Introduction
탈모는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 생명에 지장은 없지만 삶의 질을 떨어뜨리는 현대인의 대표적인 질환이다. 현재 미용에 대한 관심이 높아지면서 탈모 치료에 대한 요구가 증대됨에 따라 다양한 치료방법이 시도되고 있다. 대표적으로는 미녹시딜이 포함된 외용제와 피나스테리드인 내복약 등이 치료제로 사용되고 있으나, 두피 건조, 가려움, 피부 자극, 성욕 감퇴, 발기 부전 등의 부작용이 수반되고 있다(Pinnell & Murad, 1987; Jang et al., 2015; Kim et al., 2019a; Kim & Park, 2020).
최근 천연 식물 추출물로부터 부작용이 없고 모발성장 및 재생에 효과적인 연구가 추진되고 있다. 특히, 황칠 열수 추출물에서 분리한 베타-시토스테롤(β-sitosterol)이 다양한 피부개선 효과와 탈모방지에 효과가 있는 것으로 보고되었다(Lee et al., 2015a). 또한, 신안 비금도산 천일염은 높은 미네랄을 함유하고 있으며, 피부의 수분보호, 피부미용 및 두피케어 등에 도움을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2014; Kim et al., 2015). 그 외에도 면역력 강화, 천식 완화, 심혈관 보호, 근육통 완화, 소화 촉진 및 우울증 해소 등 다양한 효능이 입증되고 있다. 또한 시금치와 다시마는 항산화 활성과 미네랄 성분이 함유되어 두피 건강에 도움을 준다고 알려져 있다(Lee et al., 2015b; Jung et al., 2019).
본 연구에 앞서 황칠, 천일염, 시금치 및 다시마 등의 열수 추출물, 30% 주정 추출물과 60% 주정 추출물에서 이미 세포독성, 세포증식율, 항염증 및 항균활성 등 안전성 및 유효성을 확인한 바 있다(Choi et al., 2021). 특히, 열수 추출물들은 주정 추출물들에 비해 높은 안전성과 최적 농도 범위내에서 세포증식율, 항염증 등 탈모 증상 완화에 도움을 줄 수 있는 화장품 소재로 그 기능성을 확인하였다.
따라서, 본 연구에서는 전남산 황칠, 천일염, 시금치 및 다시마 등의 추출물을 일정비율 배합하여 탈모증상 완화에 도움을 줄 수 있는 최적 배합비율(optimal mixing ratio, OMR)을 선정함으로써 향후 기능성 화장품 원료로 사용하기 위한 안전성 및 유효성을 검증하고자 한다.
Materials & Methods
1. 시료 준비
본 연구의 원재료인 황칠(Dendropanax)은 전남 장흥산으로 그 잎과 잔가지를 세척 후, 실내에서 자연 건조하여 사용하였으며, 신안 비금도산 천일염(sea salt)은 탈수 후, 가는 입자로 가공 및 멸균하여 사용하였다. 또한 신안 비금도산 시금치(spinach)는 구입하여 세척 후 50℃, 12 h 열풍 건조하여 사용하였고, 완도산 건다시마(kelp)도 구입하여 세척 및 염분 제거 후 50℃, 6 h 열풍 건조하여 사용하였다. 준비된 황칠, 천일염, 시금치 및 다시마 등은 시험에 사용할 배합 비율별로 제조하기 위하여 각 원재료와 물을 1:10의 비율로 100℃, 8 h 동안 열수 추출 후 72 h 동결 건조하였다. 동결 건조물 각 1 g을 10 mL 멸균수로 녹여 0.1 g/mL 농도의 stock을 만들고, 시료로 사용하였으며, 이때, 사용된 최적 배합비율은 중량비를 적용하였다(Kim et al., 2018; Choi et al., 2021).
2. 세포배양
세포독성과 세포증식율 시험에 사용한 모유두세포(human follicle dermal papilla cell, HFDPC; Genophile, Korea)는 90% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM; Gibco, USA), 10% fetal bovine serum (FBS; Millipore, USA) 및 1% penicillin and streptomycin antibiotics (P/S; Gibco, USA)를 첨가한 배지에 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 또한 항염증 시험을 위한 Raw 264.7 세포(Korea cell line bank, KCLB; Korea)도 마찬가지로 90% DMEM, 10% FBS, 1% P/S를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO2 조건의 동일한 방법으로 배양하였다.
3. 세포독성 시험
배양된 모유두세포를 96 well plate에 1×106 cell/well로 100 µL를 분주하여 37℃, 5% CO2, 12 h 배양 후, 각 배합비율별로 처리하였다(Choi et al., 2021). 24 h 재배양 후, EZ-cytox (DoGenBio, Korea)를 10 µL 처리하고 다시 4 h 안정화 후, OD 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였으며, 대조군은 열수 추출에 사용된 멸균수를 사용하였다.
4. 세포증식율 시험
배양된 모유두세포를 96 well plate에 1×106 cell/well로 100 µL를 분주하여 37℃, 5% CO2, 12 h 배양 후, 각 배합비율별로 처리하였다(Rastegar et al., 2015; Choi et al., 2021). 24 h 및 48 h 재배양 후, MTS assay에 따라 MTS시약(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, PROMEGA, USA)을 20 µL/well 처리하고, 다시 4 h 안정화 후, OD 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포증식율을 확인하였으며, 대조군 및 추출물의 희석은 세포배양에 사용한 배지를 사용하였다.
5. 항염증 시험
1) 염증성 사이토카인 억제 시험
세포 배양액 내의 IL-6 및 TNF-α를 측정하기 위해 EnzymeLinked Immunosorbent Assay (IL-6, TNF-α ELISA kit, Abnova)를 수행하였다(Kim et al., 2019b; Shim, 2019; Kim & Ko, 2020). Raw 264.7 세포를 96 well plate에 1×105 cell/well로 100 µL를 분주하여 37℃, 5% CO2, 12 h 배양하였다. 배양한 plate에 0.1% 황칠추출물, 1% 천일염추출물, 5% 시금치추출물, 1% 다시마추출물 및 OMR을 각각 처리하고, 1 h 후 1 µg/mL lipopolysaccharide(LPS; Sigma Aldrich, USA)를 처리하였다. 처리 후 12 h 배양한 세포 배양액을 적절한 농도로 희석 후, capture antibody로 코팅된 96 well plate에 100 µL씩 첨가하고 상온에서 2 h 반응시켰다. 버퍼로 3회 세척하고 100 µL detection antibody를 각 well에 처리하고, 2 h 동안 상온에서 반응시킨 후 버퍼로 3회 세척하였다. 100 µL의 streptavidin-HRP solution을 처리하여 20 min 동안 상온 암실에서 반응 후, 버퍼로 3회 재세척하였다. di(2-ethylhexyl)-2,4,5-trimethoxy benzalmalonate (TMB) substrate를 100 µL 처리하여 30 min 반응 후, 500 µL stop solution을 처리하고, OD 450 nm에서 흡광도를 측정하여 IL-6 및 TNF-α를 확인하였고, 대조군은 세포배양에 사용한 배지를 사용하였다.
2) Western blot analysis
iNOS 및 COX-2의 단백질 발현을 확인하기 위해 western blot analysis를 수행하였다(Park & Lee, 2005; Park et al., 2019). Raw 264.7 세포를 6 well plate에 1×105 cell/well로 100 µL를 분주하여 37℃, 5% CO2, 12 h 배양 후, 각 well에 1 µg/mL LPS, 0.1% 황칠추출물, 1% 천일염추출물, 5% 시금치추출물, 1% 다시마추출물 및 OMR을 각각 처리하고, 24 h 배양하였다. PBS로 세척 후 100 µL의 lysis buffer [20 mM Tris- HCl (pH7.4), 5 mM EDTA(pH 8.0), 5 mM Na4P2O7, 10 mM NaF, 100 mM Nonidet P-40, 1% NaVO4, 0.5% EZ Block]를 첨가하고, 1,400 rpm, 4℃에서 15 min 원심 분리하여 상층액에서 단백질을 추출하였다. 동일한 양의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE)로 분리한 후, PVDF membrane에 transfer하였다. 5% Skim milk로 2 h blocking 후, 1차 항체인 iNOS 및 COX-2를 4℃, 24 h 반응시켰다. TBST 용액(0.05% Tween-20)을 이용하여 3회 세척하고, 2차 항체(1:2,000 dilution, cell signaling technology)를 상온에서 60 min 반응시켰다. TBST 용액으로 다시 3회 세척하고, ECL plus kit (Biosesang, Korea) 처리 후 단백질 발현 정도를 확인하였다. 표준물질로는 bovine serum albumin (BSA)을 사용하였고, Lowry법으로 정량하였으며, 대조군은 세포배양에 사용한 배지를 사용하였다.
6. 항균활성 시험
항균활성은 그람 음성균인 대장균(Escherichia Coli, E. Coli; KCTC 1467), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa; KCTC 2004)과 그람 양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus; KCTC 1927) 등 총 3종에 대하여 paper disc (Advantec, Japan) 법으로 확인하였다(Table 2). 각 균주는 Luria-Bertani (BD Difco, USA) 배지로 120rpm, 37℃, 12 h 배양하였다. 배양한 균주는 1×106 cell/mL로 희석 후 100 µL를 LB배지에 도말하고, paper disc에 0.1% 황칠추출물, 1% 천일염추출물, 5% 시금치 추출물, 1% 다시마추출물 및 OMR을 각각 40 µL 처리 후 37℃, 12 h 배양하여 생육저지환(mm)을 측정하였다.
Results & Discussion
1. 최적 배합비율(OMR)
이미 앞선 연구에서 황칠, 천일염, 시금치 및 다시마를 1:10 중량비로 열수 추출한 각 추출물에서 세포독성, 세포 증식율, 항염증 및 항균활성 등을 수행한 바 있다(Choi et al., 2021). 선행 연구에서 세포독성과 세포증식율은 황칠추출물 0.5 mg/mL, 천일염추출물 2 mg/mL, 시금치추출물 5 mg/mL, 다시마추출물 1 mg/mL 농도 이내에서 안전성과 유효성을 확인할 수 있었다(Choi et al., 2021). 이상의 결과를 토대로 본 연구에서는 보다 안전하고, 유효성이 우수한 최적 배합비율을 찾기 위해 황칠추출물은 0.1, 0.3, 0.5 비율, 천일염 추출물은 1, 2 비율, 시금치추출물은 1, 3, 5 비율, 다시마추출물은 1 비율로 하여 총 18개의 배합비율을 선정하였다(Table 1).
2. 세포독성 시험
선정된 18개 시료의 배합비율별 모유두세포의 세포독성 시험을 수행하였다(Figure 1). 특히 천일염추출물의 배합비율이 1인 경우에 대체로 세포 생존율이 높게 나타났으며, 황칠추출물과 시금치추출물의 배합비율이 높을 때에도 세포 생존율이 높은 경향을 나타냈다. 반면 천일염추출물의 배합비율이 2인 경우에는 대체로 세포 생존율이 낮게 나타났는데, 이는 천일염의 염분(salt)과 황칠 자체의 독성이 세포 생존에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 총 18개 시료 중 8, 12-15, 17-19 등 총 8개 시료에서 80% 이상의 세포 생존율이 확인되었다. 선행 연구에서 시금치 열수추출물의 경우 5 mg/mL 농도에서 약 30%의 세포독성을 나타내었지만(Choi et al., 2021), 배합비율 12 및 13의 경우, 세포독성이 낮아진 것으로 보아 배합추출시 시금치의 세포독성을 줄이는 것으로 판단된다.
3. 세포증식율 시험
탈모증상 완화 효과를 확인하기 위해 선정된 8개 시료의 모유두세포의 세포증식율 시험을 수행하였다(Figure 2). 특히 시료 8은 시료 1 (control)에 비해 약 20% 세포증식율이 감소하는 경향으로 나타났고, 나머지 7개 시료들은 세포증식율이 시료 1 (control)에 비해 유사하거나 증가하는 경향으로 나타났다. 시료 8의 세포증식율이 감소한 이유는 다른 시료들에 비해 높은 천일염의 높은 염분(salt)이 세포증식율에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 특히 시료 12는 시료 1 (control)에 비해 약 30% 세포증식율이 증가하는 경향으로 나타났으나, 시간이 24 h 에서 48 h 으로 증가함에 따라 상대적으로 세포증식율은 감소하는 경향으로 나타났다. 반면 시료 13은 시료 1 (control)에 비해 시간에 관계없이 약 20% 세포증식율이 증가하는 경향으로 나타났다. 이러한 결과를 토대로 시료 12이 시료 13과 차이가 있는 이유는 황칠추출물의 비율이 0.1에서 보다 0.3으로 증가하면 시간이 경과됨에 따라 세포증식율에 영향을 주는 것으로 판단되었다. 따라서 OMR이 0.1:1:5:1인 시료 13에서 세포증식율이 최적인 것으로 확인되었다(Table 2). OMR 중 시금치(5 mg/mL)와 미역(1 mg/mL)의 비율은 선행연구에서 확인된 가장 높은 세포증식율을 나타낼 수 있는 농도로 선정되었다(Choi et al., 2021).
4. 항염증 시험
1) 염증성 사이토카인 억제 시험
OMR에 대한 IL-6와 TNF-α의 발현 억제 효과를 확인하기 위해 Raw 264.7 세포의 항염증 시험을 수행하였다(Figure 3). Raw 264.7 세포는 LPS 1 µg/mL의 농도로 처리하였을 때 IL-6 및 TNF-α의 발현이 증가되는 것으로 확인되었고, LPS 처리 후 대조군에 비해 천일염추출물 비율 1과 OMR (0.1:1:5:1)에서 IL-6의 발현이 감소하였다(Figure 3A). 반면 황칠추출물 비율 0.1과 시금치추출물 비율 5 및 다시마추출물 비율 1에서는 모두 대조군에 비해 IL-6의 발현이 증가되었다. 특히 OMR은 각 추출물 농도에서 보다 IL-6의 발현을 더 효율적으로 억제하였다. TNF-α의 경우 LPS 처리 후 대조군에 비해 다시마추출물 비율 1을 제외하고는 모든 처리구에서 다소 감소하는 경향이 나타났다(Figure 3B). 따라서 OMR (0.1:1:5:1)은 TNF-α에서 보다 IL-6에서 선택적인 억제 효과가 있고, 단일 추출물 보다 더 높은 억제 효과가 있기 때문에 향후 IL-6에 선택적 항염증 효과를 가진 화장품 원료로서 활용되어질 수 있을 것이다.
2) Western blot analysis
iNOS는 LPS, TNF-α 등과 같은 염증 유발인자 및 암 발생인자에 의해 발현되며 NO생성을 유도하고, COX-2의 경우 성장인자, 염증 유발인자, 산화적 스트레스, 외상, 암 유전자, 사이토카인 등에 의해 유도되는 효소로서 염증 반응에 관여한다(Park & Lee, 2005). 상기 염증성 사이토카인 억제 시험에서 IL-6 및 TNF-α 항염증 효과를 확인한 후, 염증 유발 매개체인 NO 및 PGE2에 대한 염증 억제 효과를 확인하기 위해 iNOS 및 COX-2 단백질 발현율을 western blot analysis로 확인하였다(Figure 4). 그 결과, iNOS의 발현율은 다시마 추출물 비율 1과 OMR 처리 시 LPS를 처리한 대조군에 비해 현저히 감소하는 것으로 확인되었다(Figure 4A). 반면 천일염추출물 비율 1과 황칠추출물 비율 0.1에서는 대조군에 비해 다소 증가하는 것으로 확인되었으며, 시금치추출물 비율 5는 대조군에 비해 차이가 미미한 수준이었다. 또한 COX-2 단백질 발현율은 LPS를 처리한 대조군에 비해 다시마추출물 비율 1을 제외한 모든 처리구에서 증가하는 것으로 확인되었다. 특히, 시금치추출물 비율 5와 OMR에서 대조군에 비해 그 발현 정도가 현저히 증가하였다. 따라서 iNOS의 경우, OMR이 각 추출물에 비해 현저히 감소하지만, COX-2에서는 OMR이 각 추출물에 비해 증가하는 결과를 나타냈기 때문에 결과적으로 OMR은 iNOS의 발현을 선택적으로 저해하여 항염증 효과를 나타내는 것으로 판단된다(Figure 4B).
5. 항균활성 시험
OMR의 항균활성을 확인하기 위해 대장균, 녹농균 및 황색포도상구균 등 3종 미생물에 대한 항균활성 시험을 수행하였다(Table 2). 선행연구에서 각각의 황칠, 천일염, 다시마 및 미역의 열수추출물 중 황칠추출물에서만 녹농균과 황색포도상구균에서 항균활성을 나타냄을 확인하였다(Choi et al., 2021). 마찬가지로, 모든 처리구에서 대장균에 대한 항균활성 효과는 나타나지 않은 반면, 황칠추출물과 OMR에서 녹농균과 황색포도상구균에 대한 항균활성 효과가 증가하는 것으로 나타났다. 특히 녹농균과 황색포도상구균에 대한 항균활성 효과는 황칠추출물 단독일 때에서 보다 OMR (0.1:1:5:1)일 때 다소 증가하는 경향으로 나타났다. 따라서 OMR이 대장균을 제외한 녹농균과 포도상구균에 항균활성 효과가 있는 이유는 각 추출물 상호간 시너지 효과에 기인한 것으로 예상된다.
Conclusion
본 연구는 탈모증상 완화에 도움을 줄 수 있는 기능성 화장품 개발을 위해 국내산 황칠, 천일염, 시금치 및 다시마 등 추출물의 최적 배합비율을 찾고, 그 선정된 최적 배합비율에 대한 세포독성, 세포증식율, 항염증 및 항균활성 효과를 확인하기 위해 수행되었다.
세포독성 시험은 여러 배합비율 중 8개의 시료에서 80% 이상의 세포 생존율을 확인하였으며, 세포증식율 시험은 앞서 선정된 8개의 시료 중 24 h 및 48 h 모두에서 세포 증식율이 증가한 시료 13을 최적 배합비율(OMR)로 선정할 수 있었다. 또한, 항염증 시험에서는 선정된 OMR이 LPS를 처리한 대조군에 비해 IL-6와 iNOS 발현을 선택적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
이상의 결과를 토대로 전남산 황칠추출물, 천일염추출물, 시금치추출물 및 다시마추출물의 비율이 0.1:1:5:1 비율일 때 탈모증상 완화에 도움을 줄 수 있는 최적의 기능성 화장품 원료로서 활용 가능할 것이다. 향후 두발용 샴푸 등 시제품에 대한 추가 시험을 통해 더욱 효과적인 제품화가 가능할 것으로 사료된다.
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