시험에 사용한 로열젤리는 한국양봉협회 (Korea)로부터 2019년에 채취한 생 로열젤리를 구입 후 동결건조하여 사용하였다. 동결건조 한 로열젤리의 10-HDA 함량 분석은 Ultra high performance liquid chromatography (UPLC; Waters, USA)을 사용하였다(Kim et al., 2014). 동결건조한 로열젤리의 수분, 단백질 등은 분석하였다. 동결건조 로열젤리를 용량플라스크에 넣은 후 메탄올을 사용하여 5 mg/mL의 농도가 되도록 만들고 40℃에서 30 min 간 초음파 추출기를 사용하여 추출한 후 0.2 μm 필터를 사용하여 여과하였다. 표준품 10-HAD (Nacalai tesque, Japan) 역시 로열젤리와 동일한 방법으로 전처리 하였다.

생로열젤리와 동결건조 로열젤리의 수분 분석은 식품공전의 일반 시험법 식품성분시험법에 따라 상압가열건조법을 사용하여 분석하였다. 조단백질과 조지방, 회분 역시 식품공전 일반시험법 식품성분 시험법으로 분석하였다(KFDA, 2019c). 10-HDA 분석은 식품공전 로열젤리가공식품 10-HDA분석법에 따라 고속액체크로마토그래피(HPLC; Agilent, USA)를 이용하여 정량분석 하였으며10-HDA를 표준품으로 사용하였다(KFDA, 2019c). 비타민 조성은 건강식품 공전의 비타민 시험법에 따라 시료의 전처리 및 함량 분석을 실시하였다. 무기질 중 나트륨(Na), 마그네슘(Mg), 칼륨(K), 칼슘(Ca), 망간(Mn), 철(Fe), 구리(Cu), 아연(Zn), 인(P)은 식품공전의 일반시험법과 건강기능식품공전의 건강기능식품 시험법에 제시된 건식분해법에 따라 검체를 건조하여 탄화시키고 450-550℃에서 완전히 회화시킨 후 염산을 추가하여 유리여과기로 여과한 다음 유도 결합 플라즈마 발광분석기 (ICAP 7400 Duo; Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 함량을 측정하였다. 몰리브덴(Mo) 및 셀레늄(Se) 역시 건식분해법에 의하여 시료를 전처리하고 함량 분석은 Agilent ICP-MS 7700 (Santa Clara, USA)을 사용하였다. 염소(Cl) 분석은 식염 1 g을 함유하는 양의 검체를 회화시킨 후 물에 녹이고 여과하여 크롬산 칼륨시액을 첨가한 다음 질산은 용액으로 적정하여 염소의 양을 산출하였다.

본 연구에서 사용된 각질형성세포(HaCaT cell)는 한국세포주은행(Korea)으로 구입하여 사용하였다. HaCaT 세포는 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS; Thermo Fisher Scientific, USA)와 1% penicillin/strptomycine (penicillin 100 IU/mL, streptomycin 100 μg/mL; Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

동결건조 로열젤리와 10-HDA 대한 HaCaT 세포 생존율 및 증식 효능은 EZ-Cytox cell viability assay kit (Dogen, Korea)를 사용하여 측정하였다. HaCaT세포를 96 well plate에 최종 농도가 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24h 배양하였다. 배양 된 세포에 동결건조 로열젤리와 10-HDA를 각각 다양한 농도별로 처리하고 24 h 배양 후 EZ-Cytox 시약 10 μL를 처리한 다음 4 h 동안 배양 후 microplate reader (BioSurplus; Spectramax M2, USA)를 이용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 재생 효능은 대조군에 대한 생존율로 나타내었다.

피부 상처 세포 모델(wound healing assay)은 HaCaT세포를 6 well plate에 최종 농도가 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 세포가 90% 이상 증식한 상태가 될 때까지 배양하였다(Kim et al., 2019). 충분히 세포가 안정화 되었을 때 멸균한 200 μL pipette tip (Thermo Fisher, USA)으로 배양 접시를 긁어 상처를 유도하였다. 동결건조 로열젤리와 10-HDA를 농도별로 처리 한 후 시간대별로 세포의 이동 정도를 현미경 (EVOS XL core; Thermo Fisher, USA)을 이용하여 관찰하였다. 또한 재생 효능은 EZ-Cytox cell viability assay kit를 사용하여 측정하였다.

HaCaT 세포는 6 well plate에 3×10⁴ cells/mL로 분주한 다음 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24 h 배양 후 PBS로 세척한 다음 UVB lamp (LF-215.LM; UVITEC Cambridge, UK)를 이용하여 4 mW/cm² 조사량을 10 s 노출시켜 40 mJ/cm²으로 조사하였다(Ryu et al., 2019). 양성대조군인 vitamin C, 동결건조 로열젤리와 10-HDA를 농도별 처리하고 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 MMP-1,3의 발현은 human MMP-1 ELISA kit (Abcam, UK)와 human MMP-3 ELISA kit (Abcam)를 사용하여 프로토콜에 따라 측정하였다. MMP-1 또는 MMP-3 항체가 코팅 된 plate에 배양액 및 antibody cocktail을 각각 50 μL/well씩 분주한 후 1 h 동안 실온에서 반응하였다. 세척작업 3회 후 TMB solution 100 μL/well를 첨가하여 암 조건에서 10 min 간 발색 반응한 후 stop solution 100 μL/well를 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

HaCaT 세포를 6 well plate에 3×10⁴ cells/mL 농도로 24 h 배양한 후 PBS로 세척한 다음 UVB lamp를 이용하여 40 mJ/cm²으로 조사하였다. 양성대조군인 vitamin C, 동결건조 로열젤리와 10-HDA를 농도별 처리하고 24 h 동안 배양하였다. Total RNA 분리는 RNeasy mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하였고 제조사의 권장 방법에 따라 사용하였다. 먼저 상층액을 제거하고 PBS로 1회 washing 후 RLT buffer를 가하여 세포를 용해한 뒤 70% 에탄올을 첨가하여 total RNA를 추출하였다. cDNA합성은 PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis kit (Takara, Japan)를 이용하여 진행하였다. PCR tube에 total RNA 6 μL와 random hexamer 1 μL, dNTP mixture 1 μL, RNase free water 2 μL를 첨가하여 65℃ 5 min, 4℃에서 5 min 반응시켰다. 이후 반응물에 5X buffer 4 μL, primescript RTase 1 μL, RNase inhibitor 0.5 μL, RNase free water 4.5 μL를 혼합하여 30℃ 10 min, 42℃ 1 h, 95℃ 5 min 반응을 통하여 cDNA를 합성하였다. 타깃 mRNA 발현을 평가하기 위하여 real-time PCR은 SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japan)를 이용한 후 CFX96 touch real-time PCR detection system (Biorad, USA)에서 수행하였다. PCR증폭은 95℃에서 10 min 동안 예비 가열 후 denaturation은 94℃에서 20 s, annealing은 각 specific primer sequences에 맞는 온도에서 20 s, extension은 72℃에서 30s의 조건으로 40회 반복하였으며, 72℃에서 10 min 동안 안정화 과정을 진행하였다. 각각의 specific primer sequence는 Table 1과 같다.

R 통계프로그램 (R project, Australia)을 이용하여 각 군간의 비교 분석을 위하여 Duncan's multiple range test를 실시하여 검정하였고 p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

시험에 사용한 동결건조 로열젤리는 국내 양봉농가에서 생산한 로열젤리를 동결건조하여 시험에 사용하였다. 동결건조 로열젤리의 주요 영양성분 및 10-HDA 함량은 Table 2와 같다. 시험에 사용한 국산 동결건조 로열젤리는 우리나라 식품공전의 동결건조 로열젤리 제품의 규격 기준인 수분 함량 5% 이하, 단백질 함량은 30에서 41% 그리고 10-HDA함량 4%이상 조건을 모두 충족하였으며 10-HDA함량은 기준규격보다 30% 이상 함량이 높았다(KFDA, 2019b). 로열젤리는 비타민B1, B2 그리고 Niacine (B6)이 확인되었으며 niacin 함량이 매우 높았다(Figure 1A). 또한 무기물 성분도 풍부했으며, 특히 칼륨과 마그네슘, 칼슘 함량이 높은 것으로 확인되었다(Figure 1B). 국산 동결건조 로열젤리는 높은 10-HDA, 단백질 그리고 비타민과 무기물 성분으로 기존의 생로열젤리의 저장 및 이용에 있어 단점을 보완할 수 있어 다양한 식품 소재로 활용 가능성이 높아졌다.

피부 각질형성세포는 피부 재생과 상처치유 등 피부조직의 재형성 과정에서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Choung et al., 2013). 피부 각질형세포인 HaCaT 세포주는 화학적 또는 물리적 자극에 의한 손상을 받게 되면 다양한 케모카인(chemokine)과 사이토카인이 발현됨과 동시에 피부 손상 부위로 이동하여 피부 세포의 증식을 유도한다고 알려져 있다(Choung et al., 2013). 10-HDA는 로열젤리의 주요 지표 물질로 항암, 항균, 항염증 등 다양한 분야에 생리활성효과를 나타내는 것으로 보고되어 왔으며(Fujiwara et al., 1990; Nagai & Inoue, 2004; Han et al., 2011) 피부세포 증식 및 상처 치유에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Lin et al., 2019). 본 연구에서는 국산 동결건조 로열젤리의 피부 항노화 기능성 화장품 소재로 개발하고자 HaCaT세포를 활용하여 10-HDA의 피부세포의 성장 및 이주능을 평가하고자 하였다. 동결건조 로열젤리 및 10-HDA의 HaCaT세포에 대한 독성을 보이지 않는 실험 최대 농도를 설정하기 위하여 세포독성을 평가하였다. Figure 2에서 보는 바와 같이 동결건조 로열젤리는 100 μg/mL 이상에서도 세포 독성을 유발하지는 않았으나 100 μg/mL 이상의 농도로 처리했을 경우엔 동결건조 로열젤리가 충분히 용해 되지 않아 배지가 혼탁해지는 것을 확인할 수 있었다. 10-HDA 역시 1,000 μM 이상에서도 세포 독성은 유발하지 않았으나 배지가 혼탁해지는 것을 알 수 있었다. 이러한 연구결과를 바탕으로 배지에 충분히 용해 될 수 있는 실험 최대 농도로 동결건조 로열젤리는 100 μg/mL, 10-HDA는 1,000 μM 이내로 설정하고 이 범위 내에서 피부세포의 재생 효과를 검증하고자 피부세포상처 모델(wound healing assay)을 이용하여 동결건조 로열젤리와 10-HDA의 피부세포 재생 및 이주능을 평가하였다.

Figure 3과 같이 동결건조 로열젤리는 100 μg/mL 의 농도에서 피부세포 재생율이 가장 높았으며, 10-HDA에서는 100 μM로 처리한 시험구에서 세포 재생율이 가장 높았다. Figure 4와 같이 HaCaT 세포에 동결건조 로열젤리와 10-HDA를 각각 농도별로 처리했을 때 농도 및 시간 의존적으로 무 처리구에 비하여 세포 성장 및 세포이동이 증가하는 것으로 확인되었다. 동결건조 로열젤리 100 μg/mL의 농도와 10-HDA 100 μM 농도에서 48 h 후 HaCaT 세포의 성장 및 이동한 면적은 양성 대조군으로 사용한 vitamin C와 같은 효과를 나타내었다. 따라서 이러한 결과를 통해 국산 동결건조 로열젤리 및 지표 성분인 10-HDA의 피부세포 성장과 이주를 촉진함으로써 피부세포의 증식을 유도하는 것으로 확인되었다.

노화와 자외선 등으로 인한 피부 노출은 MAPK (mitogen-activated protein kinase)를 활성화시킨다(KFDA, 2019a). MAPK에서 가장 많이 영향을 받는 인자는 AP-1이다. AP-1은 Jun과 Fos family 단백질로 이루어진 전사인자로 c-Jun과 c-Fos의 heterodimer 형태로 존재 할 때 전사활성이 가장 높다. 사람의 피부가 자외선에 노출되지 않았을 때는 c-Fos와 JunD의 이합체로 존재하나, 자외선, 외부 환경적 자극 등에 의하여 c-Jun과 c-Fos 단백질의 발현이 증가하게 되고, c-Jun은 JNK와 p38에 의한 인산화에 의하여 활성화된다(KFDA, 2019a). AP-1은 세포와 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력히 조절한다(Scharffetter-Kochanek et al., 2000). MMPs는 zinc이온을 요하는 endoprotease로 세포외기질 단백질을 분해하는 효소이다. AP-1에 의해 발현이 조절되는 MMP중 MMP-1은 collagenase 1으로 알려져 있으며, typeⅠ와 Ⅲ collagen을 기질로 한다. MMP-3는 stromelysin 1이라고도 하며, 기저막의 type Ⅳ collagen을 분해하며 zymogen인 proMMP-1을 활성화시킨다. MMP-9은 gelatinase B로 collagenase에 의해 분해된 산물을 더 작게 가수분해한다(Pyun et al., 2012). 자외선에 의하여 MMP-1가 fibillar collagen (types Ⅰ와 Ⅲ)으로 쪼개면서 콜라겐을 분해시키고, 연이어 MMP-3, MMP-9를 증가시킨다. 따라서 MMP-1과 MMP-3의 발현을 억제함으로써 피부 노화 억제 및 손상된 피부의 재생을 유도하는 주요한 요인이 될 수 있다(Pyun et al., 2012). 본 연구에서는 피부세포 성장과 이주에 효과적인 동결건조와 10-HDA를 각각 HaCaT 세포에 다양한 농도별로 처리했을 때의 MMP-1과 MMP-3 효소 발현량을 ELISA kit를 이용하여 조사하였다. 그 결과 동결건조 로열젤리와 10-HDA 를 처리했을 때 MMP-1과 MMP-3의 발현량이 무 처리군에 비해 유의하게 감소되는 것으로 확인되었다(Figure 5). 특히 동결건조 로열젤리의 농도 100 μg/mL과 10-HDA는 농도 100 μM에서 MMP-1과 MMP-3의 발현이 가장 크게 억제되는 것으로 확인되었다.

동결건조 로열젤리와 10-HDA는 UVB 조사에 의해 발현이 증가된 MMP-1과 MMP-3 발현을 대조군 대비 유의한 수준으로 감소시키는 것으로 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 피부 세포 성장과 이주에 효과적인 동결건조 로열젤리 100 μg/mL 와 10-HDA 100 μM를 각각 HaCaT 세포에 처리했을 때의 MMP-1과 MMP-3유전자의 발현량을 조사하였다. 그 결과 동결건조 로열젤리와 10-HDA를 처리했을 때 UVB 조사에 의해 증가된 MMP-1과 MMP-3의 유전자 발현량은 대조군 대비 유의하게 감소 되는 것으로 확인되었다(Figure 6). 이를 통해 동결건조 로열젤리와 10-HDA는 손상된 피부의 재생과 이주는 물론 피부 노화 억제에도 효과가 있음을 확인하였다.