요약목적본 연구는 라벤더꽃(Lavandula angustifolia Mill.)의 열수추출물(LAFDE), 50% 에탄올추출물(LAFEE) 및 발효추출물(LAFFE)의 항산화 활성과 UVB 유도 피부광노화 개선 효과를 비교 평가하였다.
방법라벤더꽃의 열수추출물, 에탄올추출물 및 발효추출물을 제조한 후 총 polyphenol 및 flavonoid 함량, DPPH 및 ABTS radical 소거능을 측정하여 항산화 활성을 평가하였다. 또한, UVB를 조사한 HaCaT 세포를 이용하여 elastase 저해 활성, type I procollagen 생성능, matrix metalloproteinase (MMP)-1 생성량 및 MMP-3, MMP-9, MMP-13의 mRNA 발현을 분석하였으며, 피부 장벽 및 보습 관련 유전자인 FLG, KRT1, HAS-2, HYAL3 및 AQP3의 발현 변화를 확인하였다.
결과총 polyphenol 및 flavonoid 함량은 LAFFE에서 가장 높게 나타났으며, DPPH 및 ABTS radical 소거능 또한 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었다. UVB를 조사한 HaCaT 세포에서 LAFFE는 농도 의존적으로 elastase 저해 활성과 type I procollagen 생성을 증가시켰으며, 다른 추출물에 비해 가장 우수한 활성을 나타내었다. 또한, UVB 조사에 의해 증가된 MMP-1 생성과 MMP-3, MMP-9 및 MMP-13 mRNA 발현을 효과적으로 억제하였다. 반면 피부 장벽 및 보습 관련 유전자인 FLG, KRT1, HAS-2, HYAL3 및 AQP3의 발현은 증가하였다.
AbstractPurposeThis study investigated the antioxidant and anti-photoaging activities of water extract (LAFDE), 50% ethanol extract (LAFEE), and fermented extract (LAFFE) prepared from Lavandula angustifolia flowers and evaluated their potential as functional cosmetic ingredients.
MethodsAntioxidant activities were determined by measuring total polyphenol and flavonoid contents as well as DPPH and ABTS radical scavenging activities. Anti-photoaging effects were evaluated in UVB-irradiated HaCaT keratinocytes by assessing elastase inhibition, type I procollagen production, matrix metalloproteinase (MMP) expression, and skin barrier- and hydration-related gene expression.
ResultsAmong the tested extracts, LAFFE exhibited the highest levels of total polyphenols and flavonoids and demonstrated the strongest radical scavenging activities. In UVB-irradiated HaCaT cells, LAFFE significantly increased elastase inhibitory activity and type I procollagen production in a concentration-dependent manner. Moreover, LAFFE markedly reduced MMP-1 production and suppressed the mRNA expression of MMP-3, MMP-9, and MMP-13, which are closely associated with collagen degradation and skin photoaging. In addition, LAFFE enhanced the expression of skin barrier- and moisturizing-related genes, including filaggrin (FLG), keratin 1 (KRT1), hyaluronan synthase 2 (HAS-2), hyaluronidase 3 (HYAL3), and aquaporin 3 (AQP3).
ConclusionThese findings indicate that fermented L. angustifolia flower extract possesses potent antioxidant, anti-wrinkle, and skin barrier-enhancing activities. Therefore, it may serve as a promising natural cosmetic ingredient for preventing UVB-induced skin photoaging and improving skin health.
中文摘要目的 本研究旨在探讨狭叶薰衣草(Lavandula angustifolia)花的水提取物(LAFDE)、50%乙醇提取物(LAFEE)以及发酵提取物(LAFFE)的抗氧化与抗光老化活性,并评估其作为功效性化妆品原料的潜能。
方法 通过测定总多酚和总黄酮含量以及DPPH和ABTS自由基清除能力来评估抗氧化活性。在受UVB照射的HaCaT角质形成细胞中,通过测定弹性蛋白酶抑制率、Ⅰ型原胶原(type I procollagen)生成量、基质金属蛋白酶(MMP)表达量以及皮肤屏障与保湿相关基因的表达,评估其抗光老化效果。
Introduction지중해 지역에서 유래한 라벤더(Lavandula angustifolia Mill.)는 꿀풀과(Lamiaceae)의 방향성 식물로, 특유의 향기 성분과 여러 생리활성 물질을 함유하여 약용 및 기능성 소재로 널리 활용되고 있다(Cavanagh & Wilkinson, 2002). 라벤더는 약 400여 종 이상의 품종이 보고되어 있으며(Upson & Andrews, 2004), 라틴어 “lavare”에서 유래된 이름으로 “씻다” 또는 “정화하다”라는 의미를 가진다(Lis-Balchin, 2002). 예로부터 라벤더는 아로마테라피, 향료, 화장품 및 대체의학 분야에서 널리 활용되어 왔으며 최근에는 피부 기능성 소재로서의 활용 가치가 증가하고 있다(Prusinowska & Śmigielski, 2014). 특히 라벤더 에센셜오일은 항균, 항진균, 항염 및 피부 진정 효과를 나타내는 대표적인 천연 방향성 오일로 알려져 있으며(Cavanagh & Wilkinson, 2005), 화장품 및 피부 보호 소재로서 높은 산업적 가치를 가진다(Białoń et al., 2019). 라벤더의 주요 생리활성 성분으로는 linalool, linalyl acetate, lavandulol, geraniol, eucalyptol, thymol 및 carvacrol 등이 보고되어 있으며(Koulivand et al., 2013), 이러한 성분들은 항균 및 항진균 활성뿐만 아니라 항산화 및 항염 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Peana et al., 2002; Vakilian et al., 2011). 특히 linalool과 linalyl acetate는 라벤더 에센셜오일의 주요 향기 성분으로 피부 진정 및 항산화 효과에 중요한 역할을 수행하며, terpinen-4-ol, 1,8-cineole 및 rosmarinic acid 등은 활성산소 제거와 염증 억제 효과에 기여하는 것으로 보고되었다(Hancianu et al., 2013; Adaszyńska-Skwirzyńska & Dzięcioł, 2017).
피부 노화는 단일 요인에 의해 발생하기보다는 자외선, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS), 환경오염 물질 및 지속적인 산화적 손상이 복합적으로 작용하여 진행되는 생리적 변화이다(Rinnerthaler et al., 2015). 특히 피부가 ultraviolet B (UVB)에 노출되면 세포 내 ROS 생성이 증가하고, 이에 따라 matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현이 활성화된다. 증가한 MMPs는 collagen과 elastin 을 비롯한 세포외기질 성분의 분해를 촉진하여 피부 탄력을 떨어뜨리고 주름 형성을 가속할 수 있다(Fisher et al., 2002; Quan et al., 2009). UVB에 의한 산화적 손상은 피부 장벽의 항상성에도 영향을 미쳐 경피수분손실을 증가시키며, 결과적으로 피부 건조와 탄력 저하를 초래한다. 이러한 변화는 filaggrin (FLG), aquaporin 3 (AQP3) 및 hyaluronan synthase 2 (HAS2)와 같이 표피 장벽 유지와 수분 항상성에 관여하는 인자들의 발현 변화와 밀접하게 연관되어 있다(Verdier-Sévrain & Bonté, 2007; Boury-Jamot et al., 2006). 따라서 항산화 활성과 함께 피부 보습 및 collagen synthesis 촉진 효과를 동시에 나타내는 천연 기능성 소재 개발의 중요성이 지속적으로 증가하고 있다(Pillai et al., 2005). 식물 유래 천연물의 생리활성은 추출 방법 및 용매에 따라 차이를 나타내는 것으로 보고되고 있으며(Dai & Mumper, 2010), 일반적으로 열수추출은 수용성 phenolic compounds 및 다당체 추출에 효과적이고 에탄올 추출은 flavonoids 및 지용성 기능성 성분의 추출 효율을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Do et al., 2014). 최근에는 발효 공정을 이용하여 식물 유래 소재의 기능성을 향상시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 발효 과정에서 고분자 phenolic compounds가 저분자화되어 생체이용률이 증가하고 flavonoids 및 다양한 생리활성 대사산물의 생성이 촉진됨으로써 항산화 및 항노화 활성이 향상되는 것으로 보고되고 있다(Hur et al., 2014; Swain et al., 2014). 또한 발효 식물 추출물은 collagen degradation 억제, 피부 장벽 강화 및 보습 개선 효과를 나타내어 기능성 화장품 소재로서 높은 활용 가능성을 가지는 것으로 알려져 있다(Park & Bae, 2016; Kang et al., 2020).
그러나 현재까지 라벤더꽃 열수추출물, 에탄올추출물 및 발효추출물을 비교하여 항산화 활성과 UVB 유도 피부광노화 개선 효과를 종합적으로 평가한 연구는 매우 제한적이다. 따라서 본 연구에서는 라벤더꽃의 열수추출물, 에탄올추출물 및 발효추출물의 항산화 활성, 주름개선 효과 및 피부장벽 강화 효과를 비교 평가하여 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 검토하고자 하였다.
Materials and Methods1. 라벤더꽃 열수와 에탄올 추출물본 연구에 사용된 라벤더꽃은 전북특별자치도 진안군에서 직접 재배한 잉글리시 라벤더(Lavandula angustifolia Mill.)로, 꿀풀과(Lamiaceae)에 속한다. 채취한 꽃은 40℃ 이하로 설정한 온풍건조기(EQ-04SW; Cheonan, Korea)를 이용하여 20시간 동안 건조하였다. 열수 추출물(LAFDE)은 건조 라벤더꽃에 정제수를 첨가한 후 80℃에서 회당 4시간씩 총 3회 추출하여 제조하였다. 에탄올 추출물(LAFEE)은 건조 시료 100 g에 95% 에탄올을 1:10 (w/v)의 비율로 첨가하고, 열수 추출과 동일하게 80℃에서 4시간씩 3회 반복 추출하였다. 각각의 추출액은 여과하여 잔사와 불용성 물질을 제거한 다음, 회전감압농축기(EYELA N-1000; Tokyo, Japan)를 사용하여 감압 조건에서 농축하였다. 농축액은 초저온냉동고에서 24시간 동안 동결한 후 동결건조기(DC1316; Ilshin, Korea)를 이용하여 72시간 동안 건조하였다. 동결건조가 완료된 시료는 분말화하여 이후 실험에 사용하였다. 건조 시료 중량을 기준으로 산출한 추출 수율은 LAFDE가 약 10-11%, LAFEE가 약 7-8%였다.
2. 라벤더꽃 발효추출물생라벤더꽃을 100 g에 정제수 900 mL를 첨가하여 1:10의 비율로 혼합하였다. 이후 80℃에서 2-3시간 열처리 후 식힌 액에 발효 균주로서 중량대비 3%의 Lactobacillus plantarum A KFCC11611P 과 Saccharomyces cerevisae KCTC 7106를 접종하여 온도 37℃, 습도 75%를 유지하며 3일간 배양기(MIR-H163; 대일테크, Korea)에서 배양하였다. 발효 종료 후 80℃에서 10-15 min간 가열하여 발효를 정지시킨 후 발효액은 3,000-5,000 rpm에서 10-20 min간 원심 분리한 후 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 여과 후 동결건조하여 라벤더꽃 발효추출물(LAFFE)로 사용하였다. 제조된 추출물은 -20℃ 또는 4℃에서 보관하였다.
3. 총 Polyphenol 함량 측정총 폴리페놀 함량은 Singleton 등의 방법을 일부 변형한 Folin-Ciocalteu 비색법으로 측정하였다(Singleton et al., 1999). 농도 1 mg/mL로 조제한 시료 용액 0.2 mL에 증류수 1.8 mL와 2 N oFlin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, USA) 0.2 mL를 순차적으로 첨가하였다. 혼합액을 3 min간 반응시킨 다음 포화 Na2CO3 (Sigma-Aldrich) 용액 0.4 mL를 가하고, 증류수를 첨가하여 최종 부피를 4 mL로 조정하였다. 이후 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 725 nm 에서 ELISA reader (800 TS; BioTek Instruments, USA)로 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 검량선으로부터 산출하였으며, 시료 단위 중량당 gallic acid equivalent (GAE)로 나타내었다.
4. 총 Flavonoid 함량 측정총 플라보노이드 함량은 aluminum chloride 비색법을 이용하여 분석하였다. 조제한 시료 용액 0.1 mL에 증류수 0.4 mL를 혼합한 다음, 5% sodium nitrite (NaNO2) 용액 0.03 mL와 10% aluminum chloride (AlCl3; Sigma-Aldrich) 용액 0.06 mL를 순차적으로 첨가하였다. 혼합액을 10 min간 반응시킨 후 1 M NaOH (Sigma-Aldrich)용액 0.2 mL와 증류수 0.2 mL를 가하였다. 반응액의 흡광도는 510 nm에서 ELISA reader (800 TS; BioTek Instruments)로 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 rutin으로 작성한 검량선에 측정값을 대입하여 산출하였으며, 시료 단위 중량당 rutin equivalents (RE)로 나타내었다.
5. DPPH 자유 라디칼 소거 활성 측정라벤더꽃 열수 추출물(LAFDE), 50% 에탄올 추출물(LAFEE) 및 발효 추출물(LAFFE)의 항산화 활성을 비교하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 각 추출물을 농도별로 희석한 후 96-well microplate에 100 μL씩 분주하고, 0.2 mM DPPH (Sigma-Aldrich) 용액 100 μL를 첨가하였다. 반응액은 빛을 차단한 상태로 실온에서 30 min간 반응시킨 다음, 517 nm에서 ELISA reader (800 TS; BioTek Instruments)로 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid (Sigma-Aldrich)을 사용하였으며, DPPH 라디칼 소거능은 대조군과 시료 처리군의 흡광도 차이를 이용하여 다음 식에 따라 백분율로 산출하였다.
DPPH radical scavenging activity (%)=(1-Asample/Acontrol)×100
여기서 Asample은 시료가 첨가된 반응액의 흡광도이며, Acontrol은 시료 대신 용매를 첨가한 대조 반응액의 흡광도를 의미한다.
6. ABTS 자유 라디칼 소거 활성 측정라벤더꽃 열수 추출물(LAFDE), 50% 에탄올 추출물(LAFEE) 및 발효 추출물(LAFFE)의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하였다. ABTS radical cation (ABTS·+)을 생성하기 위해 7 mM ABTS 용액(Sigma-Aldrich)과 2.45 mM potassium persulfate (Sigma-Aldrich)용액을 동량으로 혼합하고, 빛을 차단한 상태에서 16시간 동안 반응시켰다. 생성된 ABTS용액은 ethanol로 희석하여 734 nm에서의 흡광도가 0.70±0.02가 되도록 조정하였다. 각 추출물은 최종 농도가 500 및 1,000 μg/mL가 되도록 조제한 후 96-well microplate에 100 μL씩 분주하고, 조정된 ABTS용액 100 μL를 첨가하였다. 혼합액을 실온에서 반응시킨 다음, ELISA reader (800 TS; BioTek Instruments)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 다음 식에 따라 산출하였다.
APTS radical scavenging activity (%)=(1-Asample/Acontrol)×100
여기서 Asample은 추출물을 첨가한 반응액의 흡광도이고, Acontrol은 시료 대신 해당 용매를 첨가한 대조 반응액의 흡광도를 의미한다.
7. 세포독성 측정인간 각질형성세포주(spontaneously immortalized human keratinocyte line)인 HaCaT 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, USA)로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 세포는 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; Young In Frontier, Korea)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco, USA)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco)을 이용하여 배양하였다. LAFDE, LAFEE 및 LAFFE의 HaCaT 세포에 대한 독성은 MTT assay를 이용하여 평가하였다. 세포를 96-well plate에 2.0×104 cells/well의 농도로 분주한 후 37℃, 5% CO2조건에서 24시간 동안 배양한 후 LAFDE, LAFEE 및 LAFFE를 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 각 well의 배양액을 제거하고 MTT (Sigma-Aldrich)용액(1mg/mL) 100 μL를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후 상층액을 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO) 200 μL를 가하여 생존 세포에 의해 생성된 formazan 결정을 충분히 용해하였다. 흡광도는 ELISA reader (800 TS; BioTek Instruments) 를 이용하여 560 nm에서 측정하였다.
8. 세포증식효과UVB 조사 조건에서 LAFDE, LAFEE 및 LAFFE가 HaCaT 세포 (ATCC, USA)의 생존율에 미치는 영향을 MTT assay로 평가하였다. HaCaT 세포를 24-well plate에 1.0×105 cells/well의 농도로 분주하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후 각 추출물을 농도별로 처리한 다음, 세포에 8 mJ/cm2의 UVB를 조사하였다. UVB 조사 후 세포를 동일한 배양 조건에서 24시간 동안 배양한 후 기존 배양액을 제거하고 각 well에 MTT (Sigma-Aldrich)용액 100 μL를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 이후 MTT 용액을 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) 200 μL를 가하여 생존 세포의 대사활동으로 생성된 formazan 결정을 충분히 용해하였다. 흡광도는 ELISA reader (800 TS; BioTek Instruments)를 이용하여 560 nm에서 측정하였다.
9. Elastase 저해 활성UVB 조사 후 라벤더꽃 추출물이 HaCaT 세포의 elastase 활성에 미치는 영향을 평가하였다. HaCaT 세포를 60 mm culture dish에 2.0×106 cells/dish의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포에 8 mJ/cm2의 UVB를 조사한 다음 LAFDE, LAFEE 및 LAFFE 를 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양 후 phosphate-buffered saline (PBS)으로 세척한 후 PRO-PREPTM Protein Extraction Solution (INtRON Biotechnology, Korea)을 첨가하여 세포 내 단백질을 추출하였다. 세포 추출물은 4℃에서 15,000 rpm으로 30 min 간 원심분리하였으며, 회수한 상층액을 효소 활성 측정용 시료로 사용하였다. 추출된 단백질을 정량한 후 각 well에 단백질 100 μg을 분주하고, 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 부피를 88 μL로 조정하였다. 이어서 농도별로 조제한 LAFDE, LAFEE 또는 LAFFE 10 μL와 elastase 기질인 50 mM N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (STANA; Peptide Institute Inc., Japan) 2 μL를 순차적으로 첨가하여 최종 반응 부피를 100 μL로 맞추었다. 반응액은 37℃에서 90 min간 반응시켰으며, 기질 분해에 따라 생성된 p -nitroaniline의 흡광도를 ELISA reader (800 TS; BioTek Instruments)를 이용하여 405 nm에서 측정하였다.
10. Procollagen 생합성 및 MMP-1 저해 활성UVB 조사에 따른 type I procollagen 생성량의 변화를 확인하기 위해 HaCaT 세포를 60 mm culture dish에 2.0×106 cells/dish 의 농도로 분주하여 배양하였다. 세포에 8 mJ/cm2의 UVB를 조사한 후 LAFDE, LAFEE 및 LAFFE를 농도별로 처리하고 24시간 배양한 후 세포배양 상층액을 회수하였으며, 배양액에 존재하는 type I procollagen의 함량은 Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit (Takara Bio Inc., Japan)를 사용하여 제조사가 제시한 방법에 따라 측정하였다. MMP-1 활성을 평가하기 위해 HaCaT 세포를 96-well plate에 1.0×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 세포가 안정적으로 부착된 후 LAFDE, LAFEE 및 LAFFE를 설정된 농도별로 처리하고, 37℃와 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 각 처리군의 세포배양 상층액을 회수하여 분석 시료로 사용하였다. 배양액 내 MMP-1 활성은 Matrix Metalloproteinase-1 Biotrak Activity Assay Kit (RPN2610; Amersham Biosciences, UK)를 이용하여 제조사의 시험방법에 따라 측정하였다. 측정 결과는 무처리 대조군 또는 UVB 조사 대조군을 기준으로 상대적인 MMP-1 활성이나 저해율로 나타내었다.
11. 주름관련 유전자 발현변화LAFEE 및 LAFFE가 UVB에 노출된 HaCaT 세포의 유전자 발현에 미치는 영향을 real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR)으로 분석하였다. HaCaT 세포를 60 mm culture dish에 2.0×106 cells/dish의 농도로 분주한 후, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한 후 농도별 LAFEE 또는 LAFFE가 포함된 serum-free DMEM으로 교체하고 세포에 8 mJ/cm2의 UVB를 조사한 다음, 동일한 조건에서 24시간 동안 배양한 후 세포에서 TRIzolTM Reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 total RNA를 분리하였다. 추출한 RNA는 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Toyobo, Japan)를 이용하여 genomic DNA를 제거하고 complementary DNA (cDNA)로 역전사하였다. 표적 유전자의 발현량은 THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Toyobo)를 사용하여 CFX ConnectTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, USA)으로 측정하였다. qPCR 반응은 95℃에서 3 min간 초기 변성한 후, 95℃에서 10 s간 denaturing, 59℃에서 10 s간 annealing및 72℃에서 30 s간 extension 과정을 39회 반복하였다. 증폭이 완료된 후 각 시료에서 얻어진 quantification cycle (Cq) 값을 이용하여 유전자 발현량을 분석하였다. 표적 유전자인 MMP3, MMP9, MMP13, HAS2, FLG, KRT1, HYAL3 및 AQP3의 발현량은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 내부대조 유전자로 사용하여 정규화하였다. 각 처리군의 상대적 유전자 발현량은 무처리 대조군 또는 UVB 조사 대조군을 기준으로 2-ΔΔCq 방법을 이용하여 산출하였다. 분석에 사용한 primer 염기서열은 Table 1에 제시하였다.
Results and Discussion1. 라벤더꽃 추출물의 총 Polyphenol 및 Flavonoid 함량라벤더꽃 열수추출물(LAFDE), 50% 에탄올추출물(LAFEE) 및 발효추출물(LAFFE)의 총 polyphenol 및 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Figure 1과 2에 나타내었다. 총 polyphenol 함량은 LAFFE에서 281.27±29.54 μg GAE/g으로 가장 높게 나타났으며(Figure 1), 총 flavonoid 함량 또한 LAFFE에서 1,284.62±72.18 μg RE/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다(Figure 2). Polyphenol과 flavonoid 는 대표적인 천연 항산화 물질로서 자유라디칼 제거능과 산화적 스트레스 억제를 통해 세포 보호 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Peana et al., 2002; Hancianu et al., 2013). 본 연구에서 LAFFE의 polyphenol 및 flavonoid 함량이 증가한 것은 발효 과정에서 미생물 효소에 의해 고분자 phenolic compounds가 저분자 형태로 전환되고 결합형 페놀성 화합물이 유리형으로 전환되면서 추출이 증가하였기 때문으로 판단된다(Hur et al., 2014; Swain et al., 2014).
2. DPPH 및 ABTS Radical 소거 활성라벤더꽃 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH 및 ABTS radical scavenging activity를 측정한 결과를 Figure 3과 4에 나타내었다. 모든 시료에서 농도 의존적으로 radical scavenging activity가 증가하였으며(Figure 3), LAFFE에서 가장 우수한 활성을 나타내었다(Figure 4). DPPH radical scavenging assay의 IC50 값은 LAFFE가 128.53 μg/mL로 가장 낮았으며, ABTS radical scavenging assay에서도 34.29 μg/mL로 가장 우수한 활성을 보였다. 자외선 조사에 의해 생성되는 reactive oxygen species (ROS)는 lipid peroxidation, DNA damage 및 collagen degradation을 유도하여 피부 광노화를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Fisher et al., 2002; Rinnerthaler et al., 2015; Shin et al., 2024). 특히, LAFFE에서 나타난 우수한 항산화 활성은 증가된 polyphenol 및 flavonoid 함량과 관련성이 높은 것으로 판단되어진다(Hur et al., 2014; Koulivand et al., 2013).
3. Elastase 저해 활성UVB 조사된 HaCaT 세포에서 elastase inhibition activity를 측정한 결과를 Figure 5에 나타내었다. 모든 시료에서 농도의존적으로 elastase inhibition activity가 증가하였으며, LAFFE 처리군에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 특히, 16 μg/mL 농도에서 LAFFE는 약 80% 이상의 elastase inhibition activity를 나타내었다. Elastase는 진피층의 elastin을 분해하여 피부 탄력 감소와 주름 형성을 유도하는 효소로 알려져 있다(Quan et al., 2009). Polyphenol 및 flavonoid 계열 화합물은 elastase 활성을 저해하여 피부 탄력 유지와 주름 개선에 기여하는 것으로 보고되고 있다(Pillai et al., 2005).
4. Type I Procollagen 생성 효과UVB 조사된 HaCaT 세포에서 type I procollagen 생성량을 측정한 결과를 Figure 6에 나타내었다. 모든 시료 처리군에서 농도의존적으로 procollagen 생성량이 증가하였으며, LAFFE 처리군에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 특히, LAFFE는 16 μg/mL 농도에서 약 56% 수준의 procollagen 생성을 나타내었다. Type I procollagen은 피부 진피층을 구성하는 collagen의 전구체로 피부 구조 유지와 탄력 형성에 중요한 역할을 수행한다(Fisher et al., 2002). UVB 조사는 collagen 합성을 감소시키고 matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현을 증가시켜 collagen degradation을 촉진함으로써 피부 주름 형성을 유도하는 것으로 알려져 있다(Quan et al., 2009; Ko et al., 2025). 따라서 본 연구에서 확인된 LAFFE의 procollagen 생성 촉진 효과는 UVB에 의해 감소된 collagen 생합성을 회복시켜 피부 탄력 유지와 광노화 예방에 기여할 수 있음을 시사한다. 특히, 발효 과정에서 증가한 phenolic compounds 및 flavonoids가 collagen 생합성 경로를 활성화하여 procollagen 생성 증가에 관여하였을 것으로 판단된다(Hur et al., 2014; Kang et al., 2020).
5. MMP-1 생성 억제 효과UVB 조사된 HaCaT 세포에서 MMP-1 생성 억제 효과를 측정한 결과를 Figure 7에 나타내었다. UVB 조사에 의해 증가된 MMP-1 생성은 모든 시료 처리군에서 감소하였으며, LAFFE 처리군에서 가장 우수한 억제 효과를 나타내었다. MMP-1은 collagen type I을 분해하는 대표적인 효소로 피부 광노화 과정에서 중요한 역할을 수행한다(Fisher et al., 2002; Quan et al., 2009). UVB 조사에 의해 생성된 ROS는 AP-1 및 MAPK signaling pathway를 활성화하여 MMP-1 발현을 증가시키고 collagen degradation을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Choi et al., 2025; Rinnerthaler et al., 2015). 본 연구에서 LAFFE가 MMP-1 생성을 효과적으로 억제한 결과는 증가된 항산화 활성에 의해 ROS 생성이 감소하고 이에 따른 MMP-1 발현 조절이 이루어진 결과로 판단된다. 따라서 LAFFE는 collagen degradation 억제를 통해 피부 탄력 감소와 주름 형성을 예방할 수 있는 기능성 소재로 활용 가능성이 높은 것으로 생각되어진다.
6. 세포 생존율에 미치는 영향라벤더꽃 추출물의 세포독성을 평가하기 위하여 HaCaT 세포 생존율을 측정한 결과를 Figure 8A와 8B에 나타내었다. 모든 시료는 32 μg/mL 이하 농도에서 유의적인 세포독성을 나타내지 않았으며 (Figure 8A), UVB 조사에 의해 감소된 세포 생존율 역시 시료 처리에 의해 회복되는 경향을 나타내었다(Figure 8B). 특히, LAFFE는 16-64 μg/mL 농도에서 가장 우수한 세포 보호 효과를 나타내었다. UVB 조사에 의해 생성된 ROS는 세포막 손상, DNA 손상 및 미토콘드리아 기능 저하를 유발하여 세포 사멸을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Pillai et al., 2005). 반면 식물 유래 polyphenol 및 flavonoids는 활성산소 제거능을 통해 세포 손상을 감소시키고 세포 생존율을 향상시키는 것으로 보고되고 있다(Peana et al., 2002; Hancianu et al., 2013). 따라서 본 연구 결과는 LAFFE가 UVB에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 피부세포를 보호하는 효과를 가지는 것을 확인하였다.
7. MMPs mRNA 발현 억제 효과UVB 조사된 HaCaT 세포에서 MMP-3, MMP-9 및 MMP-13 mRNA 발현을 분석한 결과를 Figure 9A, B, C에 나타내었다. MMP-3 mRNA 발현 분석 결과, UVB를 조사한 후 추출물들을 농도별로 처리시 발현이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(Figure 9A, p<0.05). 특히, LAFFE는 LAFEE보다 4 μg/mL 이상 농도에서 강한 억제 효과를 나타내었다. MMP-9 mRNA 발현 분석 결과에서도 UVB 조사에 의해 발현 수준이 크게 증가하였다. LAFFE 처리에서는 농도 의존적으로 MMP-9 발현이 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 4 μg/mL 이상 농도에서 급격한 감소 효과를 나타내었다(p<0.05). 특히, 16 μg/mL 농도에서는 정상군 수준에 가까운 발현 억제 효과를 나타내었다(Figure 9B). MMP-13 mRNA 발현 분석 결과, HaCaT 세포에 UVB를 조사 후 LAFEE를 농도별로 처리시 농도의존적으로 발현이 감소하였으며(p<0.05), MMP-13 mRNA 발현은 LAFFE를 처리한 것보다 더 강한 발현 억제를 보였다(Figure 9C). MMP-3는 다양한 extracellular matrix 단백질의 분해에 관여하며, MMP-9은 염증 반응과 조직 재형성 과정에 중요한 역할을 수행하는 것으로, MMP-13은 collagen degradation을 유도하는 대표적인 효소로 알려져 있다(Quan et al., 2009; Rinnerthaler et al., 2015). 이러한 MMPs의 과발현은 피부 진피층 구조 붕괴와 광노화를 촉진하는 주요 원인으로 보고되고 있다(Fisher et al., 2002). 본 연구에서 LAFFE가 MMP-3, MMP-9 및 MMP-13 발현을 효과적으로 억제한 결과는 발효추출물이 피부 구조 안정성을 유지하고 extracellular matrix 손상을 감소시키는 데 기여할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 항산화 활성이 우수한 발효추출물은 ROS-mediated signaling pathway를 억제함으로써 MMPs 발현 감소에 기여한 것으로 생각되어진다(Hur et al., 2014; Kang et al., 2020).
8. 피부 장벽 및 보습 관련 유전자 발현 효과피부 장벽 및 보습 관련 유전자 발현을 분석한 결과를 Figure 10에 나타내었다. FLG, KRT1, HAS-2, HYAL3 및 AQP3 발현은 모든 시료 처리군에서 증가하였으며, 특히 LAFFE 처리군에서 가장 우수한 발현 증가 효과를 나타내었다. HaCaT 세포에서 라벤더꽃의 LAFEE와 LAFFE가 UVB에 의해 변화된 피부 장벽 및 보습 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하였다. FLG 와 KRT1 발현은 LAFEE와 LAFFE 모두에서 농도의존적으로 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 특히, LAFFE 8-16 μg/mL 농도에서 강하게 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 10A, B, p<0.05). HAS-2와 AQP3 역시 유사한 경향을 보였으며, 농도 증가에 따라 발현이 점진적으로 증가하였다(Figure 10C, E). 특히, LAFFE 의 8-16 μg/mL 농도에서 강한 발현 증가를 나타내어 수분 유지 및 히알루론산 합성 관련 기능 개선에 기여할 가능성을 확인하였다. HYAL3의 발현 역시 LAFFE에서 농도의존적으로 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 16 μg/mL 농도에서 특히 강한 발현을 보였다(Figure 10D, p<0.05). 결과적으로, 라벤더꽃 모든 추출물에서 UVB로 인해 저하된 피부 장벽 및 보습 관련 유전자(FLG, KRT1, HAS-2, AQP3)의 발현을 농도 의존적으로 증가시켰으며, LAFFE가 LAFEE에 비해 전반적으로 더 강한 발현 증가 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 라벤더꽃 발효추출물(AMFFE)이 피부 장벽 강화 및 보습 기능 개선에 효과적인 소재로 활용될 수 있음을 나타낸다. Filaggrin (FLG)과 keratin 1 (KRT1)은 표피 장벽 형성과 각질 세포 분화에 중요한 역할을 수행하며, 피부 보호 기능 유지에 필수적인 인자로 알려져 있다(Verdier-Sévrain & Bonté, 2007). 또한 hyaluronan synthase-2 (HAS-2)는 hyaluronic acid 생합성에 관여하고 aquaporin-3 (AQP3)는 피부 내 수분 이동과 보습 유지에 중요한 역할을 담당한다(Boury-Jamot et al., 2006). 최근 연구에서는 식물 유래 발효추출물이 FLG와 AQP3 발현을 증가시켜 피부 장벽 기능과 보습 효과를 개선하는 것으로 보고되고 있다(Park & Bae, 2016; Kang et al., 2020).
Conclusion본 연구에서는 라벤더꽃의 열수추출물(LAFDE), 50% 에탄올추출물(LAFEE) 및 발효추출물(LAFFE)의 항산화 활성과 UVB 유도 피부노화 개선 효과를 비교 평가하였다. 총 polyphenol 및 flavonoid 함량 분석 결과, LAFFE에서 가장 높은 함량을 나타내었으며, DPPH 및 ABTS radical scavenging activity에서도 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 또한 UVB 조사된 HaCaT 세포에서 elastase inhibition activity 및 type I procollagen 생성량이 농도의존적으로 증가하였고, 특히 LAFFE 처리군에서 가장 우수한 활성을 나타내었다. UVB 조사에 의해 증가된 MMP-1 생성과 MMP-3, MMP-9 및 MMP-13 mRNA 발현은 LAFFE 처리에 의해 효과적으로 억제되었으며, 피부 장벽 및 보습 관련 유전자인 filaggrin (FLG), keratin 1 (KRT1), hyaluronan synthase-2 (HAS-2), hyaluronidase-3 (HYAL3) 및 aquaporin-3 (AQP3) 발현은 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 모든 시료는 실험 농도 범위에서 유의적인 세포독성을 나타내지 않았으며, 발효추출물은 UVB-induced oxidative stress로부터 피부 세포를 보호하는 효과를 나타내었다. 라벤더꽃 발효추출물(LAFFE)은 항산화 활성, collagen synthesis 촉진, elastase 및 matrix metalloproteinases (MMPs) 억제, 피부 장벽 강화 및 보습 개선 효과를 동시에 나타내어 피부 광노화 개선에 효과적인 기능성 소재로 활용 가능성이 높은 것으로 사료된다.
따라서 본 연구 결과는 라벤더꽃 발효추출물이 항산화 및 피부노화 개선 기능성 화장품 소재로서 활용될 수 있는 기초자료를 제공할 것으로 기대된다.
NOTESAuthor's contribution
N.P. performed the antioxidant assays, cell culture experiments, and data analysis. S.M.C. contributed to the molecular biological experiments, including quantitative real-time PCR analysis and interpretation of the results. M.J.C. prepared the lavender flower extracts and fermented extracts and participated in experimental design and sample preparation. J.D.C. conceived and designed the study, supervised the overall research project, analyzed and interpreted the data, and prepared and revised the manuscript. All authors reviewed and approved the final manuscript.
Author details
Nanyoung Paek (Chairperson), Semiwon Foundation, 93 Yangsu-ro, Yangseo-myeon, Yangpyeong-gun, Gyeonggi-do 12584, Korea; Su-Mi Cha (Research Assistant), Department of Oral Microbiology, School of Dentistry, Jeonbuk National University, 567 Baekje-daero, Deokjin-gu, Jeonju-si, Jeonbuk State 54896, Korea; Myung-Ja Cho (Adjunct Professor), Department of Forest Healing, Jeonju Kijeon College, 267 Jeonjucheonseo-ro, Wansan-gu, Jeonju-si, Jeonbuk State 55069, Korea; Jeong-Dan Cha (Adjunct Professor), Department of Forest Healing, Jeonju Kijeon College, 267 Jeonjucheonseo-ro, Wansan-gu, Jeonju-si, Jeonbuk State 55069, Korea.
Figure 1.Total phenolic contents of the water (LAFDE), 50% ethanol (LAFEE), and fermented extracts (LAFFE) from L. angustifolia flower at various concentrations.Results are expressed as μg gallic acid equivalents per g of extract and presented as mean ±S.D. from three independent experiments.
Figure 2.Total flavonoid contents of the water (LAFDE), 50% ethanol (LAFEE), and fermented extracts (LAFFE) from L. angustifolia flower at various concentrations.Results are expressed as μg rutin equivalents per g of extract and presented as mean± S.D. from three independent experiments.
Figure 3.DPPH radical scavenging activity of the water (LAFDE), 50% ethanol (LAFEE), and fermented extracts (LAFFE) from L. angustifolia flower at various concentrations.Results are presented as mean±S.D. from three independent experiments.
Figure 4.ABTS+ radical scavenging activity of the water (LAFDE), 50% ethanol (LAFEE), and fermented extracts (LAFFE) from L. angustifolia flower at various concentrations.Results are presented as mean±S.D. from three independent experiments.
Figure 5.Effect of the water extract (LAFDE), 50% ethanol extract (LAFEE), and fermented extract (LAFFE) from L. angustifolia flower on elastase inhibition in UVB-irradiated HaCaT cells.HaCaT cells were treated with various concentrations (2-16 μg/mL) of the LAFDE, LAFEE, and LAFFE from L. angustifolia flower for 24 h after exposure to UVB irradiation (8 mJ/cm²). Elastase inhibition levels were measured under each condition using an elastase substrate (N-STANA; N-succinyl-tri-alanyl-p-nitroanilide), as described in the Materials and Methods section. All data are presented as mean±standard deviation (SD) from three independent experiments. Asterisks (*) indicate a statistically significant difference compared with the UVB-treated group for each sample at different concentrations (p<0.05).
Figure 6.Effects of the water extract (LAFDE), 50% ethanol extract (LAFEE), and fermented extract (LAFFE) from L. angustifolia flower on Type I procollagen production in UVBirradiated HaCaT cells.HaCaT cells were treated with various concentrations (2-16 μL/mL) of the LAFDE, LAFEE, and LAFFE from L. angustifolia flower for 24 h following UVB irradiation. Type I procollagen levels were measured under each condition and expressed as a percentage of the non-irradiated control (UVB−). Data are presented as mean±standard deviation (SD) from three independent experiments. Asterisks (*) indicate a statistically significant difference compared with the UVB-treated group for each sample at different concentrations (p<0.05). The control represents the UVB-treated group.
Figure 7.Effect of Effects of the water extract (LAFDE), 50% ethanol extract (LAFEE), and fermented extract (LAFFE) from L. angustifolia flower on MMP-1 production in UVB-irradiated HaCaT cells.HaCaT cells were exposed to UVB irradiation (8 mJ/cm²) and subsequently treated with various concentrations (0-16 μg/mL) of the LAFDE, LAFEE, and LAFFE. A non-irradiated group (UVB−) and UVB-irradiated untreated control (UVB+, 0 μg/mL) were included for comparison. After incubation, MMP-1 levels in the culture supernatant were quantified using an appropriate assay method, as described in the Materials and Methods section. Results are expressed as mean±standard deviation (SD) from three independent experiments. Asterisks indicate a significant difference from the UVB-treated groups (*p<0.05).
Figure 8.Effects of the water extract (LAFDE), 50% ethanol extract (LAFEE), and fermented extract (LAFFE) from Lavandula angustifolia flower on cell viability in HaCaT cells and UVB-irradiated HaCaT cells.Cells were treated with various concentrations of the extracts for 24 h after UVB irradiation. Cell viability was determined using the MTT assay. Results are presented as mean±S.D. from three independent experiments. The control group consisted of cells not exposed to UVB irradiation.
Figure 9.Effects of the ethanol extract (LAFEE) and fermented extract (LAFFE) from Lavandula angustifolia flower on MMP-3, -9, and -13 mRNA expression in UVB-irradiated HaCaT cells.HaCaT cells were exposed to UVB irradiation (8 mJ/cm²) and subsequently treated with various concentrations (0–16 μg/mL) of LAFEE and LAFFE from L. angustifolia flower. A non-irradiated control group (UVB−) and UVB-irradiated untreated control (UVB+, 0 μg/mL) were included. Total RNA was isolated, and MMP-3, -9, and -13 mRNA expression levels were analyzed by quantitative real-time PCR and normalized to β-actin. Results are presented as mean±standard deviation (SD) from three independent experiments. Asterisks (*) indicate a statistically significant difference compared with the UVB-treated group for each sample at different concentrations (p<0.05). The control represents the UVB-treated group.
Figure 10.Effects of the ethanol extract (LAFEE) and fermented extract (LAFFE) from Lavandula angustifolia flower on skin barrier- and hydration-related gene expression in UVB-irradiated HaCaT cells.HaCaT cells were exposed to UVB irradiation (8 mJ/cm²) and subsequently treated with various concentrations (0–16 μg/mL) of the LAFEE and LAFFE from L. angustifolia flower. A non-irradiated control group (UVB−) and UVB-irradiated untreated control (UVB+, 0 μg/mL) were included. Total RNA was isolated, and the mRNA expression levels of filaggrin (FLG), keratin 1 (KRT1), hyaluronan synthase 2 (HAS-2), hyaluronidase 3 (HYAL3), and aquaporin 3 (AQP3) were analyzed by quantitative real-time PCR and normalized to β-actin. Results are presented as mean±standard deviation (SD) from three independent experiments. Asterisks (*) indicate a statistically significant difference compared with the UVB-treated group for each sample at different concentrations (p<0.05). The control represents the UVB-treated group.
Table 1.Sequences of the specific target genes ReferencesAdaszyńska M, Skwirzyńska M, Dzięcioł M, Dobrowolska A. Comparison of chemical composition and antimicrobial activity of lavender varieties from Poland. Natural Product Research 27: 1497-1501. 2013.
Białoń M, Krzyśko-Łupicka T, Nowakowska-Bogdan E, Wieczorek PP. Chemical composition of two different lavender essential oils and their effect on facial skin microbiota. Molecules 24: 3270-3281. 2019.
Boury-Jamot M, Sougrat R, Tailhardat M, Varlet B, Bonté F, Dumas M, Verbavatz J. Expression and function of aquaporins in human skin: is aquaporin-3 just a glycerol transporter? Biochimica et Biophysica Acta (BBA)—Biomembranes 1758: 1034-1042. 2006.
Cavanagh HMA, Wilkinson JM. Biological activities of lavender essential oil. Phytotherapy Research 16: 301-308. 2002.
Cavanagh HMA, Wilkinson JM. Lavender essential oil: a review. Australian Infection Control 10: 35-37. 2005.
Choi YJ, Lee JM, Bae S. Effects of Helichrysum italicum essential oil on type I procollagen promotion and MMP-1 expression in human dermal fibroblasts and clinical efficacy for wrinkle improvement. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 23: 501-512. 2025.
Dai J, Mumper RJ. Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules 15: 7313-7352. 2010.
Do QD, Angkawijaya AE, Tran-Nguyen PL, Huynh LH, Soetaredjo FE, Ismadji S, Ju YH. Effect of extraction solvent on total phenol content, total flavonoid content, and antioxidant activity of Limnophila aromatica. Journal of Food and Drug Analysis 22: 296-302. 2014.
Fisher GJ, Kang S, Varani J, Bata-Csorgo Z, Wan Y, Datta S, Voorhees JJ. Mechanisms of photoaging and chronological skin aging. Archives of Dermatology 138: 1462-1470. 2002.
Hancianu M, Cioanca O, Mihasan M, Hritcu L. Neuroprotective effects of inhaled lavender oil on scopolamine-induced dementia via anti-oxidative activities in rats. Phytomedicine 20: 446-452. 2013.
Hur SJ, Lee SY, Kim YC, Choi I, Kim GB. Effect of fermentation on the antioxidant activity in plant-based foods. Food Chemistry 160: 346-356. 2014.
Park MJ, Bae YS. Fermented Acanthopanax koreanum root extract reduces UVB- and H2O2-induced senescence in human skin fibroblast cells. Journal of Microbiology and Biotechnology 26: 1224-1233. 2016.
Ko HS, Lee W, Ryu SJ, Choi IW, Han JS. Antioxidant, antiinflammatory, and wrinkle-improving effects of PDRN extracted from marine plants. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 23: 399-409. 2025.
Koulivand PH, Khaleghi Ghadiri M, Gorji A. Lavender and the nervous system. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2013: 681304. 2013.
Kang YM, Hong CH, Kang SH, Seo DS, Kim SO, Lee HY, Sim HJ, An HJ. Anti-photoaging effect of plant extract fermented with Lactobacillus buchneri on CCD-986sk fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Journal of Functional Biomaterials 11: 3. 2020.
Lis-Balchin M. Lavender: the genus Lavandula. Taylor & Francis. London. pp1-450. 2002.
Peana AT, D'Aquila PS, Panin F, Serra G, Pippia P, Moretti MDL. Anti-inflammatory activity of linalool and linalyl acetate constituents of essential oils. Phytomedicine 9: 721-726. 2002.
Pillai S, Oresajo C, Hayward J. Ultraviolet radiation and skin aging: roles of reactive oxygen species, inflammation and protease activation. International Journal of Cosmetic Science 27: 17-34. 2005.
Prusinowska R, Śmigielski KB. Composition, biological properties and therapeutic effects of lavender (Lavandula angustifolia L.). A review. Herba Polonica 60: 56-66. 2014.
Quan T, Qin Z, Xia W, Shao Y, Voorhees JJ, Fisher GJ. Matrix-degrading metalloproteinases in photoaging. The Journal of Investigative Dermatology. Symposium Proceedings 14: 20-24. 2009.
Rinnerthaler M, Bischof J, Streubel MK, Trost A, Richter K. Oxidative stress in aging human skin. Biomolecules 5: 545-589. 2015.
Shin SY, Park S, Liu B. Evaluation of antioxidant and anti-aging effects of Hawaiian Sandalwood (Santalum paniculatum) essential oil as a cosmetic ingredient. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 22: 609-618. 2024.
Swain MR, Anandharaj M, Ray RC, Parveen Rani R. Fermented fruits and vegetables of Asia: a potential source of probiotics. Biotechnology Research International 2014: 250424. 2014.
Upson T, Andrews S. The Genus Lavandula. Timber Press. Portland. pp1-442. 2004.
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||