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Asian J Beauty Cosmetol > Volume 19(4); 2021 > Article
반응표면분석법을 이용한 누에, 밀웜 및 굼벵이의 혼합비율 최적화

요약

목적

본 연구에서는 만성질환 개선을 위한 식품소재로 곤충식품의 활용도를 높이고자 반응표면분석을 이용하여 누에, 밀웜, 굼벵이의 최적혼합비율을 도출하고자 하였다.

방법

독립변수로 누에, 밀웜, 굼벵이를, 종속변수로는 총 BCAA 함량, 총 불포화지방산 함량, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, ABTS radical 소거능, α-glucosidase 저해 활성, ACE 저해 활성으로 선정하여 누에, 밀웜, 굼벵이의 최적혼합비율을 구하였다.

결과

반응표면분석을 통해 도출된 누에, 밀웜, 굼벵이의 최적혼합비율은 누에(X1) 2.998 : 밀웜(X2) 0.623 : 굼벵이(X3) 1.983이었다. 이때의 총 BCAA 함량은 0.52 g, 총 불포화지방산 함량은 0.44 g, 총 폴리페놀 함량은 67.02 mg TAE/g, 총 플라보노이드 함량은 35.58 mg QE/g, ABTS radical 소거능은 95.61%, α-glucosidase 저해 활성은 37.79%, ACE 저해 활성은 95.25%로 나타났다.

결론

본 연구를 통해 도출된 누에, 밀웜, 굼벵이의 최적혼합물이 만성질환 개선을 위한 제품 개발의 소재로 활용되기를 기대한다.

Abstract

Purpose

In this study, the optimal mixing ratio of total branched-chain amino acid (BCAA) content, total unsaturated fatty acid content, antioxidant activities, and enzyme activities of silkworm, mealworm, and white grub, which are alternative protein sources, was derived using response surface analysis.

Method

Silkworm, mealworm, and white grub were the independent variables, and total BCAA content, total unsaturated fatty acid content, total polyphenol content, total flavonoid content, ABTS radical scavenging activity, α-glucosidase inhibitory activity, and ACE inhibitory activity were used as the dependent variables to determine the optimal mixing ratio.

Result

The optimal mixing ratio for total BCAA content, total unsaturated fatty acid content, antioxidant activities, and enzyme activities derived from the response surface analysis was silkworm (X1) 2.998 : mealworm (X2) 0.623 : white grub (X3) 1.983. At this ratio, the total BCAA content was 0.52 g, the total unsaturated fatty acid content was 0.44 g, the total polyphenol content was 67.02 mg TAE/g, the total flavonoid content was 35.58 mg QE/g, the ABTS radical scavenging activity was 95.61%, the α-glucosidase inhibitory activity was 37.79%, and the ACE inhibitory activity was 95.25%.

Conclusion

It is expected that the optimal mixing ratio of silkworm, mealworms, and white grub derived in this study can be used to develop products for the management of various chronic diseases.

中文摘要

目的

在这项研究中,为了提高昆虫食物作为改善慢性病的食物材料的利用率,使用响应面分析得出了蚕、粉虫和蛞蝓的最佳混合比例。

方法

家蚕、粉虫、白蛉为自变量,总BCAA含量、总不饱和脂肪酸含量、总多酚含量、总黄酮含量、ABTS自由基清除活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性、ACE抑制活性作为因变量来确定最佳混合比。

结果

根据响应面分析得出的总 BCAA 含量、总不饱和脂肪酸含量、抗氧化活性和酶活性的最佳混合比是蚕 (X1) 2.998 : 粉虫 (X2) 0.623 : 白蛴螬 (X3) 1.983。在该比例下,BCAA总含量为0.52 g,不饱和脂肪酸总含量为 0.44 g,多酚总含量为67.02 mg TAE/g,总黄酮含量为35.58 mg QE/g,ABTS自由基清除活性为95.61%,α-葡萄糖苷酶抑制活性为37.79%,ACE抑制活性为95.25%。

结论

预计本研究中得到的蚕、粉虫和白蛉的最佳混合比例可用于开发治疗各种慢性病的产品。

Introduction

곤충(insect)은 동물계의 70%를 차지하는 생물군(Evans et al., 2017)으로 남극의 만년설, 끓는 온천수, 깊은 동굴, 심해 등 지구의 모든 곳에서 서식하는데, 80만 종류와 1천 경의 개체 수가 있는 것으로 추정된다(Youn et al., 2012).
그중 곤충식품(insect food)은 인간이 음식으로 만들어 섭취하는 식량자원(Bogueva et al., 2019) 또는 가축이나 애완동물의 먹이로 제공되는 식용자원(Chung et al., 2013a)을 의미한다.
역사적으로 인류는 곤충을 음식으로, 약용으로 사용해 왔으며(Lee et al., 2019). 최근에는 대체단백질의 급원으로 곤충식품이 재조명 되고 있으며, 농촌진흥청, 농림축산식품부, 한국곤충산업협회 등에서 다양한 연구가 이루어지고 있다(Seo & Ryu, 2019).
우리나라에서 식용으로 허용하고 있는 곤충식품으로는 유충 번데기, 백강잠, 벼메뚜기, 갈색거저리 유충, 흰점박이꽃무지, 장수풍뎅이 유충, 쌍별귀뚜라미, 아메리카왕거저리 유충 총 8종류가 있다(Kim et al., 2020).
누에(Bombyx mori L.)는 신농본초경(神農本草經), 본초강목(本草綱目), 동의보감(東醫寶鑑) 등의 고(古)서에 고혈압, 당뇨 및 불면증 개선에 효과가 있다고 기록되어 있다(Choi et al., 2015). 누에는 단백질, 지방산, 필수 아미노산 및 불포화지방산의 함량이 높아 간장질환과, 혈액순환 개선을 위한 기능성 식품의 소재로 이용되고 있다(Yu et al., 2008).
밀웜(Tenebrio molitor, mealworm)은 대두에 비해 필수 아미노산함량이 높고, 육류에 비해 불포화지방산 함량이 높아 기능성 식품 소재로 이용가치가 높다(Hwang et al., 2015; Pihlanto-Leppälä, 2000; Bovera et al., 2015).
굼벵이(Protaetia brevitarsis)는 조단백질 57.86%, 올레익산 61.10%, 철분 174.6 mg을 함유하고 있다. Baek et al. (2017)은 세포 분화, 근육의 강화 및 간 질환의 예방에 도움이 된다고 보고하였다.
유엔식량농업기구(FAO)에서는 지구의 온난화로 인한 식량난을 해결하기 위해 곤충식품을 섭취할 것을 제안하였다(van Huis et al., 2013).
곤충은 가축에 비해 생애주기가 짧아서 저비용으로 사육이 가능하며(Chung et al., 2013a), 온실가스의 방출이 적어 생태계를 보존하고, 환경을 보호할 수 있는 장점이 있다(Arsenault & Brown, 2017). 영양학적으로는 필수아미노산의 함량이 높아(Chong et al., 2017) 근육량의 감소가 시작되는 중년기에 단백질 급원으로 기대되는 식품이라 할 수 있다(Hwang & Choi, 2015). 일반적인 곤충의 조단백질과 조지방 함량은 각각 50-60%와 8.1-59%로 고단백, 저지방 식품으로 만성질환 개선에 도움이 되는 식품소재로 판단된다(Chong et al., 2017).
그동안 누에, 밀웜, 굼벵이는 각각 단일소재로 만성질환 관리를 위해 활용되어왔다. 따라서 본 연구에서는 만성질환 개선을 위한 식품 소재로 곤충식품의 활용도를 높이고자 누에, 밀웜, 굼벵이의 최적 혼합비율을 도출하여 친환경 먹거리 및 만성질환 관리를 위한 소재로서의 가치를 규명하고자 하였다.

Methods

1. 실험재료

본 연구의 실험재료로 사용한 누에는 부안누에오디(Buanodinue, Korea), 밀웜은 ㈜MG네츄럴(MG Natural, Korea), 굼벵이는 봉화곤충호텔(Bonghwa Insect Hotel, Korea)을 통하여 분말화 된 시료를 구입하여 시료로 사용하였다.

2. 실험설계

누에, 밀웜, 굼벵이의 최적 혼합비율을 도출하기 위해 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)의 Box-Behnken법(Ferreira et al., 2007)에 따라 15개의 실험점을 설정하였다.
독립변수로 누에(X1), 밀웜(X2), 굼벵이(X3)를 선정하였다. 각각의 요인은 실험 결과를 바탕으로 최소 범위와 최대 범위의 값을 설정하였고, 그 범위는 누에가 0-3 g, 밀웜은 0-3 g, 그리고, 굼벵이는 0-3 g이었다. 종속변수로는 총 BCAA 함량, 총 불포화지방산(ω-3, ω-6 및 ω-9) 함량, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, ABTS radical 소거능, α-glucosidase 저해 활성, ACE 저해 활성으로 선정하였다. 실험설계에 따른 실험점은 Table 1에 제시된 바와 같다.

3. 실험 방법

1) 열수 추출물 제조

누에, 밀웜, 굼벵이 열수 추출물을 제조하기 위해 각각의 시료를 3 g씩 초미세 저울로 정량한 후 30 mL의 증류수를 넣고 희석하여 2 h 동안 초음파 추출하였다. 추출한 시료는 20 min 동안 원심분리(4,000 rpm)를 한 후 상등액을 취해 0.45 µm의 syringe filter (Hyundai micro, Korea)로 불순물을 제거하였다. 불순물을 제거한 추출물은 20배로 희석하여 각각의 혼합비율의 조건에 따라 혼합하여 시료로 사용하였다.

2) 총 BCAA 함량

누에, 밀웜, 굼벵이의 아미노산 함량 측정 방법은 다음과 같다. 각각의 시료 5 g과 6 N HCl 40 mL를 각각 둥근 플라스크에 넣고 혼합한 다음 110℃에서 24 h 동안 질소 가스를 주입하여 가수분해 하였다. HCl를 50℃에서 감압 농축시킨 다음 농축 시료는 0.2 N sodium citrate buffer (pH 2.2) (Sigma-Aldrich, USA) 50 mL를 넣어 희석시키고, 0.45 µm syringe filter (Hyundai micro)로 여과하였다. 여과한 시료(30 µL)는 아미노산 자동분석기(AAA L-8900; Hitachi, Japan)를 사용하였고, column은 iron change column (4.6 mm×60 mm)을, 검출기는 visible detector를 사용하였다. 완충액의 flow rate는 1 mL/min, column의 온도는 20-85℃, 반응온도는 50-140℃로 하여 분석하였다.

3) 총 불포화지방산 함량

누에, 밀웜, 굼벵이의 지방산 조성은 Folch et al. (1957)의 방법으로 gas chromatography (US/HP 6890, Aglient Technolgies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. Gas chromatography (GC) 조건은 silica capillary column (Omegawax 295, 0.25 µm film thickness; Sigma-Aldrich)을 이용하였고, injection port 온도는 250℃, 검출기 온도는 260℃로 유지하였다.

4) 총 폴리페놀 함량

누에, 밀웜, 굼벵이의 총 폴리페놀 함량은 F-C 시약을 사용하는 Singleton & Rossi (1965)의 방법을 활용 및 변형하여 측정하였다. 시료 350 µL에 50% Folin-Ciocalte (Sigma-Aldrich) 70 µL를 가하여 3 min간 정치, 2% (w/v) Na2CO3 (Sigma-Aldrich)용액 350 µL를 첨가하여 1 h 반응시킨 후, ELISA microplate reader (Tecan Infinite M200 Pro; GreenMate Bio, Korea)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 구하였다.

5) 총 플라보노이드로 함량

누에, 밀웜, 굼벵이의 총 플라보노이드 함량은 Davis (1947)의 방법을 활용 및 변형하여 측정하였다. 시료 70 µL에 diethylene glycol (Daejung, Korea) 700 µL를 첨가하였고 다시 1N-NaOH (Sigma-Aldrich)용액 7 µL를 첨가해서 37℃ (dry oven)에서 1 h 반응시킨 후 ELISA microplate reader (Tecan Infinite M200 Pro, GreenMate Bio)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 구하였다.

6) ABTS radical 소거능

누에, 밀웜, 굼벵이의 ABTS (2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical 소거능은 Fellegrini et al. (1999)의 방법을 활용하여 측정하였다. ABTS (Sigma-Aldrich) 7.4 mM과 potassium persulfate (Sigma-Aldrich) 2.6 mM을 같은 비율로 섞어 하루 동안 암소에 방치하여 ABTS 양이온을 형성시키고 이후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.03이 되도록 1×PBS로 희석하였으며, 희석된 ABTS용액 190 µL에 시료 10 µL를 가하여 60 min 정치한 후 ELISA microplate reader (Tecan Infinite M200 Pro, GreenMate Bio)를 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다.

7) α-Glucosidase 저해 활성

누에, 밀웜, 굼벵이의 α-glucosidase 억제활성은 Li et al. (2005)의 방법을 변형하여 실험하였다. 반응 혼합물의 총 부피는 160 µL로 통일하였다. 각각의 well에 sample 20 µL와 100 mM phosphate buffer (pH 6.8) (Daejung) 20 µL를 넣은 후 1 unit/mL 농도로 녹인 α-glucosidase (10 mM phosphate buffer (pH 6.8) (Daejung) 20 µL를 넣고 37℃에서 5 min 동안 pre-incubation을 시켰다. 기질로 사용된 2.5 mM p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (pNPG; Sigma-Aldrich)는 100 mM phosphate buffer (pH 6.8) (Daejung)에 녹여 20 µL를 넣고, 37℃에서 15 min 동안 incubation 하였다. Incubation을 한 후 0.2 M sodium carbonate solution (Sigma-Aldrich) 80 µL를 넣어 반응을 종결한 후 microplate reader (Tecan Infinite M200 Pro, GreenMate Bio)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 α-glucosidase 저해율을 산출하였다.

8) ACE 저해 활성

누에, 밀웜, 굼벵이의 ACE (angiotensin-converting enzyme) 저해활성은 Cushman & Cheung (1971)의 방법을 활용 및 변형하여 측정하였다.
기질 용액 hippury-L-histidyl-L-leucine (HHL, Sigma-Aldrich) (5 mM)은 sodium chloride를 300 mM 함유한 50 mM HCl buffer (pH 8.3)에 녹여서 제조한다. 효소로 사용한 ACE 용액은 기질 제조를 할 때 이용한 것과 같은 HCl buffer (pH 8.3) (Sigma-Aldrich)에 10% lung acetone powder rabbit (Sigma-Aldrich)을 4℃에서 overnight 한 후, 원심분리기(Combi-514R; Hanil Science Inc., Korea)에서 원심분리(12,000 rpm, 30 min, 4℃)하여 제조하였다. ACE 저해 활성 분석은 ACE enzyme 50 µL, HHL 150 μL와 sample 시료 50 µL를 혼합하였으며, 대조군 (control)은 sample 시료 대신 증류수를 50 µL 첨가하여 37℃에서 30 min간 반응시킨 후 1 M HCl 250 µL를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 여기에 ethylacetate (Sigma-Aldrich) 500 µL를 첨가하고 15 s간 교반 후 원심분리(3,000 rpm, 5 min) 시켜 상등액 200 µL를 취하였다. 상등액은 120℃에서 30 min간 완전히 건조를 시켰다. 건조물에 증류수 1 mL를 가하여 용해를 시킨 다음 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해율을 산출하였다.

4. 통계 처리

실험 자료의 분석과 최적혼합비율은 Design Expert 10 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, USA) program의 ANOVA-test와 회귀분석을 이용하였고, 모델의 적합성은 F-test로 검정하였다. 이외 모든 자료는 SPSS statistics 24 (SPSS Institute, USA) program을 이용하여 평균과 표준편차를 구하였다. 각 요인에 대한 분석은 one-way ANOVA로 분석 후 Duncan's multiple range test로 사후 검정을 실시하였고, 유의수준은 5%로 설정하였다.

Results and Discussion

1. 누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 총 BCAA 함량 및 총 불포화지방산 함량

1) 총 BCAA 함량

분지아미노산(branched-chain amino acid, BCAA)은 인체의 정상적인 성장발달과 근육에 에너지를 공급하여 근육 손실을 막고, 알코올성 간 손상을 예방하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Churchward-Venne et al., 2013).
누에(X1), 밀웜(X2), 굼벵이(X3)의 함량을 독립변수로 하여 반응표면분석법에 의해 설계된 15개의 총 BCAA 함량을 측정하여 Table 2에 제시하였고, 유의성 검증 결과 및 회귀분석의 결과는 Table 3Figure 1A에 제시하였다.
누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 총 BCAA의 함량을 측정한 결과, 0.14-0.73 mg/g의 범위를 보였고, 9번 시료 (누에 1.5, 밀웜 3, 굼벵이 3)가 0.73 mg/g으로 가장 높았고, 15번 시료(누에 1.5, 밀웜 0, 굼벵이 0)가 0.14 mg/g으로 가장 낮았다.
총 BCAA 함량은 독립변수가 독립적으로 작용하여 선형효과만 존재하는 linear model이 선정되었다. 본 모델의 R2값은 0.9999로 신뢰도가 매우 높았고, p 값이 <0.0001로 적합성이 인정되었다. Figure 1A에 제시된 perturbation plot에 따르면 누에(A), 밀웜(B), 굼벵이(C)의 첨가 비율이 증가할수록 총 BCAA의 함량이 높았다. 그중 굼벵이(C)의 첨가 비율이 증가할수록 총 BCAA의 함량이 더 많이 증가하였다.

2) 총 불포화지방산 (ω-3, ω-6 및 ω-9) 함량

지방산 중 불포화지방산은 2중 결합을 1개 이상 가지고 있다. 불포화지방산은 분자내 2중 결합의 숫자에 따라 oleic acid계(2중 결합 1개), linoleic aicd계(2중 결합 2개), linolenic acid계(2중 결합 3개), 그리고 2중 결합이 4개 이상인 고도불포화지방산으로 나뉜다(Kweon et al., 2019). 그 중 곤충식품에 포함된 ω-3와 ω-6 지방산은 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추고 심혈관을 예방에 도움을 준다고 알려져 있다(Chung et al., 2013b).
누에(X1), 밀웜(X2), 굼벵이(X3)의 함량을 독립변수로 하여 반응표면 분석법에 의해 설계된 15개의 총 불포화지방산 함량을 측정하여 Table 2에 제시하였고, 유의성 검증 결과 및 회귀분석의 결과는 Table 3Figure 1B에 제시하였다.
누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 총 불포화지방산의 함량을 측정한 결과, 1.06-0.03 mg/g의 범위였으며, 9번 시료(누에 1.5, 밀웜 3, 굼벵이 3)가 1.06 mg/g으로 가장 높았고, 15번 시료(누에 1.5, 밀웜 0, 굼벵이 0)가 0.03 mg/g으로 가장 낮았다.
총 불포화지방산의 함량은 독립변수 간에 선형효과가 있는 linear model이 선정되었다. 본 모델의 R2 값은 0.9999로 신뢰도가 매우 높았고, p 값이 <0.0001로 적합성도 인정되었다. Figure 1B에 제시된 perturbation plot에 따르면 누에(A), 밀웜(B), 굼벵이(C)의 첨가 비율이 증가할수록 총 불포화지방산의 함량이 높았다. 그 중 밀웜(B)의 첨가 비율이 증가할수록 총 불포화지방산의 함량이 더 많이 증가하였다.

2. 누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 생리활성 지표

1) 총 폴리페놀 함량

식물의 항산화 성분인 폴리페놀은 체내의 활성산소를 자유 라디칼로 안정시켜 산화 스트레스로 인한 손상을 예방하는 효과가 있다(Jung et al., 2019).
누에(X1), 밀웜(X2), 굼벵이(X3)의 함량을 독립변수로 하여 반응표면분석법에 의해 설계된 15개의 총 폴리페놀 함량을 측정하여 Table 4에 제시하였고, 유의성 검증 결과 및 회귀분석의 결과는 Table 5Figure 1C에 제시하였다.
누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 총 폴리페놀의 함량을 측정한 결과, 21.19-78.30 mg TAE/g의 범위였으며, 15번 시료(누에 1.5, 밀웜 0, 굼벵이 0)가 78.30 mg/g으로 가장 높았고, 4번 시료(누에 0, 밀웜 1.5, 굼벵이 0)가 21.19 mg TAE/g으로 가장 낮았다.
총 폴리페놀의 함량은 독립변수 간에 선형효과와 곡선효과가 함께 나타나는 quadratic model이 선정되었다. 본 모델의 R2 값은 0.9583으로 신뢰도가 매우 높았고, p 값이 0.0003 (p<0.001)로 적합성도 인정되었다. Figure 1C에 제시된 perturbation plot에 따르면 누에(A)의 첨가 비율이 높을수록 총 폴리페놀의 함량이 높았고, 밀웜(B)의 첨가 비율이 증가할수록 총 폴리페놀의 함량은 감소하였다.

2) 총 플라보노이드 함량

플라보노이드(flavonoid)는 활성산소종을 효과적으로 제거하여 항산화능이 높고, 항바이러스, 항염증 등에 효과적인 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2012).
누에(X1), 밀웜(X2), 굼벵이(X3)의 함량을 독립변수로 하여 반응표면분석법에 의해 설계된 15개의 총 플라보노이드의 함량을 측정하여 Table 4에 제시하였고, 유의성 검증 결과 및 회귀분석의 결과는 Table 5Figure 1D에 제시하였다.
누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 총 플라보노이드의 함량을 측정한 결과, 7.20-43.00 mg QE/g의 범위였으며, 15번 시료(누에 1.5, 밀웜 0, 굼벵이 0)가 43.00 mg QE/g으로 가장 높았고, 2번 시료(누에 0, 밀웜 0, 굼벵이 1.5)가 7.20 mg QE/g으로 가장 낮았다.
총 플라보노이드의 함량은 독립변수 간에 선형효과가 있는 linear model이 선정되었다. 본 모델의 R2 값은 0.8196으로 신뢰도가 높고, p 값이 0.0003 (p<0.001)로 적합성도 인정되었다. Figure 1D에 제시된 perturbation plot에 따르면 누에(A)의 첨가 비율이 높을수록 총 폴리페놀의 함량이 높았고, 밀웜(B)과 굼벵이(C)의 첨가 비율이 증가할수록 총 폴리페놀의 함량은 감소하였다.

3) ABTS radical 소거능

ABTS radical 소거능의 측정방법은 DPPH assay와 마찬가지로 인위적으로 radical을 제거하는 작용으로 DPPH radical 소거능과 유의한 상관성을 보이는 것으로 알려져 있는데(Park et al., 2014), 친수성 및 소수성 화합물의 항산화력 측정이 가능한 ABTS radical 소거능은 734 nm 파장에서 최대한의 흡광도를 가지며, 추출물 색소에 의한 영향이 최소한으로 작용하므로 DPPH 보다 정확한 항산화력을 측정할 수 있다(Boligon et al., 2014). ABTS radical 소거능은 potassium persulfate와의 반응으로 인해 생성된 ABTS 유리 라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 측정하는 방법이다(Lee & Ryu, 2019).
누에(X1), 밀웜(X2), 굼벵이(X3)의 함량을 독립변수로 하여 반응표면분석법에 의해 설계된 15개의 ABTS radical 소거능을 측정하여 Table 4에 제시하였고, 유의성 검증 결과 및 회귀분석의 결과는 Table 5Figure 1E에 제시하였다.
누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 84.14-99.60 mg QE/g의 범위였으며, 12번 시료(누에 3, 밀웜 0, 굼벵이 1.5)가 99.60%로 가장 높았고, 10번 시료(누에 0, 밀웜 3, 굼벵이 1.5)가 84.14%로 가장 낮았다.
BTS radical 소거능은 독립변수 간에 선형효과와 곡선효과가 함께 나타나는 quadratic model이 선정되었다. 본 모델의 R2 값은 0.9542로 신뢰도가 높았고, p 값이 0.1143 (p<0.001)로 적합성도 인정되었다. Figure 1E에 제시된 perturbation plot에 따르면 누에(A)와 굼벵이(C)의 첨가 비율이 높을수록 ABTS radical 소거능의 효과가 높았고, 밀웜(B)의 첨가 비율이 증가할수록 ABTS radical 소거능의 효과는 상대적으로 감소하였다.

4) α-Glucosidase 저해 활성

α-Glucosidase는 소장 내의 탄수화물로부터 α-glucosidase를 방출하는 α-glucosidase bond의 분해를 촉진하여 포도당을 흡수하는데 관여하는 필수 효소이다(Kim et al., 2015).
누에(X1), 밀웜(X2), 굼벵이(X3)의 함량을 독립변수로 하여 반응표면분석법에 의해 설계된 15개의 α-glucosidase 저해 활성을 측정하여 Table 4에 제시하였고, 유의성 검증 결과 및 회귀분석의 결과는 Table 5Figure 1F에 제시하였다.
누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 α-glucosidase 저해 활성을 측정한 결과, 1.31-68.09%의 범위였으며, 15번 시료(누에 1.5, 밀웜 0, 굼벵이 1.5)가 68.09%로 가장 높았고, 2번 시료(누에 0, 밀웜, 굼벵이 1.5)가 1.31%로 가장 낮았다.
α-Glucosidase 저해 활성은 독립변수 간에 선형효과와 곡선효과가 함께 나타나는 quadratic model이 선정되었다. 본 모델의 R2 값은 0.9718로 신뢰도가 높고, p 값이 0.0023 (p<0.001)로 적합성도 인정되었다. Figure 1F에 제시된 perturbation plot에 따르면 누에(A)의 첨가 비율이 증가할수록 α-glucosidase 저해 활성이 높게 나타나 누에는 당뇨병 관리에 도움이 되는 소재로 판단된다.

5) ACE 저해 활성

ACE는 항고혈압 효과의 효소 인자로 angiotensin I로부터 C-말단 dipeptide를 가수분해 시켜서 강력한 혈관 수축작용을 나타내는 angiotensin II를 생성하여 고혈압의 원인이 되고 있다(Jang et al., 2010). Angiotensin Ⅱ는 혈압을 상승시키는 작용을 하며 ACE의 작용이 계속 지속하면, 고혈압을 유발하여 혈관 벽이 얇아져 터지게 되거나, 뇌졸중 등의 여러 질환이 발생한다(Fujita et al., 2000).
누에 (X1), 밀웜 (X2), 굼벵이 (X3)의 함량을 독립변수로 하여 반응표면분석법에 의해 설계된 15개의 ACE 저해 활성을 측정하여 Table 4에 제시하였고, 유의성 검증 결과 및 회귀분석의 결과는 Table 5Figure 1G에 제시하였다.
누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물 추출시료의 ACE 저해 활성을 측정한 결과, 5.30-94.82%의 범위였으며, 4번 시료(누에 0, 밀웜 1.5, 굼벵이 0)가 94.82%로 가장 높았고, 2번 시료(누에 0, 밀웜 0, 굼벵이 1.5)가 5.30%로 가장 낮았다.
ACE 저해 활성 저해 활성은 독립변수 간에 선형효과와 곡선효과가 함께 나타나는 quadratic model이 선정되었다. 본 모델의 R2 값은 0.9620로 신뢰도가 높고, p 값이 0.0002 (p<0.001)로 나타나 적합성도 인정되었다. Figure 1G에 제시된 perturbation plot에 따르면 누에(A)와 밀웜(B)의 첨가 비율이 증가할수록 ACE 저해 활성이 높게 나타나 누에와 밀웜이 고혈압 관리 소재로의 가능성이 있는 것으로 판단된다.

3. 반응표면분석을 이용한 누에, 밀웜, 굼벵이 혼합비율 최적화

최적의 desirability를 나타낸 최적혼합비율의 산출 결과는 Figure 2에 제시된 바와 같다. 반응표면분석에 의해 도출된 최적혼합비율은 누에(X1) 2.998:밀웜 (X2) 0.623:굼벵이(X3) 1.983으로 나타났다. 최적혼합비율의 총 BCAA 함량은 0.52 g, 총 불포화지방산 함량은 0.44 g, 총 폴리페놀 함량은 67.02 mg TAE/g, 총 플라보노이드 함량은 35.58 mg QE/g, ABTS radical 소거능은 95.61%, α-glucosidase 저해 활성은 37.79%, ACE 저해 활성은 95.25%로 나타났다. 누에, 밀웜, 굼벵이 최적 혼합비율에 해당하는 종속변수 중 항산화 활성과 ACE 저해 활성효과가 높게 나타나 당뇨병 합병증과 간장질환 개선에 도움이 될 것으로 보여진다.

Conclusion

그동안 누에, 밀웜, 굼벵이는 각각 단일소재로 당뇨병이나 간장질환과 같은 만성질환 관리를 위해 활용되어왔다. 따라서 본 연구에서는 만성질환 개선을 위한 식품소재로 곤충식품의 활용도를 높이고자 독립변수로 누에, 밀웜, 굼벵이를, 종속변수로는 총 BCAA 함량, 총 불포화지방산 함량, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, ABTS radical 소거능, α-glucosidase 저해 활성, ACE 저해 활성을 선정하여 누에, 밀웜, 굼벵이의 최적혼합비율을 도출하고자 하였다. 그 결과 누에, 밀웜, 굼벵이의 최적혼합비율은 누에(X1) 2.998 : 밀웜(X2) 0.623 : 굼벵이(X3) 1.983으로 도출되었다. 최적비율의 누에, 밀웜, 굼벵이 혼합물에 포함된 총 BCAA 함량은 0.52 g, 총 불포화지방산 함량은 0.44 g, 총 폴리페놀 함량은 67.02 mg TAE/g, 총 플라보노이드 함량은 35.58 mg QE/g, ABTS radical 소거능은 95.61%, α-glucosidase 저해 활성은 37.79%, ACE 저해 활성은 95.25%로 나타나 항산화 활성과 고혈압 개선에 도움이 될 것으로 기대된다.
본 연구를 통해 도출된 누에, 밀웜, 굼벵이의 최적혼합물은 단백질 대체식품으로의 활용과 더불어 만성질환을 관리하기 위한 기능성 식품 개발 시 활용되기를 기대한다.

NOTES

Author's contribution
K.A.J. designed all experimental design. L.S.Y. and H.M.R. collected literature and contributed to all aspects of analysis and experiment. L.S.Y. and H.M.R. wrote the manuscript with assistance from K.A.J.
Author details
So-Young Lee (Adjunct Professor), Department of Medium Therapy, Graduate School of Alternative Medicine, Kyonggi University, 24, Kyonggidae-ro, 9-gil, Seodaemun-gu, Seoul 03746, Korea; Myung-Ryun Han (Professor), Department of Baking Science & Technology, Hyejeon College, 25, Daehak-gil, Hongseong-eup, Hongseonggun, Chungcheongnam-do 32244, Korea; Ae-Jung Kim (Professor), Department of Nutrition Therapy, Graduate School of Alternative Medicine, Kyonggi University, 24, Kyonggidae-ro, 9-gil, Seodaemun-gu, Seoul 03746, Korea.

Figure 1.

Perturbation plot of silkworm (A), mealworm (B) and white-grub (C).

(A) Total BCAA contents; (B) Total unsaturated fatty acid contents; (C) Total polyphenol content); (D) Total flavonoid content; (E) ABTS radical scavenging activity; (F) α-glucosidase inhibitory activity; (G) ACE inhibitory activity. BCAA, branched-chain amino acid; UNFAT, unsaturated fatty acid; ABTS, 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid picrylhydrazyl; TFA, total flavonoid; TPA, total polyphenol; ACE, angiotensin-converting enzyme.
ajbc-19-4-715f1.jpg
Figure 2.

Derived total BCAA contents, total unsaturated fatty acid (ω-3, ω-6, ω-9) contents, antioxidant, and enzymatic activities optimal blend ratio.

BCAA, branched-chain amino acid; UNFAT, unsaturated fatty acid; ABTS, 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid picrylhydrazyl; TFA, total flavonoid; TPA, total polyphenol; ACE, angiotensin-converting enzyme.
ajbc-19-4-715f2.jpg
Table 1.
Independent variables and actual values used for optimization
No. Coded levels
Actual values (ratio)
X1 X2 X3 Silkworm (X1) Mealworm (X2) White-grub (X3)
1 0 0 0 1.5 1.5 1.5
2 -1 -1 0 0 0 1.5
3 -1 1 0 0 3 1.5
4 -1 0 -1 0 1.5 0
5 1 1 0 3 3 1.5
6 0 1 -1 1.5 3 0
7 0 0 0 1.5 1.5 1.5
8 1 0 1 3 1.5 3
9 0 1 1 1.5 3 3
10 -1 0 1 0 1.5 3
11 1 0 -1 3 1.5 0
12 1 -1 0 3 0 1.5
13 0 0 0 1.5 1.5 1.5
14 0 -1 1 1.5 0 3
15 0 -1 -1 1.5 0 0
Table 2.
Total BCAA and total unsaturated fatty acid (ω-3, ω-6, and ω-9) contents of silkworm, mealworm, and white-grub by response surface design
No. Silkworm (X1) Mealworm (X2) White-grub (X3) Total BCAA1) (mg/g) Total unsaturated fatty acid (ω-3, ω-6, and ω-9) (mg/g)
1 1.5 1.5 1.5 0.42 0.54
2 0 0 1.5 0.16 0.18
3 0 3 1.5 0.43 0.84
4 0 1.5 0 0.13 0.33
5 3 3 1.5 0.69 0.90
6 1.5 3 0 0.40 0.69
7 1.5 1.5 1.5 0.42 0.54
8 3 1.5 3 0.71 0.75
9 1.5 3 3 0.73 1.06
10 0 1.5 3 0.46 0.69
11 3 1.5 0 0.40 0.40
12 3 0 1.5 0.42 0.24
13 1.5 1.5 1.5 0.43 0.54
14 1.5 0 3 0.45 0.39
15 1.5 0 0 0.14 0.03

1) BCAA, branched-chain amino acid.

Table 3.
Analysis of predicted model equation for total BCAA and total unsaturated fatty acid (ω-3, ω-6, and ω-9) of silkworm, mealworm and white-grub
Response Model Mean±SD R2 1) F-value p-value Lack of fit Polynomial equation2)
Total BCAA Linear 0.42±0.17 0.9999 59029.00 <0.0001 0.9999 42.49+12.96A+13.49B+15.98C
Total unsaturated fatty acid (ω-3, ω-6, and ω-9) Linear 0.54±0.17 0.9999 124898.00 <0.0001 0.5780 53.99+3.24A+32.85B+17.86C

1) 0≤R2≤1, close to indicates regression line fix the model;

2) Coded equation (the levels of the factor are coded as +1~-1), A: silkworm (%); B: mealworm (%); C: white-grub (%).

Table 4.
Antioxidant contents and enzyme activities of silkworm, mealworm, and white-grub by response surface design
No. Silkworm (X1) Mealworm (X2) White-grub (X3) Total polyphenol (mg TAE1)/g) Total flavonoid (mg QE2)/g) ABTS3) radical scavenging activity (%) α-Glucosidase inhibitory activity (%) ACE4) inhibitory activity (%)
1 1.5 1.5 1.5 48.85 21.95 91.18 37.35 48.25
2 0 0 1.5 43.38 7.20 89.53 1.31 5.30
3 0 3 1.5 28.81 11.95 77.38 4.22 67.09
4 0 1.5 0 21.19 12.05 75.00 6.14 94.82
5 3 3 1.5 53.68 27.90 90.58 34.0 32.90
6 1.5 3 0 42.40 24.50 87.34 36.79 93.95
7 1.5 1.5 1.5 48.97 22.95 90.07 41.27 46.52
8 3 1.5 3 56.95 25.80 94.20 45.03 82.00
9 1.5 3 3 43.81 20.55 88.01 27.79 55.04
10 0 1.5 3 39.49 10.05 84.14 2.03 60.63
11 3 1.5 0 63.94 41.65 95.49 60.48 67.09
12 3 0 1.5 76.25 38.55 99.60 54.68 69.04
13 1.5 1.5 1.5 48.72 23.95 90.66 37.42 50.13
14 1.5 0 3 63.46 23.37 95.29 25.82 74.47
15 1.5 0 0 78.30 43.00 99.31 68.09 59.16

1) TAE, tannic acid equivalent;

2) QE, quercetin acid equivalent;

3) ABTS, 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid picrylhydrazyl;

4) ACE, angiotensinconverting enzyme.

Table 5.
Analysis of predicted model equation for antioxidant contents and enzymatic activities of silkworm, mealworm, and white-grub
Response Model Mean±SD R2 1) F-value p-value Lack of fit Polynomial equation2)
Total polyphenol Quadratic 50.55±4.54 0.9583 22.98 0.0003 0.0005 49.77+14.74A-11.58B-0.26AC+4.06BC-5.07×A2+6.53×B2
Total flavonoid Linear 23.69±5.26 0.8196 16.66 0.0003 0.0229 23.69+11.58A-3.40B-5.18C
ABTS radical scavenging ability Quadratic 89.85±1.98 0.9542 27.79 0.1143 0.0577 90.57+6.73A-5.05B+0.56C-2.61AC-3.31×A2+1.97×B2
α-Glucosidase inhibitory activity Quadratic 32.16±5.96 0.9718 19.16 0.0023 0.0837 38.68+22.56A-5.89B-8.85C-5.90AB-2.84AC+8.32BC-13.17×A2-1.96×B2+2.91×C2
ACE inhibitory activity Quadratic 60.43±6.34 0.9620 25.32 0.0002 0.0569 45.60+2.90A+5.13B-5.36C-24.48AB+12.28AC-13.56BC+27.79×C2

1) 0≤R2≤1, close to indicates regression line fix the model;

2) Coded equation (the levels of the factor are coded as +1~-1), A: silkworm (%), B: mealworm (%), C: white-grub (%).

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