Acetyl hexapeptide-8 (AH-8)은 비드테크(DermaPepTM A610; Beadech, Korea)에서 구입하여 사용하였다(Figure 1). 효능원료로서 AH-8을 각각 3%와 5%를 혼합한 앰플을 제조하였다(Table 1). 제조 방법은 정제수, 점증제 등의 A 상(phase)의 원료를 계량하여 Homomixer^® (HM-U1.0; JPL Co, Korea)로 50℃, 10 min 조건으로 혼합하였다. B상은 보습제와 용제에 해당하는 원료를 계량하여 Homomixer로 5 min간 혼합하였다. 시판 앰플에 해당하는 대조군으로서 vehcile 앰플에 천연추출물 원료인 Camellia sinensis leaf extract와 Ginkgo biloba leaf extract를 Homomixer로 10 min 간 혼합하였다. 마지막으로 탄력개선을 위한 active 원료인 AH-8을 포함한 D 원료를 계량하여 Homomixer로 10 min간 혼합하였다. A+B+C+D 상의 혼합과정을 통해 Vehicle을 제조하였으며, Vehicle (Control; CTR)에 active 원료인 AH-8을 3%와 5%를 각각 최종 혼합하여 수분산제형의 앰플 시료를 제조하였다.

6주령의 C3H 생쥐 암컷 20마리를 구입하였다(Oreient Bio, Korea). C3H 생쥐 20마리를 일정한 온도 및 습도의 사육사에서 7일간 적응시킨 후 실험을 실시하였다. 실험 동물의 사육조건은 온도 22±2℃, 습도는 50±10%, 조명은 12시간 명암으로 유지하였다. 동물 실험은 원광대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 사전 심의를 거쳐 실행하였다 (승인번호 WKU21-80).

AH-8 앰플에 피부탄력 개선 효능을 평가하기 위해, 적응기가 지난 C3H 생쥐 암컷 20 마리를 무작위로 5개의 그룹(N=4)으로 분류하여 실험을 실시하였다. C3H 생쥐 각 그룹별 UVB 노출 및 시료의 처치는 Table 2와 같다. 무처치군(Control)을 제외한 UVB 조사군, Vehicle 처치 후 UVB 조사군, 3% AH-8 앰플 처치와 5% AH-8 앰플 처치 후 UVB 조사군은 먼저 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 호흡 마취 후 등 부위에 1×1 cm 크기로 동물용 클리퍼를 사용하여 털을 제거하였다. Vehicle, 3%와 5% 앰플을 매일 2회 1 μL씩 4주 동안 처치하였다. UVB 조사는 앰플이 피부에 흡수되는 시간을 고려하여 처치 30 min 후 UVB에 의한 광노화를 유도하였다.

무처치군을 제외한 4 개 그룹의 C3H 생쥐 등 피부에 태양광과 유사한 UVB를 방출하는 램프(UV Therapy System UV109, Waldmann, Germany)를 사용하여 UVB를 조사하였다. 첫째주는 1 minimal erythema dose (MED, 55-60 mJ/cm²) 2회를 조사하였고, 둘째 주는 2 MED 2회를 조사하였다. 셋째주는 3 MED 1회를 조사하고, 넷째주부터 여섯째주까지는 4 MED 1회씩 조사하였다. 6주 동안 총 UVB노출량은 21 MED였다. 동물의 피부 채취는 UVB 손상에 의한 직접적인 영향을 피하기 위해 최종 UVB 노출 시점을 기준으로 3일 후에 실시하였다(Figure 2).

채취한 피부 조직의 콜라겐 밀도를 확인하기 위해 Masson's trichrome Staining을 탄력섬유의 양과 형태 변성을 관찰하기 위해 Verhoeff's elastic staining을 진행하였다. C3H 생쥐 등 피부 조직을 채취하여 생리식염수로 세척하고 Neural buffered formaldehyde(NBF)에 24시간 고정하였다. 고정된 조직은 피부층을 포함하는 절편을 취하여 탈수시킨 후 파라핀 블록에 포매하여, 조직절편기(RM2125; Leica, Germany)를 이용하여 4 μm의 두께로 절단하고 Polylysine으로 코팅된 슬라이드에 붙였다. 조직절편은 xylene을 이용하여 파라핀을 제거하고 알코올과 증류수로 10 min간 함수시켜 증류수로 세척하였다. 염색이 끝난 조직 표본 슬라이드를 광학 현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 400 배율로 사진을 촬영하였다. 피부조직학적 변화를 평가하기 위해 특수염색을 한 피부조직의 사진 분석은 Soft Imaging System (Olympus, Japan)을 사용하여 정량하였다.

자료 분석은 모두 유의수준 5%에서 검증하였으며, 통계처리는 SPSS for windows version 24.0 program을 사용하였다. 데이터의 기술통계는 평균과 표준편차를 구하였다. 결과의 비교 분석을 위해 paired t-test를 실시하였다.

자외선 조사 후 생쥐 진피는 대조군의 진피에 비해 섬유 구조가 분절되고 치밀도가 감소하였다. AH-8 앰플을 생쥐 피부에 도포한 결과 모든 군에서 홍반, 부종 등의 피부 반응은 나타나지 않았다. 실험에 사용한 C3H 생쥐는 노화로 인한 모발 변화에 관한 연구에 효용성이 있는 생쥐 종으로 Bejaoui et al. (2019)이 이 종을 사용하여 특정 약물의 항노화 효과를 증명하였다. 이 연구에서도 CH3 생쥐 피부에 AH-8을 일정 기간 동안 도포하여 노화의 한가지 지표인 교원질의 이상을 교정하는 효과를 관찰하였다. 특히 펩타이드를 생쥐 피부에 도포했을 때 피부 발진 등의 부작용이 나타나지 않는 점 등도 펩타이드 성분의 유효성을 평가할 수 있는 적절한 생쥐 모델로 사료된다.

AH-8 앰플이 생쥐 피부에서 교원질의 형태와 밀도에 미치는 영향을 분석하기 위해 H&E, Masson-trichrome 염색을 실시하였다. 피부조직학적 변화는 무처치군을 대조군으로 설정하고 교원질의 형태와 밀도를 중심으로 관찰했다. H&E 염색에서 무처치군은 피부조직의 교원질의 형태가 규칙적이며 밀도가 비교적 높게 나타났다. 그러나 UVB를 조사한 군에서는 광노화로 인해 교원질의 형태가 불규칙적이며 무처치군의 피부조직에 비해 교원질이 손실된 부분이 관찰되었다. Vehicle 앰플 처치 후 UVB를 조사한 피부조직에서도 UVB를 조사한 피부조직과 같이 교원질이 손실된 부분들이 나타났다. 3%와 5% AH-8 앰플을 처치한 후 UVB를 조사한 피부조직은 교원질의 형태가 매우 규칙적이며, 무처치군에 비해 교원질의 밀도가 높게 나타났다(Figure 3).

각 그룹별 피부조직의 교원질을 정량하여 비교한 결과는 Figure 4와 같다. 무처치군의 교원질 정량 기준값을 1로 하였을 때, UVB 조사군은 0.22로 교원질의 양이 현저하게 감소하였고 이는 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p＜0.001). Vehicle 앰플을 처치한 후 UVB 조사군에서의 교원질이 무처치군과 동일하게 나타났다. 이는 효능원료가 함유되지 않은 Vehicle 앰플을 사용하였을 때에도 UVB 조사에 대한 교원질 손상을 저해하는 효능이 있음을 시사하는 결과라 할 수 있다. 3%와 5%의 AH-8 앰플을 처치한 후 UVB 조사한 결과에서는 각각 1.2%와 1.33% 교원질의 양이 증가하였다. 이는 통계적으로 유의한 차이가 나타나, 탄력개선 효능이 있음을 확인하였다.

2. 피부조직 탄력섬유의 변화(Verhoeff's elastic stain) AH-8 앰플이 생쥐 피부에서 탄력섬유의 변화에 미치는 영향을 분석하기 위해 H&E, Verhoef-Van Gieson 염색을 실시하였다(Figure 5). UVB 조사 후 생쥐 진피는 노화의 가장 극적인 변화를 나타내는데 이 실험에서는 탄력섬유의 양적 감소와 분절이 관찰되었으며 이는 대조군과의 비교에서 통계적으로 유의하였다. 자외선 조사가 피부 노화를 유발한다는 사실은 이미 여러가지 실험에서 증명되었다. 특히 피부 노화를 가장 확실하게 보여주는 변화는 콜라겐과 탄력섬유의 질적, 양적 변화이다. 선행연구결과에 의하면 사람 피부모델에서 UVA 조사는 콜라겐 섬유와 탄력섬유의 양이 감소하고 분절된다고 하였다(Boisnic et al., 1999). 특히, 주요한 결과를 살펴보면 사람 피부모델에서 탄력 섬유의 양적 변화는 자외선 조사 군이 대조군에 비해 약 1% 정도 감소하는 것으로 보고하였다. 이 실험에서도 UVB 조사는 생쥐 피부에서 탄력섬유의 감소와 분절이 관찰되어 사람 피부모델의 결과와 유사하였다. 또한 UVB 조사가 생쥐 진피의 탄력섬유의 양을 약 0.73% 정도 감소시켰다. 이런 차이는 피부모델과 생쥐 피부라는 재료의 차이에서 기인하는 것으로 생각된다. 또 자외선의 종류가 각각 A와 B였기 때문에 자외선 파장에 따라 탄력섬유의 변화 정도가 달라졌을 것으로 생각된다. 그러나 결과적으로 자외선 조사 후 생쥐 진피의 탄력섬유의 양이 감소하였으며, 이는 탄력저하, 피부 노화 현상이다. 자외선 조사가 피부 노화를 유도하지만 몇 가지 펩타이드는 자외선 유도 노화를 회복 또는 억제할 수 있다고 알려져 있으며 이 연구에서는 AH-8을 효능원료로서 처치한 후 UVB를 조사하고 탄력섬유의 변화량을 분석하였다(Figure 6).

진피 탄력섬유의 양은 자외선 조사 군보다 5% AH-8 앰플 도포 군에서 증가하였고, 형태학적으로도 정상적인 모양을 보였다(p＜0.01). 이 결과는 AH-8이 in vivo에서 피부 항노화 효과가 있음을 시사한다. 자외선에 의한 피부 노화는 불가역적으로 진피의 탄력섬유 변화를 수반한다고 알려져 있다. 결국 장기간의 자외선 노출로 발생하는 피부 노화를 어떤 방법으로 호전시킬 수 있는지가 항노화 연구의 핵심이다. 지금까지 가장 잘 알려진 항노화 물질은 트레티노인 국소제이다. 트레티노인은 피부에 자극적이어서 장기간 사용하기가 불편하다. 트레티 노인이 피부에 강한 자극성을 가지고 있다는 점이 피부에 자극이 적고 항노화 효과가 우수한 물질의 발굴이 필요한 이유인 것이다. 이 연구에 사용한 AH-8은 피부에 흡수가 용이하고 비교적 장기간의 사용에도 생쥐 피부가 자극되지 않았으며 탄력섬유의 양을 증가시킬 수 있어 피부의 탄력개선 및 항노화 물질로서의 활용가치가 예상된다.