저분자 펩타이드 복합물이 함유된 화장품의 항산화, 항 광노화 및 항 주름 효과
Antioxidant, Anti-photoaging, and Anti-wrinkle Effects of Cosmetics Containing Low-molecular-weight Peptide Complexes
含有低分子肽复合物的化妆品的抗氧化、抗光老化和抗皱作用
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Abstract
목적
본 연구에서는 저분자 펩타이드 복합체를 구성하는 화장품의 피부 개선 효과 검증을 위해 in vitro 시험 및 인체적용시험을 시행하여 그 개선 효과를 확인하였다.
방법
본 연구는 저분자 펩타이드 복합체를 구성하는 화장품의 세포독성, 항산화 및 항광노화 효과를 검증하기 위해 시험관내 시험을 실시하여 산화스트레스를 받은 HacaT 세포에 대한 세포보호 효과를 확인하고 UVB를 조사한 CCD-986sk 세포에 대한 세포내 콜라겐 생성량을 확인하였다. 또한 30-59세 성인 20명을 대상으로 피부 개선 효과를 검증하기 위해 인체적용시험을 진행하였다. 안테라 3D CS를 적용해 이마, 눈, 볼, 입 주변 주름의 깊이와 함몰지수를 평가하였다.
결과
시험물질은 세포 생존율이 우수하여 피부에 안전한 것을 확인하였으며, 0.1% 농도에서 활성산소 제거율이 63.39% (p＜0.001) 이었으며, 콜라겐 양은 102.14% (p＜0.01) 증가하였다. 또한 4주간의 인체적용시험 결과 깊은 주름의 경우 평균 깊이가 20.53% (p＜0.001) 감소하였으며, 함몰지수는 17.02% (p＜0.001) 감소하였다.
결론
연구결과, 시험 물질은 우수한 항산화 작용, 광노화 방지 및 콜라겐 생성 촉진 효과를 입증하였다. 또한 피부 주름 감소 및 피부의 탄력 증가에 효능이 있음을 검증하였다. 이것으로 우리는 저분자 펩타이드 복합체가 코스메슈티컬의 우수한 유효성분인 것으로 생각한다
Trans Abstract
Purpose
This study aimed to confirm the skin improvement effects of cosmetics containing low-molecular-weight peptide complexes using in vitro and human application tests.
Methods
An in vitro test was conducted to confirm the cytotoxicity, antioxidant, and anti-photoaging effects of cosmetics comprising low-molecular-weight peptide complexes. The protective effect on HacaT cells subjected to oxidative stress and collagen production in CCD-986sk cells irradiated with UV-B (Ultraviolet B) were confirmed. Moreover, to validate skin improvement effects, a human application test was performed on 20 adults aged 30–59 years. The wrinkles depth and the indentation index around the forehead, eyes, cheeks, and mouth were evaluated using ANTERA 3D CS.
Results
The test material demonstrated excellent cell viability, confirming its safety on the skin. At a concentration of 0.1%, it exhibited a removal rate of reactive oxygen species (ROS) by 63.39% (p<0.001) and an increase in collagen content of 102.14% (p<0.01). Furthermore, in the human application test over 4 weeks, skin folds exhibited a decrease in average depth by 20.53% (p<0.001), and the indentation index decreased by 17.02% (p<0.001).
Conclusion
Cosmetics containing low-molecular-weight peptide complexes possess excellent antioxidant, anti-photoaging, and collagen synthesis promotion properties. Their efficacy in reducing skin wrinkles and increasing skin elasticity was also confirmed. Low-molecular-weight peptide complexes could be an excellent active ingredient in cosmeceuticals.
Trans Abstract
目的
本通过体外和人体应用测试来确认含有低分子量肽复合物的化妆品的皮肤改善效果。
方法
进行体外测试以确认包含低分子量肽复合物的化妆品的细胞毒性、抗氧化和抗光老化作用。经UV-B(紫外线B)照射的CCD-986sk细胞中确认了对遭受氧化应激的HacaT细胞和胶原蛋白产生的保护作用。此外，为了验证皮肤改善效果， 对20名30-59岁的成年人进行了人体临床试验。使用ANTERA 3D CS 评估额头、眼睛、脸颊和嘴巴周围的皱纹深度和压痕指数。
结果
测试材料表现出优异的细胞活力，证实了其对皮肤的安全性。在0.1%浓度下，ROS(活性氧)去除率提高了63.39% (p＜0.001)，胶原蛋白含量增加了102.14% (p＜0.01)。此外，在超过4周的人体应用测试中，皮肤皱褶的平均深度减少了20.53% (p＜0.001)，压痕指数减少了17.02% (p＜0.001)。
结论
含有低分子量肽复合物的化妆品具有优异的抗氧化、抗光老化和促进胶原蛋白合成的特性。它们在减少皮肤皱纹和增加皮肤弹性方面的功效也得到了证实。低分子量肽复合物可能是药妆品中优异的活性成分。
Introduction
피부 노화는 연령이 증가하면서 나타나는 자연스러운 현상이기는 하나, 생활 습관이나 영양 부족, 자외선 등의 외부적인 환경 요인이 중첩되면서 가속되는데(Kim et al., 2010), 이 중 산화 스트레스(oxidative stress)는 이러한 피부 노화를 일으키는 주범으로 알려져 있다(Choi et al., 2019). 산화 스트레스는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)에 비해 항산화물질이 부족하여 야기되는 것으로, 이는 피부 항상성을 방해하고 피부장벽을 손상시킬 뿐 아니라, 피부 세포의 산화에 관여하여 피부 노화를 촉진시킨다(Lephart, 2016; Kim et al., 2018; Bang et al., 2021). 게다가 피부는 자외선 등에 과다하게 노출되면 피부의 교원섬유(collagen) 및 탄력섬유(elastin) 등의 피부의 구조 단백질이 손상되고 피부는 구조적으로 탄성을 잃게 되어 주름이 형성되기 시작한다(Dang, 2021). 이를 방치할 경우 더 깊은 주름으로 진행되며 이러한 피부의 주름은 노화 정도를 가늠하는 기준이 되기도 한다(Kim et al., 2010).
한편, 인류는 오래전부터 노화된 피부를 재생하거나 복구하기 위한 노력을 해왔으며(Tobin, 2017), 현대인에게도 예외는 아니어서 건강하고 매끈한 피부를 가지는 것이 남성과 여성 모두에게 트렌드가 되어가고 있다(Veiga et al., 2023). 실제로 화장품 소재인 펩타이드를 연구한 보고에서 젊고 건강하게 보이는 피부가 개인의 웰니스(wellness)에도 기여한다는 보고를 인용하기도 하였다(Errante et al., 2020). 이러한 피부 노화 방지 및 피부 건강이라는 이슈를 두고 활성 성분을 함유한 화장품을 연구해옴에 따라(Lephart, 2016), 화장품 및 제약 분야에서는 피부 노화를 지연하거나 극복할 수 있는 소재 즉, 피부의 항산화 및 피부 세포를 보호하거나 피부 항상성 유지를 위한 항 알레르기, 항염증, 자외선 차단 그리고 보습, 주름 예방, 피부 탄력 등에 대한 화장품 소재를 찾는 다양한 연구를 지속적으로 진행하고 있다(Masaki, 2010; Dorni et al., 2017; Aguilar-Toalá et al., 2019).
특히 천연의 전통적인 펩타이드(peptides)가 현재 수천 개 이상으로 발견되고 있고, 실제로 빛과 열을 가하여도 변화가 없는 데다(Fosgerau & Hoffmann, 2015), 인체에 매우 안정적이며 유해성이 적고 세포 표면의 수용체 결합이 뛰어나 항산화 기능, 수분 친화력 및 보습력이 뛰어난 것으로 확인되면서(Ledwoń et al., 2021), 전통적인 펩타이드를 저분자화하거나 세포 침투가 가능한 다기능성 펩타이드를 설계하고 조합하는 경로 등이 제시하는 등으로 펩타이드 연구가 활발히 진행되고 있다(Fosgerau & Hoffmann, 2015; Yadav & Mohite, 2020). 이에 따라 화장품 분야에서도 이를 활용한 다양한 연구로 이어져 지속적으로 확장되고 있으며(Lupo & Cole, 2007; Fosgerau & Hoffmann, 2015; Errante et al., 2020), 특히 코스메슈티컬(Cosmeceutical)의 활성 소재로서의 펩타이드 개발을 위한 연구를 제언하기도 하였다(Kumar et al., 2018; Aguilar-Toalá et al., 2019).
실제로 노화되었거나 노화가 진행 중인 피부를 개선하기 위한 새로운 물질 중의 하나로 일컬어지는 펩타이드 화장품은 신경전달물질 억제제, 캐리어 및 신호 펩타이드 등의 주요 카테고리별로 다양한 효과와 실용성이 검증되고 있다(Fosgerau & Hoffmann, 2015). 생물학적 표적에 따라 특정된 피부 단백질의 생산을 촉진, 제어 및 조절하는 등으로 소량으로도 피부에서 다양한 생리활성 스펙트럼을 나타내는 것으로 보고하였으며(Errante et al., 2020), 가상 시험(in silico), 비인체 적용시험(in vitro) 및 인체 적용시험(in vivo) 등에서 펩타이드가 피부 침투 용이성이 있는지, 그 효능의 극대화를 위한 조합은 어떠한지 등의 연구에서 매우 우수한 피부 활성 효과가 나타난 것으로 보고되었다(Aguilar-Toalá et al., 2019; Campiche et al., 2020; Ledwoń et al., 2021).
현재까지 코스메슈티컬의 활성 소재로서 펩타이드의 효능 연구에서는 대체로 단일 펩타이드의 세포 증식(Yoo et al., 2014), 광노화 억제(Oh et al., 2014) 및 항염 효능(Kang & Park, 2019), Antipollution (Lee et al., 2021) 및 멜라닌 형성억제(Lim et al., 2021), 항노화 및 항주름(Dana & Rotsztejn, 2017; Kim et al., 2021; Lee et al., 2022), 그리고 피부 탄력(Kim et al., 2022) 등이 확인되었다. 특히 저분자 펩타이드 복합물이 진피 기질 단백질의 노화 방지 효능이 있는것으로 보고되면서(Byrne et al., 2010), 효능이 검증된 단일 펩타이드들을 조합하여 제조된 복합물이 실제로 각 단일 펩타이드에 비해 흡수(전달) 및 기능의 상승효과가 더 높음을 검증하였으며(Dulińska-Molak et al., 2014; Errante et al., 2020), 가설 이상의 생리적 활성을 나타내는 것으로도 보고되었다(Yadav & Mohite, 2020; Park et al., 2022).
최근에는 피부 침투를 용이하게 할 수 있는 기술을 펩타이드에 적용하여 친유성 접합 펩타이드를 형성하거나, 표적화된 전달이 가능한 펩타이드 개발에까지 이르고 있다(Veiga et al., 2023). 그러나 이러한 저분자 펩타이드 복합물을 함유하여 제조된 화장품이 실제 피부에 적용되었을 경우 피부의 생리활성에 어느 정도로 영향을 주는지에 대한 연구는 현재까지는 미흡한 편이다.
이에 본 연구에서는 저분자 펩타이드 복합물을 함유하여 제조한 화장품이 피부에 안전하며 항산화 및 항광노화 그리고 항주름의 효능을 나타내는지를 확인하고, 나아가 코스메슈티컬의 활성 소재로서 단일 펩타이드가 가진 효능들을 상승시킬 수 있는 저분자 펩타이드 복합물의 사용성을 보고하고자, 비인체 적용시험(in vitro test)을 통하여 효능 평가를 시행하였으며, 이를 토대로 인체 적용시험(in vivo test)을 시행하여 확인된 효능을 검증하였다.
Methods
1. 시험제품
본 연구에 사용된 저분자 펩타이드 복합물은 PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM (Vonestis, Korea)이며, PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM은 palmitoyl sh-tripeptide-1 amide, palmitoyl sh-tripeptide-3 amide, palmitoyl tripeptide-53 amide, acetyl hexapeptide-8, galloyl pentapeptide-33 등을 조합하여 조성된 보습, 항산화, 항염, 미백 및 항노화에 특화하는 저분자 펩타이드 복합물로 본에스티스에서 독자 개발한 원료이다. 본 시험에서는 이 PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM 저분자 펩타이드 복합물을 에멀션 제형의 에센스에 5중량% 함유하여 프로토타입(prototype)으로 제조하였다. 이때 비인체 적용시험에는 에센스 희석액을, 인체 적용시험에는 에센스 완제품을 사용하였다.
2. 세포독성 측정
본 시험에서는 세포 내의 환원성 물질인 NADH 등에 의해 MTT radical이 세포 내 미토콘드리아에 쌓이는 것을 이용하여 세포의 활성 또는 생존율을 측정하는 방법으로 시험제품에 대한 세포독성을 측정하였다. 인체 표피의 각질 모델인 HaCaT cell (한국세포주은행, Korea) 및 인체 섬유아세포인 CCD-986sk cell (한국세포주은행)을 세포주로 사용하였으며, 전 시험 과정은 MTT assay 프로토콜에 준하여 진행하였다. 각 세포들은 DMEM broth (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GE healthcare, USA)로 처리하여 incubator에서 배양하였으며 fetal bovine serum (FBS; Sigma-Aldrich, USA) 5%를 첨가하여 제조하였다. 이때 항생물질은 1%의 Penicillin-Streptomycin (100X) (Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 전 배양된 HaCaT cell 및 CCD-986sk cell을 96-well 플레이트에 5.0×104 cells/well로 각각 주입하여 24시간 배양하였으며, 이후 상층액을 제거한 후 DMEM broth에 희석한 시험제품을 1 mg/mL 기준으로 1000, 500, 250, 100, 50, 25 μg/mL의 농도로 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 그 후 다시 상층액을 제거한 뒤 MTT 용액(5 mg/mL)을 처리하여 약 5% 농도의 CO2, 37℃ incubator 환경에서 3시간 동안 MTT formazan을 용출하였으며 각 well에 생성된 formazan 결정이 제거되지 않게 상층액을 제거한 뒤 DMSO로 결정을 녹여 UVVisible Spectrophotometer (Ultrospec 3100 Pro; GE Healthcare)에서 540 nm 파장에서 두 cell의 흡광도를 각각 측정하였다.
3. 세포 내 항산화 효능 측정
본 시험에서는 세포 내의 활성산소와 2',7'-dichlorodihydroflu orescein diacetate (DCFH-DA)가 반응하여 녹색의 형광을 띠는 2',7'-dichlorofluorescein (DCF)으로 산화되는 원리인 DCF-DA assay를 시행하여 시험제품의 세포 내 항산화 효능을 측정하였다. 세포 독성 시험에서와 동일한 방법으로 HaCaT cell을 세포주로 사용하여 전 배양된 HaCaT cell을 96-well 플레이트에 5.0×104 cells/well로 주입하여 24시간 배양하였으며 이후 상층액을 제거한 후 20 μM DCFH-DA (Sigma-Aldrich)를 Hank's balanced salt solution (HBSS; Sigma-Aldrich)으로 희석하여 각 well에 주입 후 20 min 동안 배양하였다. 그 후 DMEM broth에 희석한 시험제품을 1 mg/mL 기준으로 1000, 500, 250, 100, 50, 25 μg/mL의 농도로 각각 처리한 뒤 24시간 동안 추가 배양한 후 배지를 제거하고 PBS buffer로 3회 세척한 뒤 500 μM의 H2O2를 처리하여 1시간 동안 산화 스트레스를 유도한 후 형성된 DCF fluorescence 값을 Multilabel plate reader (Victor3; PerkinElmer, USA)를 이용해 excitation 485 nm 및 emission 528 nm 파장에서 측정하였다. 도출된 값은 아래와 같이 radical scavenging activity (%)로 환산하여 비교하였다.
Radical scavenging activity (%)=100-((Testing essence OD/Cont. OD)×100)
4. UV B에 의해 유도되는 항 광노화 효능 측정
효소면역 측정법(ELISA)을 이용하여 UVB조사 후의 procollagen 생성량을 측정하는 방법으로, 항주름 효능을 측정하였다. CCD-986sk cell을 세포 독성 시험에서와 동일한 방법으로 전 배양한 후 96-well 플레이트에 1×104 cells/well로 주입하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 후 상층액을 제거하고 자외선 조사 시험의 경우 UVB (25 mJ/cm2)를 조사한 뒤, DMEM broth에 희석한 시험제품을 1 mg/mL 기준으로 1000, 500, 250, 100, 50, 25 μg/mL의 농도로 각각 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 그 후 상층액 100 μL와 pro collagen ELISA kit (Sigma-Aldrich)를 이용하여 콜라겐 생성량을 측정하였으며, 도출된 값은 collagen expression ratio (%)로 환산하여 비교하였다.
5. 인체 적용시험
1) 시험참여자 선정 및 평가 방법
본 연구는 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스를 다양한 외부환경에 노출되어 있는 인체 피부에 실제로 적용하였을 경우 항주름 효능은 어떠한가를 확인하고자 하였다. 내, 외부 환경으로 인한 피부의 노화를 인지하기 시작하는 연령대부터 피부 노화를 급격히 맞는 30세 이상-60세 미만의 건강한 성인 20명을 대상(평균 연령 43.73±5.30세)으로 대한민국 보건복지부 지정 공용기관생명윤리위원회의 승인(승인번호 P01-202301-01-02)하에 인체적용시험을 4주간 실시하였다. 이때 매일 아침과 저녁 2회, 동일한 세안제로 세안 후 시험제품을 4회 펌핑한 양(약 1.5 g)을 2회에 걸쳐 덧바르는 방법으로 약 3 g을 안면의 코를 중심으로 왼쪽 부위에 펴 바르도록 하였다.
본 시험 기간 동안 사용하는 동일한 세안제로 세안하고 최적의 항온 및 항습 조건인 실내온도 20-25℃ 및 상대습도 40-60%로 설정된 피부측정실에 입실 후 약 30 분간 안정을 취하되, 피부의 정확한 상태를 측정하기 위해 측정 시간 동안(약 1시간)의 수분 섭취는 제한하였다.
2) 평가 항목
본 시험참여자의 피부의 시험 전후의 주름 변화 양상을 정확하게 확인하기 위해 ANTERA 3D CS (Ver, 3.0; Miravex Limited, Ireland)를 이용하여 측정하였으며, 시험 전 측정 부위를 지정하여 측정한 후, 시험 후 측정 시에는 동일 부위를 follow up 하여 측정하였다.
평가 항목은 각 부위별 선택 영역에서의 잔주름, 진피 주름 및 굵은 주름으로 세분하여 살펴보았으며, 시험 전후 각 주름의 평균 깊이와 주름의 함몰 지수(주름으로 인해 야기된 피부 표면의 모든 고랑에 대한 평균 각도와 평균 깊이 및 피부 질감의 총환산 지수)를 함께 살펴 시험 전후 주름의 개선 여부를 비교하였다.
4. 통계 분석방법
본 연구의 수집된 자료는 SPSS WIN program (Ver. 28.0; IBM, USA)을 이용하여 분석하였으며, 비인체 적용시험의 결과는 descriptive statistics를 실시하여 평균(mean) 및 이에 대한 표준편차(standard deviation, SD)를 나타내어 측정치를 평가하였으며 대조군과의 비교는 paired samples t-test를 실시하여 결과를 도출하였다. 또한 인체 적용시험의 시험 전후 피부의 변화를 분석하기 위해 one-way ANOVA와 paired samples t-test를 실시하였으며, 통계학적 처리에서 유의 수준은 p＜0.05 기준으로 검증하였다.
Results and Discussion
1. 세포의 생존 및 활성 효과
저분자 펩타이드 복합물(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM; Vonestis)을 함유한 에센스의 세포독성을 살펴 피부에 안전한지를 검증하기 위하여 본 시험을 실시하였다. 이때 대조군은 아무런 처리도 하지 않은 세포 그대로를 사용하였으며, 시험제품을 각 농도별로 처리한 후, 정량적 방법을 사용하여 세포의 생존 및 활성율을 환산하여 측정치를 도출하였다.
그 결과는 Figure 1과 같으며, HaCaT cell에서의 시험제품 1000 μg/mL 농도에서 세포 활성율은 시험제품이 도포되지 않은 대조군에 비하여 약 95.90% (p＜0.05)로 유의미하게 나타났으며, 100 μg/mL 농도에서는 약 98.64%, 50 μg/mL 농도에서 약 99.48%, 25 μg/mL 농도에서도 약 99.86% 경향으로 각각 나타나, 각질 세포에서의 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스의 세포독성은 거의 없음을 확인하였다.
Cell viability.
The trial group was treated with each concentration of essence comprising peptide complexes, and the control group consisting of human keratinocyte cells (A) and human fibroblasts (B) was not treated; data are the average and standard deviation (mean±S.D.) obtained from 3 experiments; *p<0.05 compared with the control group.
또한 CCD-986sk cell에서의 시험제품 1000 μg/mL 농도에서 세포 활성율은 시험제품이 도포되지 않은 대조군에 비하여 약 93.24% (p＜0.05), 500 μg/mL 농도에서 약 97.08% (p＜0.05)로 각각 유의미하게 나타났으며, 100 μg/mL 농도에서도 약 99.44%로 나타나, 진피의 섬유아 세포에서의 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스의 세포독성도 거의 없음을 확인하였다. 게다가 50 μg/mL 농도에서는 약 102.11%, 25 μg/mL 농도에서는 약 102.23%로 세포의 생육을 오히려 활성시키는 것으로 확인되었다.
2. 표피 각질 세포에서의 항산화 효과
저분자 펩타이드 복합물(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM; Vonestis, Korea)을 함유한 에센스가 인체 세포 내에서의 활성산소를 얼마나 소거할 수 있는지를 살펴, 산화 스트레스에 의한 세포 보호 효과를 검증하기 위하여 본 시험을 실시하였다. 이때 대조군은 시험제품 처리 없이 HaCaT 세포에 H2O2만을 가하여 1시간 동안 산화 스트레스를 유도하였으며 시험군은 시험제품을 각 농도별로 HaCaT 세포에 처리한 후 H2O2만을 가하여 1시간 동안 산화 스트레스를 유도한 후 측정하였다. 분석 결과, DCF fluorescence의 OD value가 낮을수록 활성산소 소거능은 높은 것으로 판단하므로, 각 농도별 활성 산소 소거율은 대조군 DCF fluorescence의 OD value를 기준으로 각 cell에서의 OD value를 차감한 값으로 도출하였으며 이를 해석하였다.
그 결과는 Figure 2와 같으며, 시험제품이 도포되지 않은 대조군에 비하여 시험제품 1000 μg/mL 농도에서의 활성산소 소거율은 약 63.39% (p＜0.001), 500 μg/mL 농도에서는 약 33.08% (p＜0.001), 250 μg/mL 농도에서 약 14.22% (p＜0.01), 100 μg/mL 농도에서 약 6.43% (p＜0.001), 50 μg/mL 농도에서는 약 2.36% (p＜0.05)로 각각 유의미한 결과를 보였다.
DCF fluorescence intensity.
The trial group was treated with each concentration of essence comprising peptide complexes, and the control group consisting of human keratinocyte cells (HaCaT) was not treated; data are mean±S.D. from 3 experiments; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the control group.
피부의 노화 과정의 주요원인인 활성산소는 자외선에 피부가 노출되면 극적으로 증가하며(Lephart, 2016), 피부를 건조하게 하고 주름을 생성시키는 등으로 정상 피부를 손상하는 것으로 알려져 있다(Oh et al., 2015). 최근 들어 단일 펩타이드들의 항산화능이 보고된 바(Oh et al., 2015; Seo et al., 2020; Wong et al., 2020; Yang et al., 2020), 각질 세포에서의 항산화 효능이 단일 펩타이드의 항산화 효능보다 더 높은 결과를 보인 본 시험에서는 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스의 황산화력이 매우 우수함(농도 의존적)을 확인하였다.
3. 진피 섬유아세포에서의 항 광노화 효과
피부에 자외선을 쪼이게 되면 각질형성세포가 과증식하고 주름이 거칠게 생성되며 피부가 늘어지거나 거칠어지는 등의 전형적인 피부의 광노화가 특징적으로 나타나게 된다(Oh et al., 2014). 이에 따라 자외선 조사 전에 피부를 광노화로부터 보호할 수 있는 소재를 찾는 연구가 진행되고 있는데, 이러한 연구들에서 특이할 수 있는 것은 항광노화 프로세스에서 세포 내의 콜라겐 생성율이 그 기준이 된다는 점이다(Oh et al., 2014; Seo et al., 2020).
이에 저분자 펩타이드 복합물(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM; Vonestis)을 함유한 에센스가 자외선으로 유도되는 세포의 광노화를 억제하는지를 검증하기 위하여 자외선 B를 CCD-986sk 세포에 조사한 후 세포 내에 콜라겐 소실을 얼마나 방어할 수 있는지에 대한 시험을 실시하였다. 이때 양성 대조군은 CCD-986sk 세포에 시험제품 처리만 한 채 자외선 조사를 하지 않은 자연 상태로 방치한 후, 음성 대조군은 CCD-986sk 세포에 시험제품은 처리하지 않은 채 자외선만 조사한 후, 그리고 시험군은 CCD-986sk 세포에 시험제품을 각 농도별로 처리하여 자외선을 조사한 후 각각의 세포의 콜라겐 생성율을 측정하였다. 이때 양성 대조군에 비하여 콜라겐 양이 어느 정도인지를 백분율로 도출한 후, 콜라겐 양이 높을수록 UV B에 의해 유도되는 세포의 광노화를 억제하는 능력이 더 좋은 것으로 판단하였다.
그 결과는 Figure 3과 같이 양성 대조군에 대한 음성 대조군의 콜라겐 양이 약 63.75%로 그친 데 비하여 시험제품 1000 μg/mL 농도에서의 콜라겐 양은 약 102.14% (p＜0.01)로 유의미한 증가를 보여, 오히려 콜라겐 양이 증가한 것으로 확인되었다. 게다가 시험제품 500 μg/mL 농도에서는 약 95.81% (p＜0.01), 250 μg/mL 농도에서 90.52% (p＜0.01), 100 μg/mL 농도에서 82.97% (p＜0.01), 50 μg/mL 농도에서 74.52% (p＜0.001), 25 μg/mL 농도에서 74.52% (p＜0.001)로 각각 유의미한 결과를 보여 시험제품을 처리하지 않고 자외선을 조사한 음성 대조군에 비하여 모든 농도에서 콜라겐 양이 유의미하게 더 높은 것으로 나타났다.
Collagen expression ratio.
The trial group was exposed to UV-B after pretreatment with each concentration of essence comprising peptide complexes, and the control+ group consisting of normal human fibroblasts (CCD-986sk cells) was not treated; the control-group was only exposed to UV-B without any treatment; data are mean±S.D. from 3 experiments; **p<0.01, ***p<0.001 compared with the control+ group.
이는 단일 펩타이드의 콜라겐 생성과 함께 월등한 보습력도 나타낸다는 보고(Jones et al., 2013; Liu et al., 2019)와 재조합한 펩타이드에서도 콜라겐 생성 및 항산화 능이 함께 보고된 바(Wang et al., 2023)가 있어, 본 시험의 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스를 피부에 적용하였을 때 적용하지 않을 경우에 비하여 콜라겐 생성을 적극적으로 촉진하는 것이 확인되었다. 게다가 근본적으로 주름 생성을 억제하고 노화를 지연시킬 수 있는 효능이 약 160% 이상 우수한 것으로 확인된 것은 매우 고무적이며 이러한 보고들을 방증한 결과라고 할 수 있다.
이로써 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스가 콜라겐 생성을 촉진시켜, 자외선으로 인한 근본적으로 주름 생성을 억제하고 노화를 지연시키는 효능이 있음을 확인하였다.
4. 인체 적용시험에서의 항 주름 효과
피부의 노화 정도를 가늠하는 기준이 되는 주름은(Kim et al., 2010) 그 나타나는 양상에 따라 잔주름(fine lines), 진피성 주름(wrinkles), 굵은 주름(folds)으로 분류된다(Kligman et al., 1985).
이러한 주름의 진행이나 개선 정도는 피부의 노화 정도에 따라 다양하며(Anson et al., 2016), 화장품의 도포 전후에 나타난 주름의 평균 깊이(average depth) 및 주름으로 인해 함몰된 모든 고랑의 평균 지수(피부의 질감, 고랑의 각도와 평균 깊이를 지수화한 indentation index)의 감소 정도에 따라 주름의 개선 정도를 수치적으로 정확하게 가늠할 수 있다(Choi & Oh, 1997).
이에 본 인체 적용시험에서는 저분자 펩타이드 복합물(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM; Vonestis, Korea)을 함유한 에센스를 피부에 도포할 경우 노화 등으로 피부 표면에 나타나는 주름을 감소하는데 얼마나 도움이 되는지를 파악하기 위하여 피시험자의 안면의 시험 전후 피부 표면의 잔주름, 진피성 주름 및 깊은 주름의 평균 깊이와 각 주름 함몰지수 변화량을 비교 분석하였으며, 이를 토대로 시험제품이 다양한 수준의 주름으로 이미 손상된 피부를 얼마나 개선하는지를 통찰하였다. 이에 대한 결과는 Table 1 및 Figure 4와 같으며, 각 항목별 변화한 결과는 다음과 같다.
Variation in fine lines, wrinkles, and folds before and after the trial of applying essence
Changed images in skin fine lines, wrinkles and folds before and after treatment.
1) 주름의 평균 깊이(average depth) 개선 효과
피부가 노화하면서 가장 먼저 눈에 띄게 되는 피부 변화로 잔주름을 들 수 있으며, 보통은 이마 라인과 눈가에서 먼저 나타나게 된다(Kligman et al., 1985; Anson et al., 2016). 이러한 잔주름을 방치하거나 피부가 점차 노화가 되고 자외선에 과다 노출되면 진피의 탄력섬유 조직이 파괴되면서 피부는 구조적으로 함몰되게 되고 (Kligman et al., 1985; Chung, 2003), 피부 표면으로도 이 함몰된 조직이 그대로 표현되는데 이를 주름(wrinkles), 즉 진피성 주름이라 한다. 함몰되기 시작한 주름은 점차 진행되어 깊게 고랑이 되어 나타나는가 하면(Kligman et al., 1985), 잘못된 수면 습관이나 반복되는 표정으로 근육이 눌리거나 이동하는 등으로 중첩되면 깊은 주름, 즉 굵은 주름(Folds)도 나타난다(Ryu et al., 2015; Anson et al., 2016).
그러나 이렇게 생성된 주름들도 항 주름 기능성 화장품을 바르거나 물리적인 자극, 약물을 주입하는 등의 다양한 방법을 통해 피부 표면의 보습도가 개선되는 등으로 노화된 피부 문제가 점차 좋아지면 주름 형성을 지연하거나 개선될 수 있다고 보고하고 있다(Kim & Hong, 2015).
이에, 비인체 적용시험으로 항산화 및 항노화 효능이 월등한 것으로 입증이 된 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스를 실제로 피부에 도포하였을 경우 도포 전 피부에 나타난 주름들을 얼마나 개선하는지를 확인하기 위하여, 에센스 도포 전후에 나타나는 부위에 따라 동일하게 선택된 영역에서의 각 주름 평균 깊이의 변화량을 비교 분석하였다.
그 결과, 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스의 도포 전후 피부의 잔주름 평균 깊이 변화에서, 입가가 약 7.53% (p＜0.01) 유의하게 감소하는 등으로 전체 피부의 잔주름 평균 깊이가 약 5.59% 유의미한 감소를 하였다(p＜0.001). 또한 진피성 주름 평균 깊이 변화에서도 볼이 약 12.52% 유의하게 감소하는 등(p＜0.001), 전체 피부의 진피성 주름 평균 깊이가 도포하기 전보다 약 10.22% 유의미한 감소를 하였다(p＜0.001). 한편 굵은 주름 평균 깊이 변화에서는 그 변화가 더 뚜렷하여, 눈가에서 약 24.83% 유의하게 감소하는 등으로(p＜0.001), 도포하기 전 굵은 주름 평균 깊이가 약 20.53% 유의미한 감소를 하였다(p＜0.001)(Table 1, Figure 4).
2) 주름의 함몰지수(indentation index) 개선 효과
주름의 평균 깊이와 더불어 피부 전체의 주름을 과학적으로 수치화하여 확인할 수 있는 최적화된 척도인 주름의 함몰지수(indentation index)는(Choi & Oh, 1997) 현재의 연구에서도 꾸준히 사용하고 있다. 이는 주름으로 인해 야기된 피부 표면의 모든 고랑에 대한 평균 각도와 평균 깊이, 및 피부 질감을 환산하여 나타낸 지수로, 본 시험에서도 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스를 도포하기 전과 후의 각 주름의 함몰지수의 변화량을 비교 분석하여, 자외선으로 유도된 광노화 피부에서의 콜라겐 생성을 더 활성화하였던 본 시험제품이 실제로 피부에 도포되어도 그 효능을 나타내어 주름으로 인해 깊게 패어진 고랑이 메워졌는지를 확인하였다.
그 결과, 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스를 피부에 도포하였을 때 잔주름으로 인한 피부의 함몰지수 변화에서는 볼이 약 9.17% 도포 전보다 유의하게 감소하는 등으로(p＜0.001), 에센스를 4주간 도포한 후에는 잔주름으로 인한 피부의 함몰지수가 평균 약 7.79% 유의미한 감소를 하였다(p＜0.001). 또한 에센스의 도포 전후 진피성 주름으로 인한 피부의 함몰지수 변화에서도 입가에서 약 21.22% 유의하게 감소하는 등으로(p＜0.001), 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스를 도포하기 전에 비하여 피부의 함몰 지수가 평균 약 12.73% 유의미한 감소를 하였다(p＜0.001). 또한 에센스의 도포 전후 굵은 주름으로 인한 피부의 함몰지수 변화에서도 볼이 약 24.45% 유의하게 감소하는 등으로(p＜0.001), 도포하기 전 피부의 함몰지수가 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스를 4주간 도포한 후에는 평균 약 17.02% 유의미한 감소를 하였다(p＜0.001) (Table 1, Figure 4).
이렇게 피부에 고랑이 지고 함몰된 부분이 약 4주간의 화장품 도포로 유의미한 변화를 가져올 수 있다는 것은 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스가 다양한 요인으로 피부가 노화되면서 나타나는 피부의 다른 형상의 모든 주름들을 개선할 수 있다는 것으로 생각된다. 또한 주름의 깊이나 고랑이 심화된 부위일수록 그 효능이 더 우수하게 나타남으로 이는 in vitro test에서 확인된 콜라겐 생성능이 실제 피부에서도 그대로 활성화됨을 확증해준 결과로 볼 수 있으며, 이는 인체 섬유아세포, 연령 및 피부 세포가 가지는 기계적 특성 등에 대한 주름 방지 트리펩타이드가 각기 차이가 나게 작용한다는 보고(Dulińska-Molak et al., 2014)를 방증한 결과이기도 하다. 게다가 단일 펩타이드에서보다 몇 개의 펩타이드를 조합하여 피부에 적용하면 그 효능이 더 상승할 수 있을 것이라는 보고(Errante et al., 2020)를 확증해준 매우 고무적인 결과라고 할 수 있다.
Conclusion
본 연구에서는 저분자 펩타이드 복합물(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM; Vonestis, Korea)을 함유하여 제조한 화장품이 피부에 안전한지를 확인하기 위하여 세포 독성 시험을 시행하였으며, 피부의 활성산소를 얼마나 제거할 수 있는지를 확인하기 위하여 세포 내 항산화능을, 그리고 자외선을 조사하여 유도된 피부에서도 노화가 지연되는지를 확인하기 위하여 광노화 억제 능 시험을 비인체적용시험(in vitro test)을 통하여 각각 실시하였다. 더불어 이러한 시험 결과가 실제로 피부에도 적용되어 노화로 인해 다양하게 나타나는 주름을 개선하는지를 검증하고자 인체적용시험(in vivo test)을 4주간 시행하였으며, 부위에 따라 동일하게 선택된 영역에서의 각 주름의 평균 깊이와 함몰지수 변화를 비교 분석함으로 주름의 개선 여부를 판단하였다. 결과는 다음과 같다.
1. 세포 생존 및 활성 효능
본 시험제품인 저분자 펩타이드 복합물은 표피 각질 세포 및 진피 섬유아세포에서 세포 생존율이 95% 이상으로 유의하게 높게 나타나, 피부에 매우 안전한 것으로 확인되었다.
2. 표피 각질 세포에서의 항산화 효능
본 저분자 펩타이드 복합물의 활성산소 소거율이 농도 의존적으로 유의미하게 높은 소거율을 보였다.
3. 진피 섬유아세포에서의 항광노화 효능
양성 대조군에 대한 음성 대조군의 콜라겐 양이 약 63.75%로 나타난 데 비하여 저분자 펩타이드 복합물 처리를 한 후 자외선을 조사한 경우의 콜라겐 양은 오히려 증가한 것으로 확인되었다. 게다가 시험제품을 처리하지 않고 자외선을 조사한 음성 대조군에 비하여 모든 농도에서 콜라겐 양이 유의미하게 더 높게 나타났다.
4. 인체 적용시험에서의 항주름 효능
저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스의 도포 전후 주름의 평균 깊이 변화에서 모든 주름의 모든 부위에서 도포하기 전 주름의 평균 깊이가 유의미하게 감소하였다.
또한 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스 도포 전후의 주름으로 인한 피부의 함몰 지수 변화에서도 모든 주름의 모든 부위에서 유의미하게 감소하였다.
이와 같은 결과로, 저분자 펩타이드 복합물(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM)을 함유한 에센스는 세포 생존 및 활성율이 매우 우수하여 피부에 안전하며, 피부 노화에 직접 영향을 미치는 세포 내의 활성산소를 소거하는 항산화 기능이 매우 우수한 것으로 확인되었다. 또한 저분자 펩타이드 복합물을 적용하지 않은 경우에 비하여 콜라겐 생성을 적극적으로 촉진해 근본적으로 주름 생성을 억제하고 노화를 지연시킬 수 있는 효능이 매우 우수한 것으로 확인되었다.
더불어 저분자 펩타이드 복합물을 함유한 에센스를 실제로 4주 간 도포한 후 주름 개선 정도를 살펴본 결과, 다양한 요인으로 피부가 노화되면서 나타나는 피부의 주름들이 완화되고 이에 따라 함몰되어 탄력을 잃었던 피부가 점차 정상으로 회복됨을 확증하여 in vitro test에서 확인된 콜라겐 합성 활성화 능도 검증할 수 있었다.
이처럼 저분자 펩타이드 복합물이 함유된 화장품의 항산화, 항 광노화 및 항 주름 효과에서 4주 이상 지속적으로 도포할 경우 매우 우수한 효능이 나타나며, 나아가 코스메슈티컬의 활성 소재로서 저분자 펩타이드 복합물의 사용성도 확증하였다. 따라서 향후, 피부 효능이 알려진 단일 펩타이드에 비해 그 효능을 더 상승시킬 수 있는 펩타이드 복합물의 개발이 더 발전될 것이며, 그 가도에 본 연구가 이론의 근간이 될 것으로 보인다.
Notes
Author's contribution
DSH and GSK contributed equally to this work. DSH and GSK designed this study together and GSK performed experiments, analyzed data, created figures and DSH wrote the manuscript. All authors read and confirmed together the final version of manuscript.
Author details
Do-Sook Han (CEO), VONESTIS Co., Ltd, 803, Nonhyeon-ro, Gangnam-gu, Seoul 06032, Korea; Gi-Sook Kim (Research Director), ONTOLOGENE∙BIO Co., Ltd, 379, Yeouidaebang-ro, Yeongdeungpo-gu, Seoul 07333, Korea.