mg/mL氯仿提取物和水提取物的浓度下, 测定Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)和Staphylococcus aureus (S. aureus)的抗微生物活性。通过在HaCaT和Hs68细胞中,以10,20和40 μg/mL的浓度用氯仿和水提取物分别进行细胞毒性实验。通过2',7'–dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) assay测定法来测量抗氧化活性,并通过蛋白质印迹来测量胶原合成的效果。

结果

氯仿提取物对两种菌表现出剂量依赖性的抗微生物作用。两种提取物均对HaCaT细胞和Hs68细胞无细胞毒性。氯仿和水提取物显示出比阳性对照群谷胱甘肽更好的抗氧化活性。最后,证实白色无穷花根提取物略微恢复了胶原蛋白合成。

结论

通过这项研究,确认白色无穷花根提取物作为功能性化妆品的原料充分具有可能性。

Introduction

천연물의 하나인 식물은 생리활성 성분들을 다양하게 함유하고 있는데 그 중에서 플라보노이드류나 페놀성 화합물들은 radical의 제거를 통해 산화를 억제하는 항산화제로 보고되고 있다(Bendich et al., 1986). 또한 식물의 생리활성 성분들은 통증완화, 항염, 방부, 해열, 해독, 수렴 등에도 효능이 있는 것으로 알려져 있어 식물 추출물들이 화장품 성분으로 폭넓게 이용되고 있다(Ahn et al., 2004; Ody, 1995).

화장품에는 미생물에 의한 오염으로 발생할 수 있는 부패와 변취를 방지하기 위해 paraben류 등의 방부제들이 사용되어 왔다(Lee & Song, 2012). 뿐만 아니라 뛰어난 항산화력과 함께 경제성이라는 이유로 합성 항산화제도 널리 사용되어 왔는데 이로 인한 인체에 대한 안전성의 문제가 대두되면서 현재는 위험성 있는 성분을 중심으로 규제가 이루어지고 있는 상황이다(Branen, 1975; Ito et al., 1983). 이러한 문제를 해결하고자 자연의 산물인 식물들을 통해서 항균과 항산화, 항노화에 대한 연구들이 꾸준히 진행되고 있다(Kim & Park, 2017; Song & Lee, 2016; Yu et al., 2005).

무궁화의 학명인 Hibiscus syriacus L.은 Hibis (이집트의 신)와 -isco (그리스어 접미사)의 합성어와 원산지를 나타내는 syriacus (시리아)의 조합이다(Kim, 1979). 생태학적으로는 한국, 하와이, 북미, 중남미, 인도, 아프리카, 시베리아의 7개 지역에 200 여종이 분포하고 있다(Wyman, 1986). 무궁화(Hibiscus syriacus L.)는 아욱과(Malvaceae)에 속하는 낙엽활엽관목으로 성질이 가벼우며 약간의 향기가 있다(Lee, 2006). 새벽에 피었다가 저녁이면 오므려지고 개화기간도 길어 울타리나 정원수로 심어져 왔으며 예전부터 약용과 식용으로 사용되고 있다(Jang et al., 2015; Ryu, 1996). 전통 의학에서 무궁화 꽃은 이질, 질염뿐만 아니라 치질에도 사용되며 껍질은 해열, 건선, 습진 및 구충의 치료에 쓰이고 종자는 두통, 기침과 가래 제거에 이용되어 왔다(Hsu et al., 1996; Huang, 1998). 무궁화 중에서도 흰색 꽃은 다량의 플라본 성분을 함유하고 있고, 플라본의 50%는 사포나린(saponarin)으로 구성되어 있어 예전부터 약용으로 사용되어 왔는데 이 사포나린은 피부 세포의 항노화에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Kim, 2016; Yoo et al., 1996). 뿐만 아니라 흰 무궁화 꽃과 관련해서는 흰 무궁화 꽃 추출물의 항산화 활성과 in vitro 에서 파골세포의 분화에 주는 영향에 대한 연구, 무궁화 꽃 물 추출물의 항염증 효과에 대한 보고가 있다(Lee et al., 2013; Lee et al., 2015). 무궁화 꽃 이외의 부위에 대한 연구로는 수피의 열수 추출물과 에탄올 추출물의 기능성 화장품 가능성에 대한 연구와 무궁화 뿌리의 지질과산화 저해활성과 항균활성에 대한 연구, 발효 무궁화 추출물의 항산화와 혈액순환 개선 효과에 대한 연구 등이 있다(Jang et al., 2015; Shin & Ha, 2016; Yoo et al., 1997). 이러한 연구들은 무궁화 추출물들에 폴리페놀과 플라보노이드 등의 함량이 추출방식에 따라 차이가 있기는 하지만 다량 함유되어 있으며 항산화 효과도 우수하다고 하였다. 그러나 흰색 무궁화 뿌리 추출물을 대상으로 화장품 소재로서 가능성이 있는지에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구는 세포주와 균주를 이용하여 흰색 무궁화 뿌리 추출물들이 화장품 소재로서 가능성이 있는지를 확인하여 기능성 화장품 연구에 기초 자료를 제공하고자 진행되었다.

Methods

1. 실험 재료 및 추출 방법

본 연구에서 사용된 흰색 무궁화 뿌리는 2016년 경북 영천에서 채취한 것을 토종마을(Korea)을 통하여 구입하였다. 흰색 무궁화 뿌리는 음지에서 건조된 것이며 100 g을 취하여 95% 에탄올 1 L를 가한 후 heating mantle (MS-E105; Misung Scientific, Korea)에서 90℃의 온도로 3 h 동안 추출하였다. 흰색 무궁화 뿌리 에탄올 추출물은 감압 여과 과정 후 250 mL씩 클로로포름과 증류수를 혼합한 후 클로로포름층과 수층으로 분리하였다. Rotary evaporator (Rotavapor® R-114; BÜCHI Labortechnik AG, Switzerland)로 분획된 추출물들은 농축하고 클로로포름 추출물(흰색 무궁화 뿌리 유기층)과 물 추출물(흰색 무궁화 뿌리 수층)을 얻었다(Figure 1).

Figure 1.

Extraction method of Hibiscus syriacus L. root.

Root extracts of Hibiscus syriacus L. were extracted with 95% ethanol 1 L for 3 h at 90C° on a heating mantle. The ethanol extracts were filtered and concentrated to yield a residue. The residue was suspended and partitioned with chloroform and distilled water. The chloroform and distilled water fractions were designated as chloroform fraction (CHCl3 extract) and aqueous fraction (water extract), respectively.

2. 시약 및 기기

본 연구에서 진행된 실험 중 세포 실험에서 사용한 주요 시약으로는 fetal bovine serum (FBS; Hyclone™, GE Healthcare Life Sciences, USA), phosphate buffered saline (PBS; Hyclone™) Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Welgene, Korea), antibiotics (Welgene) 등이 있다. 또한, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt (MTS) assay에는 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 사용하였고, 항산화실험에서는 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) Cellular Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Assay Kit (Abcam, UK)와 glutathione (Sigma-Aldrich, USA) 등으로 진행하였다.

Western blotting 실험에서는 1, 2차 antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA), N,N'-methylene-bis-acrylamide (Acrylamide; Bio-Rad Laboratories, USA), sodium dodecyl sulfate (SDS; Sigma-Aldrich), nitrocellulose membrane (Thermo Fisher Scientific, USA), tris-buffered saline/0.5% tween-20 (TBST; Tech & Innovation, Korea), skim milk (BD Biosciences, USA), enhanced chemiluminescence (ECL; Invitrogen, USA)가 사용되었다. 그리고 세포 실험 과정에서 ethanol (Sigma-Aldrich), dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich), chloroform (Sigma-Aldrich) 등의 시약이 사용되었다.

항균효과 실험에서는 배지 제작에 tryptone (BD Biosciences), yeast extract (Duchefa Biochemie, Netherlands), sodium chloride (NaCl; Sigma-Aldrich)가 사용되었다.

실험에 사용된 기기에는 CO2 incubator (MCO-175; SANYO Electric, Japan), centrifuge (Union 32R; Hanil Scientific, Korea), shaking incubator (VS-8480SF; Vision Scientific, Korea), microplate reader (Synergy HT; BioTek Instruments, USA), ultraviolet (UV) illuminator (UV-1000; BoTeck, Korea), heating block (HB-R48; DAIHAN Scientific, Korea), shaker (BF-350SK; BioFree, Korea), autoradiography cassettes (Amersham™ Hypercassette™; GE Healthcare Life Sciences, UK)가 있다. 콜라겐 합성의 효과에 대한 정량분석은 Image J program (National Institute of Health, USA)을 이용하여 진행하였다.

3. 균주와 세포 배양

본 연구에서 항균 효과는 그람 음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa) (KCTC 2004; Korean Collection for Type Cultures, Korea)과 그람 양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus) (KCTC 1927; Korean Collection for Type Cultures)을 통해 측정하였다. 균주의 배양은 Luria-Bertani (LB)배지(1 L 기준; tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g, 증류수 950 g)로 37℃, 200 rpm의 shaking incubator에서 진행하였다.

콜라겐 합성과 항산화 효과 측정에는 Hs68 cell (섬유아세포주, fibroblast)과 HaCaT cell (각질형성세포주, keratinocyte)을 사용하였다. 세포들은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)을 통해서 구입하였고 DMEM에 10% FBS, 1% antibiotics를 첨가한 배양 배지로 37℃, 5% CO2의 incubator에서 배양하였다.

4. 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 항균 효과 측정

균주 배양 배지인 LB 배지를 시험관에 5 mL씩 넣은 후 멸균처리하였다. 대조군 시험관은 멸균된 LB 배지 상태로 녹농균과 황색포도상구균을 접종하고 DMSO 용매 대조군 시험관에는 2% DMSO로 처리하고 두 균주를 각각 처리하였다. 본 실험에서는 추출물들의 처리를 위한 용매로 DMSO가 사용되었는데 추출물들 자체의 독성 외에 DMSO의 독성 여부도 확인하기 위해 용매 대조군을 함께 진행하였다.

실험군의 LB 배지 시험관에 흰색 무궁화 뿌리 추출물들을 0.1, 0.2 mg/mL의 농도로 처리한 후 녹농균과 황색포도상구균을 각각 접종하였다. 대조군과 실험군들의 시험관들을 shaking incubator에서 18 h 동안 배양하였다. 시험관들의 배지를 균일한 상태로 하여 96-well plate에 100 μL씩 담아 microplate reader의 600 nm 조건에서 흡광도를 측정하였다. 항균 효과는 대조군에 대한 실험군의 상대값으로 구하였다.

5. 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 MTS assay

세포 생존율 실험은 추출물들이 항산화 효과 실험과 콜라겐 합성 실험에 사용되는 세포들에 독성을 나타내는지를 확인하기 위해 선행하였다. 항산화 실험에는 HaCaT cell이 사용되었고 콜라겐 합성 실험에는 Hs68 cell을 통해 진행하였다. 세포들을 96-well plate에 1.5×104 cells/well과 5.0×103 cells/well로 각각 분주한 후 37℃, 5% CO2의 incubator에서 배양하였다. 24 h 동안 세포를 배양한 후 흰 무궁화 뿌리 추출물들을 10, 20, 40 μg/mL의 농도로 처리한다. 24 h 동안 incubator에서 추가배양 후 각각의 well에 MTS 시약을 20 μL씩 넣는다. 3 h 후에 formazan을 확인한 후 microplate reader의 495 nm 조건에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 실험군의 상대적인 값으로 구하였다.

6. 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 항산화 효과 측정

HaCaT cell을 96-well plate에 1.5×104 cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO2의 incubator에서 배양하였다. 24 h 동안 세포를 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. DCFDA시약을 20 μM의 농도로 하여 45 min 동안 처리한 후 PBS로 2회 세척한다. 10, 20 μg/mL 농도의 추출물과 500 μM hydrogen peroxide (H2O2)를 함께 45 min 동안 처리하고 microplate reader의 485/528 nm 조건에서 흡광도를 측정하였다. 항산화 효과는 대조군에 대한 실험군의 상대적인 값으로 구하였다.

7. 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 콜라겐 합성 효과 측정

Hs68 cell을 6-well plate에 5.0×104 cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO2의 incubator에서 배양하였다. 24 h 후 PBS로 2회 세척한 후 UV illuminator에서 0.8 mJ/cm2 의 UVA와 1.1 mJ/cm2 의 UVB를 100 s 동안 조사하였다. UV를 조사한 후 5% anti-biotics만 첨가된 serum free DMEM에 20 μg/mL의 추출물을 처리하여 24 h 동안 배양하였다. Cell을 세척하고 2X SDS를 넣어 scraper로 모은 다음 마이크로 튜브에 담았다. 튜브를 100℃ heating block에서 10 min 동안 끓여서 단백질 sample을 얻었다. 단백질 sample을 10% SDS-polyacrylamide gel을 통해서 전기영동하고 nitrocellulose membrane으로 transfer한 후에 5% skim milk에서 blocking 하였다. Collagen과glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 1차 antibody를 밤새 반응시킨 후 1X TBST로 세척하였다. 이어 2 h 동안 2차 antibody를 결합시키고 1X TBST로 세척하였다. Membrane에 ECL detection system을 적용하고 autoradiography cassettes를 이용하여 X ray film으로 band를 확인하였다. 단백질 보정을 위해서 GAPDH antibody를 이용하였다. 콜라겐 합성 효과는 대조군과 UV 대조군 band를 추출물들의 band와 육안으로 비교, 확인하였다. 또한 Image J program을 통해 정량적으로 확인하였다.

8. 통계처리

본 연구의 결과는 3회 이상 시행한 후 나온 수치를 실험 횟수에 대한 평균(mean, M)과 표준편차(standard deviation, S.D.)로 나타내었다. 통계적 유의성에 대한 분석은 Student's t-test로 검증하였으며, p<0.05 (*p<0.05, **p<0.01)이상인 값을 유의미한 것으로 판정하였다.

Results and Discussion

1. 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 항균 효과 측정

흰색 무궁화 뿌리 클로로포름 추출물과 물 추출물의 항균 효과를 알아보기 위해 액체배지에 피부 질환과 관련이 있는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)과 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus)을 배양하여 사용하였다. 흰색 무궁화 뿌리 클로로포름 추출물과 물 추출물을 0.1, 0.2 mg/mL의 농도로 각각 처리하고 항균력을 측정하였다.

녹농균에서는 클로로포름 추출물 0.1, 0.2 mg/mL의 농도에서 농도의존적으로 항균효과가 나타났다. 0.1 mg/mL의 농도에서는 대조군(0.5% DMSO)에 비해 30%의 항균 효과가 보였고 0.2 mg/mL의 농도에서는 49%의 항균력이 관찰되었다. 물 추출물에서는 0.1 mg/mL에서 항균 효과가 관찰되지 않았지만 0.2 mg/mL에서 대조군에 비해 미약하지만 항균력이 나타났다. 황색포도상구균에서도 항균효과가 클로로포름 추출물의 두 농도 모두에서 나타났다. 0.1 mg/mL의 농도에서는 대조군(0.5% DMSO)에 비해 34%의 항균 효과가 나타났고 0.2 mg/mL의 농도에서는 42%의 항균력이 보였다. 반해, 물 추출물은 황색포도상구균에 대해 항균 효과가 보이지 않았다. 따라서 흰색 무궁화 뿌리 클로로포름 추출물 중에 박테리아에 대해 효과가 있는 물질이 있음을 짐작할 수 있었다(Figure 2).

Figure 2.

Anti-microbial effects of Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts.

Anti-microbial effects of Hibiscus syriacus L. root extracts were investigated by determination of bacterial growth using absorbance. P. aeruginosa and S. aureus were treated with CHCl3 and water extracts of Hibiscus syriacus L. root at concentrations of 0.1 and 0.2 mg/mL, respectively. The CHCl3 extract decreased bacterial growth of P. aeruginosa and S. aureus. Values represent the M±S.D. of three independent experiments (**p<0.01). P. aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa; S. aureus, Staphylococcus aureus; DMSO, dimethyl sulfoxide; CHCl3, chloroform; M±S.D., mean±standard deviation.

무궁화의 항균 활성 연구 중에서 Jang et al. (2015)은 무궁화 나무 수피 70% 에탄올 추출물이 S. aureus 에 대해 항균 효과가 나타났고 P. aeruginosa 에 대해서는 항균 활성이 보이지 않았으며 열수 추출물은 두 균주에 대해서 항균 활성이 관찰되지 않았다고 하였다. 이 연구의 열수 추출물 결과는 본 연구의 물 추출물의 결과와 일치하며 본 연구의 클로로포름에서 나타난 항균 활성과 비교하면 추출방식에 따라 항균 활성에 차이가 나타날 수 있음을 알 수 있었다.

2. 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 세포독성 측정

흰색 무궁화 뿌리 추출물의 독성을 알아보고자 MTS assay를 시행하였다. HaCaT cell과 Hs68 cell에 흰색 무궁화 뿌리 클로로포름 추출물과 물 추출물을 10, 20, 40 μg/mL로 처리한 후 독성의 정도를 살펴보았다. HaCaT cell에서 클로로포름 추출물은 농도에 따라 세포 생존율이 낮아지기는 하였으나 90% 이상의 세포 생존율이 확인되었다. 물 추출물을 처리한 실험군들에서는 대조군에서와 유사한 세포생존율이 나타났다. Hs68 cell에서는 클로로포름 추출물과 물 추출물 모두에서 농도가 높아짐에도 세포생존율이 높아졌다(Figure 3). 본 실험을 통해서 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 독성이 크지 않은 것으로 확인되었다. 그러나 HaCaT cell에서 나타난 클로로포름 추출물 40 μg/mL의 세포생존율을 감안하여 시료의 효과 실험인 항산화와 콜라겐 합성 효과 측정 실험은 10, 20 μg/mL 농도에서 효과 정도를 살펴보는 것으로 판단하였다.

Figure 3.

Effects of Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts on cell viability.

Cytotoxicity of Hibiscus syriacus L. root extracts was investigated through MTS assay. Hs68 cells and HaCaT cells were treated with Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts at 10, 20, and 40 μg/mL concentrations. The extracts showed no comparable cytotoxicity. Cell viability was expressed as a percentage of control. Values represent the M±S.D. of three independent experiments (*p<0.05, **p<0.01). CHCl3, chloroform; DMSO, dimethyl sulfoxide; MTS, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; M±S.D., mean±standard deviation.

3. 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 항산화 효과 측정

HaCaT cell에 산화적 스트레스를 증가시킨 후 추출물들을 10, 20 μg/mL의 농도로 처리하여 항산화 효과가 있는지를 측정하였다. 그 결과, 흰색 무궁화 뿌리 추출물들은 모두 항산화 효과를 보였는데 클로로포름 추출물에서 물 추출물보다 좀더 우세한 결과를 관찰할 수 있었다. 클로로포름 추출물들은 H2O2 (500 μM)를 처리했을 때 산화물의 축적량을 60%, 88% 줄이는 효과를 보였고 glutathione (10 μg/mL)보다도 15%, 43%의 항산화력이 관찰되었다. 물 추출물들도 H2O2 (500 μM) 대조군에 비해서 산화적 스트레스를 47%, 62% 감소시켰고 glutathione (10 μg/mL)보다도 2%, 17%의 항산화력이 관찰되었다. 두 추출물들은 농도의존적으로 산화적 스트레스를 감소시켰을 뿐만 아니라(**p<0.01) 양성대조군으로 사용한 glutathione (10 μg/mL)보다 더 우수한 항산화 효과를 보여 주었다(Figure 4).

Figure 4.

Anti-oxidant effects of Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts on HaCaT cells.

After treatment with H2O2, a reactive oxygen species inducing agent, HaCaT cells were treated with root extracts of Hibiscus syriacus L. (10 and 20 μg/mL). Relative activity in H2O2-treated group increased by 192% compared to that in the control. CHCl3 and water extracts of Hibiscus syriacus L. root (10 and 20 μg/mL) decreased oxidative stress in H2O2-treated cells. Values represent the M±S.D. of three independent experiments (**p<0.01). CHCl3, chloroform; H2O2, hydrogen peroxide; M±S.D., mean±standard deviation.

항산화 효과를 살펴볼 때 많이 진행되고 있는 실험법으로 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능이 있다. 기존 연구 중에 Kwon et al. (2003)은 무궁화 뿌리와 줄기 부위의 60% 에탄올 추출물에 대해 각각 열처리한 그룹과 열처리하지 않은 그룹으로 나눠 DPPH radical 소거능력을 살펴보았는데 열처리한 줄기 그룹이 항산화 능력이 우수하였고 열처리하지 않은 뿌리 그룹이 낮은 항산화력을 보였다고 보고하였다. 그리고 Lee et al. (2015)은 무궁화 잎, 줄기, 꽃 부위의 70% 에탄올 추출물 중에 잎의 DPPH radical 소거능력과 ABTS radical 소거능력이 우수하다고 보고하고 있다. 이들 연구들을 통해서 무궁화 부위와 추출방식이 항산화 효과에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있다. 뿐만 아니라 무궁화 추출물이 항산화에 효과가 있는 시료임에 대해서는 본 연구 결과와 일치하였다.

4. 흰색 무궁화 뿌리 추출물의 콜라겐 합성 효과 측정

흰색 무궁화 뿌리 추출물이 피부에서 콜라겐이 손상되었을 때 효과가 있는지에 대해 western blotting으로 살펴보았다. 필름을 통해서 살펴본 결과, 클로로포름 추출물 20 μg/mL와 물 추출물 20 μg/mL는 UV 대조군과 유사하게 관찰되어 유의미한 효과가 보이지 않았다(Figure 5). 좀더 정량된 결과를 확인하기 위해 Image J program을 통해서 수치화하였다. 결과값은 대조군과 실험군의 콜라겐 값을 기준 단백질인 GAPDH로 보정한 후 이를 UV로 처리하지 않은 대조군에 대한 값으로 도출하였다. 이를 통해서 클로로포름 추출물과 물 추출물이 UV에 의해서 손상된 대조군에 비해서는 콜라겐의 회복에 효과를 보였지만 UV를 처리하지 않은 대조군에 비해서는 콜라겐의 양이 미약한 것을 확인하였다(Table 1).

Figure 5.

Collagen synthesis effects of Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts.

Collagen synthesis effects of extracts of Hibiscus syriacus L. root were evaluated by western blotting. After the UVA irradiation (80 mJ/cm2) and UVB irradiation (110 mJ/cm2) except in the control group, Hs68 cells were treated with 20 μg/mL of CHCl3 and water extracts, respectively, of Hibiscus syriacus L. root for 24 h. Cell lysates were separated by SDS-PAGE and transferred onto the nitrocellulose membrane, then probed with collagen and GAPDH antibodies. Collagen synthesis was slightly restored by CHCl3 and water extracts, and the effects both extracts were not significant. UVA, ultraviolet A; UVB, ultraviolet B; CHCl3, chloroform; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

Quantification of collagen synthesis effects

Conclusion

본 연구는 화장품 신소재에 대한 연구의 일환으로 원예작물 중에 나라꽃인 무궁화를 대상으로 진행하였는데 연구 결과는 다음과 같다.

1. 흰색 무궁화 뿌리 클로로포름 추출물과 물 추출물 중에 클로로포름 추출물은 황색포도상구균과 녹농균에 대해 농도의존적으로 항균력을 보였는데 0.1 mg/mL에서는 포도상구균에서, 0.2 mg/mL에서는 녹농균에서 좀더 효과가 나타났다. 물 추출물은 항균효과가 크게 보이지 않았다.

2. 흰색 무궁화 뿌리 클로로포름 추출물과 물 추출물은 HaCaT cell과 Hs68 cell에 대해 크게 독성을 나타내지 않았다.

3. 산화적 스트레스에 대한 항산화력은 클로로포름 추출물과 물 추출물 모두에서 농도의존적으로 효과를 보였다. 이 두 추출물은 glutathione보다 우수한 항산화 효과를 보였고 특히, 클로로포름 추출물이 물 추출물보다 좀더 효과가 있는 것으로 관찰되었다.

4. Western blotting을 통한 콜라겐 합성 효과는 필름과 Image J program 모두에서 합성 효과가 미약하게 보이는 것을 확인할 수 있었다.

본 연구를 통해 흰색 무궁화 뿌리의 클로로포름 추출물이 그람 양성균과 그람 음성균에 대해 우수한 항균 능력을 갖고 있음을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 클로로포름 추출물은 세포에 대한 안전한 농도에서 높은 항산화력을 보여 피부를 보호하는 기능성 화장품의 소재로서의 가능성을 보여주었다. 또한 본 연구는 10, 20 μg/mL의 저농도에서 항산화와 콜라겐 합성 효과 실험이 진행되었다. 항산화 실험은 저농도에서도 양성대조군에 비해서 우수한 효과가 관찰되었다. 그러나 콜라겐 합성 효과 실험은 20 μg/mL에서 효과가 미약하였기에 농도를 높여서 살펴볼 필요가 있다. HS 68 cell은 40 μg/mL의 농도에서도 세포 생존율이 높게 나타나서 세포 생존율이 확보되는 고농도로 확장하여 효과 실험을 진행해 볼 것을 제안한다.

Acknowledgements

This work is part of the Yeonjung Kim’s M.Sc. thesis at the Dongduk Women’s University, Seoul, Korea.

이 연구는 동덕여자대학교 교내연구비 지원에 의해서 수행되 었습니다.

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Article information Continued

Figure 1.

Extraction method of Hibiscus syriacus L. root.

Root extracts of Hibiscus syriacus L. were extracted with 95% ethanol 1 L for 3 h at 90C° on a heating mantle. The ethanol extracts were filtered and concentrated to yield a residue. The residue was suspended and partitioned with chloroform and distilled water. The chloroform and distilled water fractions were designated as chloroform fraction (CHCl3 extract) and aqueous fraction (water extract), respectively.

Figure 2.

Anti-microbial effects of Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts.

Anti-microbial effects of Hibiscus syriacus L. root extracts were investigated by determination of bacterial growth using absorbance. P. aeruginosa and S. aureus were treated with CHCl3 and water extracts of Hibiscus syriacus L. root at concentrations of 0.1 and 0.2 mg/mL, respectively. The CHCl3 extract decreased bacterial growth of P. aeruginosa and S. aureus. Values represent the M±S.D. of three independent experiments (**p<0.01). P. aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa; S. aureus, Staphylococcus aureus; DMSO, dimethyl sulfoxide; CHCl3, chloroform; M±S.D., mean±standard deviation.

Figure 3.

Effects of Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts on cell viability.

Cytotoxicity of Hibiscus syriacus L. root extracts was investigated through MTS assay. Hs68 cells and HaCaT cells were treated with Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts at 10, 20, and 40 μg/mL concentrations. The extracts showed no comparable cytotoxicity. Cell viability was expressed as a percentage of control. Values represent the M±S.D. of three independent experiments (*p<0.05, **p<0.01). CHCl3, chloroform; DMSO, dimethyl sulfoxide; MTS, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; M±S.D., mean±standard deviation.

Figure 4.

Anti-oxidant effects of Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts on HaCaT cells.

After treatment with H2O2, a reactive oxygen species inducing agent, HaCaT cells were treated with root extracts of Hibiscus syriacus L. (10 and 20 μg/mL). Relative activity in H2O2-treated group increased by 192% compared to that in the control. CHCl3 and water extracts of Hibiscus syriacus L. root (10 and 20 μg/mL) decreased oxidative stress in H2O2-treated cells. Values represent the M±S.D. of three independent experiments (**p<0.01). CHCl3, chloroform; H2O2, hydrogen peroxide; M±S.D., mean±standard deviation.

Figure 5.

Collagen synthesis effects of Hibiscus syriacus L. root CHCl3 and water extracts.

Collagen synthesis effects of extracts of Hibiscus syriacus L. root were evaluated by western blotting. After the UVA irradiation (80 mJ/cm2) and UVB irradiation (110 mJ/cm2) except in the control group, Hs68 cells were treated with 20 μg/mL of CHCl3 and water extracts, respectively, of Hibiscus syriacus L. root for 24 h. Cell lysates were separated by SDS-PAGE and transferred onto the nitrocellulose membrane, then probed with collagen and GAPDH antibodies. Collagen synthesis was slightly restored by CHCl3 and water extracts, and the effects both extracts were not significant. UVA, ultraviolet A; UVB, ultraviolet B; CHCl3, chloroform; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

Table 1.

Quantification of collagen synthesis effects

Collagen GAPDH Collagen/GAPDH Relative activity (%)
Control 42346 34438 1.22963 100.00
UV control 6147 40857 0.15045 12.24
CHCl3 extract 8268 23482 0.35210 28.63
Water extract 10562 35779 0.29520 24.01

Collagen synthesis effects of Hibiscus syriacus L. CHCl3 and water extracts were quantified using the Image J program. Each value was normalized with the GAPDH band intensity. Both CHCl3 and water extracts exhibited slight collagen synthesis effects compared to the UV control. UV, ultraviolet; CHCl3, chloroform; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.