HX109 시료 생산을 위해, 포공영(Taraxacum officinale), 토사자(Cuscuta australis), 연자육(Nelumbo nucifera)을 잘게 분쇄한 뒤 중량 기준 2:1:1 비율로 혼합하여 25% 에탄올로 20℃에서 8 h 동안 추출하였으며, 추출물을 여과 후 회전증발기(N-1000; Eyela, Japan)에서 농축하여 동결건조 하였다. 해당 과정을 통하여 건조 생약 원물 약 60 g으로부터 약 14%의 수율로 8.5 g의 HX109 분말시료를 생산하였으며, 연구에 사용한 모든 생약은 한국 경산에 위치한 휴먼허브에서 구입하였다. 각 생약은 한국 식물 DNA 은행(PDBK, Korea)에서 유전자 염기서열을 통해 종동정하였다. 생산한 시료는 ㈜헬릭스미스(Korea)의 지하실에 보관하였다. HX109의 전성분 함량 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석법을 이용하여 수행되었다. 상세한 분석 방법 및 성분 분석 결과는 본 연구진이 수행한 선행연구에서 확인할 수 있다(Lim et al., 2018).

1주간 순화를 거친 8주령 수컷 C57BL/6J (Janvier Labs, France)을 17마리씩 5개 그룹으로 분류하였다. 음성대조군(Control: Con)과 양성대조군인 미녹시딜 처리군(Minoxidil: MXD)은 HX109 시료의 용매인 2% HPMC를, HX109 처리군(30, 100, 300 mg/kg)은 각 농도에 맞는 HX109를 200 μL/day씩 매일 경구투여 하였다. 시료 경구 투여 1주일 째에, 마우스 등 부위의 털을 clipper로 면도한 후, 면도한 부위에 niclean 제모제(일동제약, Korea)를 사용하여 털을 완전히 제모하였다. 제모한 부위의 피부가 완전히 선홍색으로 확인되는 개체를 실험에 사용하였으며, 푸른색 혹은 검은색 피부가 관찰되는 개체는 제외되었다. 양성대조군에는 제모 다음 날부터 제모한 부위에 매일 5% Minoxidil (현대약품, Korea) 200 μL/day를 매일 도포하였다. HX109 투여와 minoxidil 도포를 지속하면서, 제모한 부위의 모발 성장 추이를 관찰하였다. 실험동물은 항온 항습 및 12 h light/dark cycle을 유지하며 사육하였으며, 사료와 물은 자유로이 공급하였다. 모든 동물 실험은 ㈜헬릭스미스의 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)가 정한 지침에 따라 진행되었다(승인번호: VIC-20-04-006).

제모 후 15일째 되는 날, CO₂로 마우스를 안락사 하여 실험을 종료하였다. 동일한 위치와 조명 조건 하에서 등 부위를 사진촬영 하였다. Adobe photoshop을 이용하여 제모 부위의 모발 성장 정도를 정량화 하였다. 모발이 전혀 자라지 않고 피부가 분홍색인 영역(0점), 모발이 자라지 않고 피부가 푸른색 혹은 검은색으로 변한 영역(1점), 모발이 자라났으며 푸른색 혹은 검은색으로 변한 피부가 보이는 영역(2점), 그리고 모발이 빼곡히 자라나 피부가 보이지 않는 영역(3점)을 각각 측정하였고, 각 영역값과 해당하는 점수를 곱하여 합한 값이 전체 면적에서 차지하는 비율을 계산하여 양모 촉진 효능을 평가하였다.

실험동물을 안락사하고 제모한 영역 중앙 부위의 피부조직을 적출하였다. 적출한 피부는 phosphatase inhibitors, cOmplete^TM Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Swiss) and DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich, USA)가 포함된 T-PER tissue extraction reagent buffer (Thermo Fisher, USA)를 사용하여 피부조직의 단백질을 추출한 후, 12,000 g에서 10 min 원심분리 하여 얻은 상등액으로 Bradford assay를 이용해 단백질 농도를 정량 하였다. 정량한 단백질을 15 μg씩 Bolt^TM 4-12% Bis-Tris Plus Gels (Invitrogen, USA)에 loading하여 전기영동 하였으며, polyvinylidene fluoride (PVDF; Cytiva, Korea) membrane에 transfer하였다. 1X TBS Blocking buffer (Thermo Fisher, USA)에 1 h 동안 incubation하여 단백질 간의 비특이적 결합을 차단하였다. 그 후 β-actin (Cell signaling, USA, 1:5000), bcl-2, bax, cyclin B1, cyclin E1 (Cell signaling, USA, 1:1000), cyclin D1 (Abcam, England, 1:10000) 1차항체를 4℃에서 overnight 하였다. 이후 membrane을 10 min씩 3회 wash 후, anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody and anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (Cell signaling, USA, 1:10000) 2차항체 희석액에 1 h incubation하였다. 반응 후 membrane을 10 min씩 3회 wash하고, ECL 용액(Thermo Fisher, USA)으로 membrane의 단백질 band를 감광시켜 검출하였다.

인간유래 모유두세포(Hair follicle dermal papilla cell, HFDPC)와 배양 배지는 Promocell (Germany)사에서 구매하여 사용하였다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 공급사 매뉴얼에 따라 배양하였으며, 이틀마다 배지를 교체하여 7-80% confluency가 되었을 때에 계대배양 하였다. 본 연구에서는 passage 3 이하의 세포를 실험에 사용하였다.

세포증식능 평가는 CellVia Cell viability assay kit (Abfrontier, Korea)을 사용하였다(Choi, 2022). 96-well plate에 HFDPC를 2.5×10³ cells/well 만큼 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24 h 배양 후, 기존 배지를 제거하고 실험군에는 HX109 희석 배지로(HX109 0.5, 1, 2 mg/mL), 대조군에는 새 배양배지로 교체하였다. 이후 48 h 동안 추가 배양하여 제조사의 protocol에 따라 WST1 assay를 진행하였다. 간략히, 기존 배지를 제거하고, FBS가 포함되지 않은 배지에 10%로 희석한 WST-1 solution을 100 μL/well HFDPC에 처리하였다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 30 min간 배양 후, microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군과 비교하여 세포증식능을 평가하였다.

HFDPC의 세포주기 분석은 Propidium Iodide Flow Cytometry Kit (Abcam, England)을 사용하였다. 6-well plate에 HFDPC를 1×10⁵ cells/well의 농도로 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24 h 배양 후 기존 배지를 제거하고 HX109를 2 mg/mL 농도로 처리하였다. 그 후 동일한 조건에서 48 h 동안 추가로 배양한 후, DPBS로 세포를 세척 후 harvest하여 66% ice cold 에탄올로 4℃에서 2 h 동안 고정하였다. 고정된 cell을 상온에서 10 min간 둔 후, RNase (550 U/mL)+Propidium iodide (50 μg/mL)를 PBS에 희석한 용액으로 37℃에서 30 min간 빛을 차단하여 반응시켜 DNA를 염색하였다. 반응 후 각 세포는 flow cytometer (FACS Lyrics^TM; BD biosciences, USA)를 이용하여 G1기, S기, G2/M기의 population을 측정한 후, FlowJo 프로그램을 이용하여 사후 분석하였다(BD biosciences).

모든 실험은 동일한 조건에서 3회 반복하였으며, 결과값의 평균±표준오차로 표기되었다. 통계 분석에는 GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, USA)이 사용되었으며, 그룹 간 비교는 student t-test 및 one-way ANOVA 분석을 통해 p-value<0.05 일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

Human follicle dermal papilla cells (HFDPC)는 사람의 모근에서 유래한 primary cell로서 모발의 성장주기 유지에 핵심역할을 하기 때문에 양모 촉진 효능 기전연구 모델로 활용되어진다(Driskell et al., 2011; Zhao et al., 2008). HFDPC의 세포 증식에 HX109가 미치는 영향을 확인하기 위해, HX109를 각각 0.5, 1, 2 mg/mL 농도로 처리하여 48 h 동안 배양한 후 WST-1 assay로 세포증식의 변화를 확인하였다. 그 결과, 음성대조군 대비하여 HX109 처리 시 농도 의존적으로 세포 증식이 증가하는 경향을 확인하였다(Figure 1). 특히 HX109를 1, 2 mg/mL 농도 조건으로 처리하였을 경우, 음성 대조군 대비 유의적인 생육촉진 효과를 보였다(p<0.001). 이를 통해 HX109는 HFDPC의 성장 촉진을 통해 hair growth 효능을 나타낼 수 있다는 가능성을 확인하였다.

세포의 분열과정은 단계별 특징에 따라 G1기(제1 휴지기), S기(DNA 합성기), M기(분열기), G2기(제2 휴지기)로 분리하며, 세포의 성장과 분열이 지속되는 동안 계속 이 주기를 순환한다(Purba et al., 2016). 따라서, 앞선 Figure 1에서 확인한 HX109에 의한 세포 증식 촉진 효과에 대한 작용 기전을 규명하기 위하여, HX109가 세포 분열 과정에 미치는 영향을 조사하였다. HX109를 HFDPC에 2 mg/mL 농도로 처리하여 48 h 동안 배양한 후, flow cytometry를 이용하여 세포주기의 변화를 분석하였다. 그 결과, 음성대조군과 HX109 처리군에서의 G1기 population은 각각 70.4%, 71.3%로 비슷한 분포를 나타내어 유의미한 변화가 관찰되지 않은 반면, 음성대조군과 HX109 처리군의 S기 population은 각각 10.1%, 3.1%로서, HX109에 의해 S기의 분포도가 큰 폭으로 감소함을 확인하였다. 또한, G2/M기 population은 13.7%, 19.0%로서, HX109를 처리하였을 때 G2/M기의 분포도가 증가함을 확인하였다(Figure 2). 이는 HX109에 의해 S기에서 G2/M기로의 transition이 촉진되었음을 의미한다.

HFDPC에서 HX109의 세포증식 촉진 효과를 본 Figure 1, Figure 2의 결과를 토대로, 양모촉진 동물모델에서 HX109 추출물을 이용한 양모효과를 관찰하고자 동물 실험을 진행하였다. C57BL/6J 마우스는 사람과 유사한 검은색 체모를 가져 모발의 성장주기를 색으로 쉽게 판정할 수 있는 장점을 가지고 있고, 휴지기에서 성장기로의 모발 주기 유도를 측정하는 모델로서 많이 사용되고 있다(Müller-Röver et al., 2001). 1 주일간 순응이 완료된 마우스에 HX109를 일주일간 경구투여한 후, 마우스 등쪽 부위의 털을 제모 하였다. 그 후, 14일간 HX109를 매일 경구투여 실시한 후에, 15일 시점에 육안적 관찰 및 양모면적 비율 분석을 실시하였다. MXD군에는 제모 다음날부터 제모된 부위에 minoxidil을 200 μL씩 매일 도포하였다. 15일 후 사진 촬영하여 제모 면적 대비 양모면적의 비율을 양모 정도에 따라 가중치를 부여하여 계산하였고, 음성대조군의 양모 정도를 100% 기준으로 두고 상대적인 양모 면적 증가량을 분석하였다. 제모한 등 부위의 양모상태를 육안적으로 관찰 한 결과는 Figure 3과 같다. 아무 것도 처리하지 않은 음성대조군에 비교하였을 때, HX109 투여군에서는 생장기로 진입하는 모발이 증가하여 피부색이 회색에서 검푸른색으로 변하면서 모발이 자라는 것이 관찰되었다. 특히, HX109를 300 mg/kg 투여한 마우스의 전체 등 면적은 아주 진한 검푸른색을 띄는 것을 확인할 수 있었다. 양모 면적 분석을 실시한 결과, 육안적 평가 결과와 동일하게 HX109 투여 시 농도 의존적으로 양모 면적이 증가하였으며, 특히 HX109 300 mg/kg 투여군(p<0.01)과 MXD군(p<0.001)에서는 음성대조군에 대비하여 통계적으로 유의미하게 양모 면적이 증가하였다.

Cyclin B1은 cell cycle phase 중 G2/M phase에서 증가하는 단백질인 것으로 알려져 있으며, cyclin B1이 분해될 때 세포 분극이 저해되며 따라서 세포 사멸을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Yuan et al., 2004). HX109는 HFDPC에서 세포증식의 촉진과 세포 분열과정 중 S기에서 G2/M기로의 transition을 유도하였기 때문에, HX109가 C57BL/6J 마우스 동물모델에서 세포분열의 각 단계를 조절하는 cyclin family protein을 조절하는지 확인하고자 하였다. 음성대조군 대비 뚜렷하게 효과가 나타났던 HX109 300 mg/kg 투여군의 마우스 등 조직에서 얻은 단백질로 western blot을 진행하였다. 그 결과, 음성대조군에 대비하여 HX109 300 mg/kg 투여군에서는 G1기로 진행시켜 세포 분열 유무를 결정하는 cyclin D1과 S기 진입에 도움을 주는 cyclin E1의 단백질 발현이 크게 증가하지 않은 반면, cyclin B1의 단백질 발현은 음성대조군과 비교하여 HX109 300 mg/kg 투여군에서 약 3.9배 증가하였다(Figure 4). 이는, HX109가 cyclin B1의 단백질 발현을 자극하여 세포주기 G2/M기 변화를 유발할 가능성을 암시한다.

세포 주기 조절과 더불어, 세포 사멸의 조절 역시 세포 증식에 중요한 영향을 미친다. 세포 사멸은 pro-apoptotic gene product인 bax와 anti-apoptotic gene product인 bcl-2의 비율에 의하여 결정되며(bax/bcl-2 ratio), bax의 발현이 감소할 경우 세포 사멸이 억제되어 세포의 생존률이 증가함이 보고되어 있다(Thomas et al., 1996). HX109가 bax와 bcl-2의 발현을 조절하는지 확인하기 위하여 C57BL/6J 마우스 피부 조직을 이용하여 western blot을 실시하였다. 그 결과 HX109 300 mg/kg 투여군은 음성대조군에 비해 bcl-2의 단백질 발현은 큰 변화가 없었던 반면, bax의 단백질 발현은 크게 감소하였으며, 그 결과 bax/bcl-2 ratio가 크게 감소하였다(Figure 5). 즉, HX109는 마우스 피부의 세포 사멸을 저해하는 효능을 지닐 수 있다는 가능성을 시사한다.

이 연구에서 HX109는 음성대조군 대비 HFDPC의 세포 증식을 유의미하게 증가시켰으며, 또한 C57BL/6J 마우스에서는 음성대조군 대비 양모 면적을 유의미하게 증가시켰다. 모발의 성장은 세포 주기 및 세포 사멸과 밀접하게 관련되어 있어 HFDPC에서 세포 주기에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Purba et al., 2016). 기본적으로 세포 증식은 세포 주기 순환을 통해 발생하는데, HX109는 HFDPC에서 S기를 G2/M기로 transition 시키는 것을 확인했고, HX109를 투여한 C57BL/6 마우스의 피부조직에서 cyclin B1의 단백질 발현이 증가하였다. Cyclin B1은 S기 후반부터 G2에 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다(Kakino et al., 1996). 그러므로 HX109는 세포 주기 중 S기에서 G2/M기로의 transition을 통해 HFDPC세포의 성장을 촉진시켜 모발 성장을 촉진시킨다고 볼 수 있다. 추가적으로 세포 증식은 세포 사멸과도 밀접한 연관이 있는데, HX109를 투여한 마우스의 피부조직에서 bcl-2는 발현에 변화가 없었으나 bax의 단백질 수준이 크게 감소하면서 세포 사멸을 나타내는 bax/bcl-2 ratio가 음성대조군 대비 크게 감소하였다. 이는 HX109에 의해 세포 사멸이 저해될 수 있다는 가능성을 보여줌으로써 HX109는 세포 주기 조절뿐만 아니라 세포 사멸을 저해함으로써 모발 성장을 촉진시킨다고 볼 수 있다. 다만 본 연구에서는, 기술적 한계로 인해 실제 동물의 follicular dermal papilla cell에서 직접 HX109에 의한 S기에서 G2/M기로의 transition 변화를 확인하지는 못하였으며, 대신 간접적으로 cyclin B1의 발현 변화를 확인하였다. 추후 quantitative intravital microscopy 기법을 활용하여 in vivo cell cycle profiling을 실시한다면, HX109의 작용 기전에 대해 더욱 엄밀한 검증이 가능할 것으로 기대된다.

현재 탈모 치료제로 사용중인 finasteride는 5α-reductase의 활성을 억제하여 DHT 생성을 억제하는 것과 같이 직접적인 호르몬 억제를 통해 탈모 억제 작용을 한다(Dallob et al., 1994; Libecco & Bergfeld, 2004). 하지만 이러한 finasteride는 호르몬 조절에 대한 다양한 부작용을 갖고 있는데, 발기부전 및 성욕 감소, 여성형 유방 등이 대표적이다(Libecco & Bergfeld, 2004; Upadhyay et al., 2019; Wilton et al., 1996). 반면 HX109는 직접적으로 DHT농도에는 영향을 주지 않고, 간접적으로 activating transcriptional factor 3 (ATF3) 및 calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase β (CaMKKβ)의 활성화를 증가시켜 이로 인해 androgen receptor가 타겟 프로모터에 결합하는 활성을 억제함이 밝혀졌다(Lim et al., 2018). 이는 HX109가 기존 치료제와는 달리, 직접적인 호르몬 조절에 의한 부작용 없이 간접적인 작용을 통하여 보다 안전한 소재로서 개발될 가능성이 있음을 시사한다. 또한 후속 연구에서 진행한 결과에 따르면, HX109를 직접 피부에 도포하여도 유사한 기능을 나타내는 것으로 생각된다(unpublished data). 이에 본 연구진은 HX109를 모발 건강 개선 및 모발 탈락 완화를 목적으로 하는 화장품 및 건강기능식품 소재로 개발하기 위하여, 현재 식약처에서 배포한 모발건강 기능성 평가 가이드라인에 의거하여 임상시험의 프로토콜 수립 및 개시를 계획하고 있다.