파라페닐렌디아민으로 세포 독성 및 염증을 유도한 마우스 대식세포에서 Derma GenieTM-H002의 세포 보호 및 항염증 효과
Cytoprotective and Anti-inflammatory Effects of Derma Genie™-H002 against Paraphenylenediamine-induced Cytotoxicity and Inflammation in RAW 264.7 Cells
Derma Genie™-H002对RAW 264.7 细胞中对苯二胺诱导的细胞毒性和炎症的细胞保护和抗炎作用
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Abstract
목적
본 연구는 마우스 대식 세포 내에서 파라페닐렌디아민에 의한 세포 독성 및 염증 모델을 수립하고, 해당 in vitro 모델 내에서 5종의 생약 복합 추출물로 구성된 Derma GenieTM-H002의 세포 보호 및 항염 효능을 확인하고자 하였다.
방법
PPD에 의한 세포 독성 및 염증 모델에서 Derma GenieTM-H002의 효능을 평가하기 위해 수용성 테트라졸리움 염색법, 크리스탈 바이올렛 염색법, 그리고 젖산 탈수소효소 분석 시험을 포함한 다양한 생화학 분석법이 활용되었다. 또한 세포 사멸 연관 유전자 및 염증 연관 유전자들의 분석을 위해서 역전사 중합효소 연쇄 반응과 웨스턴 블롯이 활용되었다.
결과
Derma GenieTM-H002는 마우스 대식세포에서 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다. 반면 PPD는 저농도(25 μM) 이상에서 유의한 세포 독성이 관찰되었다. PPD와 Derma GenieTM-H002의 병용 처리는 PPD에 의해 감소된 세포 생존율을 개선하였고, PPD에 의해 증가된 세포 독성을 완화하였으며, 세포 사멸을 촉진하는 단백질인 Bax의 발현량은 감소시키고, 세포 사멸을 억제하는 단백질인 Bl-c2의 발현량은 증가시킴으로써 PPD에 의한 독성 모델에서의 세포 보호 효능을 입증하였다. 또한 PPD와 Derma GenieTM-H002의 병용 처리는 PPD에 의해 증가된 염증 복합체 연관 유전자, 염증성 사이토카인 및 알레르기성 접촉 피부염 연관 유전자의 발현을 모두 감소시켰으며, PPD에 의해 증가된 NF-κB 단백질 발현량을 감소시켰으므로 PPD에 의한 염증 모델에서의 항염 효능을 입증하였다.
결론
본 연구는 Derma GenieTM-H002가 PPD에 의해 유발된 마우스 대식 세포 내 독성 및 염증을 효과적으로 완화시킨다는 것을 입증하였다. 따라서 천연물 유래 원료인 Derma GenieTM-H002의 기능성 항염 소재로의 적용 가능성을 확인하였다.
Trans Abstract
Purpose
This study aimed to establish an in vitro model to examine paraphenylenediamine (PPD)-induced cytotoxicity and inflammation within RAW 264.7 cells. Additionally, we investigated the cytoprotective and anti-inflammatory effects of Derma Genie™-H002 derived from extracts of five medicinal herbs.
Methods
Various biochemical analyses, including water-soluble tetrazolium salt, crystal violet staining, and lactate dehydrogenase leakage assays, were employed to evaluate the impact of Derma Genie™-H002 on PPD-induced cytotoxicity and inflammation. Furthermore, apoptosis- and inflammation-related gene expression was analyzed using reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blotting.
Results
Derma Genie™-H002 exhibited no significant cytotoxicity in RAW 264.7 cells, whereas PPD induced notable cytotoxicity at concentrations >25 μM. Cotreatment with PPD and Derma Genie™-H002 not only improved cell proliferation rates but also alleviated cell viability in PPD-induced RAW 264.7 cells. Furthermore, findings demonstrated that Derma Genie™-H002 mitigates the cytotoxicity of PPD-induced RAW 264.7 cells by reducing the expression of the proapoptotic protein Bax and increasing the expression of the antiapoptotic protein Bcl-2. Moreover, cotreatment with PPD and Derma Genie™-H002 downregulated the mRNA expression of inflammasome-related genes, inflammatory cytokines, and allergic contact dermatitis-related genes, all elevated by PPD. The increased expression of nuclear factor-κB protein induced by PPD was also reduced upon cotreatment with Derma Genie™-H002, providing compelling evidence of its anti-inflammatory efficacy in the PPD-induced inflammation model.
Conclusion
This study demonstrated that Derma Genie™-H002 effectively alleviates PPD-induced cytotoxicity and inflammation in RAW 264.7 cells. Therefore, the potential application of Derma Genie™-H002 as a naturally derived functional anti-inflammatory material has been validated.
Trans Abstract
目的
建立体外模型来检查对苯二胺(PPD)诱导的RAW 264.7细胞内的细胞毒性和炎症，并调查了源自五种草药提取物的Derma Genie™-H002的细胞保护和抗炎作用。
方法
采用各种生化分析(包括水溶性四唑盐、结晶紫染色和乳酸脱氢酶渗漏测定)来评估 Derma Genie™-H002 对PPD诱导的细胞毒性和炎症的影响。此外，使用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹分析了细胞凋亡和炎症相关基因的表达。
结果
Derma Genie™-H002在RAW264.细胞中没有表现出明显的细胞毒性，而PPD在浓度25 μM以上时，会诱导显着的细胞毒性。PPD和Derma Genie™-H002共处理不仅提高了细胞增殖率，还降低了PPD诱导的RAW 264.7细胞的细胞活力。此外，研究结果表明，Derma Genie™-H002通过减少促凋亡蛋白Bax的表达并增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，减轻PPD诱导的RAW 264.7细胞的细胞毒性。此外，PPD和Derma Genie™-H002 联合治疗可下调炎症体相关基因、炎症细胞因子和过敏性接触性皮炎相关基因的mRN表达，而这些基因的表达均因PPD而升高。在与Derma Genie™-H002共同治疗后，PPD诱导的核因子κB蛋白表达增加也有所减少，这为其在 PPD诱导的炎症模型中的抗炎功效提供了令人信服的证据。
结论
这项研究表明 Derma Genie™-H002 可有效减轻 RAW 264.7 细胞中 PPD 诱导的细胞毒性和炎症。因此，Derma Genie™-H002作为天然来源的功能性抗炎材料的潜在应用已经得到验证。
Introduction
접촉성 피부염(contact dermatitis)은 알레르기 항원(allergen) 또는 자극 물질에 대한 노출로 인해 발생하는 흔한 염증성 피부 질환이다(Li & Li, 2021). 알레르기 항원 또는 자극 물질에 노출된 조직의 염증 반응은 피부의 표피(epidermis)에서부터 시작되며, 홍반(erythema), 부종(edema), 소양감(itching) 및 작열감(burning sensation) 등의 증상을 동반하는 것이 특징이다(Leonard & Guttman-Yassky, 2019). 접촉성 피부염은 크게 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis, ACD)과 자극성 접촉 피부염(irritant contact dermatitis, ICD)으로 구분되는데, ICD는 전체 접촉 피부염 사례의 약 80%를, ACD는 전체 접촉 피부염 사례의 약 20%를 차지한다고 보고되어 있다(Beltrani & Beltrani, 1997; Mark & Slavin, 2006; Novak-Bilić et al., 2018). 직접적인 물리적·화학적 자극에 대한 비특이적 반응에 해당하는 ICD와는 다르게, ACD는 적은 알레르겐 농도에서도 비정상적 면역 반응을 유발할 수 있고, 알레르겐의 탐지(detection) 및 회피(avoidance)가 어렵기 때문에 치료(therapy)에 많은 노력이 필요한 것으로 알려져 있다(Kostner et al., 2017). 또한 ACD는 미국 내 전체 직업병 사례의 약 7%를 차지하고, 생산성 손실, 의료 비용 투입 및 장애 비용 지급 등으로 연간 2억 5천만 달러 이상의 손실을 야기하므로 공중 보건에서 ACD의 치료 및 예방을 위한 연구가 필요한 실정이다 (Belsito, 2000; Brites et al., 2020).
파라페닐렌디아민(Paraphenylenediamine, PPD)은 니켈(nickel), 우루시올(urushiol)과 더불어 ACD를 유발하는 주요 알레르겐 중 하나이다(Cohen, 2004). PPD는 파라니트로아닐린(para-nitroaniline) 의 유도체인데, 단백질 친화도가 높아 모발 침투가 용이하고, 가격이 저렴하다는 장점 때문에 산화형 염모제의 주요 성분으로 사용되고 있다(Hamann et al., 2014). 선행 연구에서는 ACD 사례의 약 5% 이상이 PPD에 의해 유발되는 것으로 밝히고 있으며, PPD의 장기 노출은 ACD와 더불어 신장 및 기관지 손상 등 높은 신체 독성을 유발할 수 있기 때문에 사용에 각별한 주의가 필요하다(Hamdouk et al., 2011; Handa et al., 2012; Thyssen et al., 2009; Zug et al., 2009). 산업에서는 전체 염모제 제품 중 약 70% 이상의 제품에서 PPD 성분이 사용되고 있는 만큼, PPD에 의해 유발되는 세포 독성 및 염증을 완화하는데 도움을 줄 수 있는 천연물 유래의 소재 개발이 필요한 실정이다(Belsito, 2000; Handa et al., 2012).
측백(Platycladus orientalis), 한련초(Eclipta prostrata), 병풀(Centella asiatica), 곰취(Ligularia fischeri) 및 녹차(Camellia sinensis)는 전통적으로 항염(anti-inflammation) 소재로 활용되어온 약용 식물이다(Gan et al., 2021; Lee & Choi, 2008; Lin et al., 2023; Morel et al., 2024; Tasneem et al., 2019). 특히 측백에 는 아프젤린(afzelin) 및 미리세틴(myricetin), 한련초에는 웨델로락톤(wedelolactone) 및 데메틸웨델로락톤(demethylwedelolactone), 병풀에는 아시아티코사이드(asiaticoside), 마데카소사이드(madecassoside), 아시아틱산(asiatic acid), 마데카식산(madecassic acid), 곰취에는 4,5-Di-O-caffeoylquinic acid, 녹차에는 epigallocatechin-3-gallate 등의 파이토케미컬(phytochemical) 성분이 다량 함유되어 있고, 이를 통해 항염 작용을 수행하는 것으로 보고되어 있다. 하지만 해당 약용 식물 및 이의 주요 성분들이 PPD에 의해 유도된 세포 독성 및 염증에는 어떠한 작용을 하는지는 알려져 있지 않으므로 이와 관련된 연구가 필요할 것으로 보인다(Darwish et al., 2021; He et al., 2023; Kim et al., 2017; Morel et al., 2024; Tasneem et al., 2019).
따라서 본 연구는, 산업 내에서 화장품 및 식품으로 제조 시 주로 복합물의 형태로 사용됨을 고려하여 상기 5종의 약용 식물을 특정 비율로 복합 추출하였으며, 이의 방법으로 제조된 Derma GenieTM-H002의 세포 보호 및 항염증 효능을 PPD로 유도한 세포 독성 및 염증 모델에서 확인하고자 하였다.
Methods
1. 시료 준비
본 연구에 사용된 Derma GenieTM-H002는 5종의 약용식물(측백, 한련초, 병풀, 곰취, 녹차)로 구성된 추출물이다. 측백, 한련초, 병풀, 곰취, 녹차의 복합 추출물은 ㈜에이엔엑스(Korea)에서 제공받아 사용되었다. 복합 추출물은 진공 하에 회전 증발 농축기(Rotavapor R-100; Buchi, Switzerland)를 사용하여 농축되었고, 이후 48 h 동안 동결 건조기에서 동결 건조하였다(TFD-100; ilShinBioBase Co., Ltd., Korea). 동결 건조된 복합 추출물을 통해 약 2.15 g의 고형분을 수득하였고, 100 mg/mL 농도가 되도록 증류수에 용해하여 -20℃ 에서 보관하였다. 시료는 세포 보호 및 항염 효능을 분석하기 위해 사용되었다.
2. 세포 배양
연구에 사용된 마우스 대식세포(RAW 264.7 cells)는 한국세포주 은행(No. 40071; KCLB, Korea)에서 분양 받았으며, 세포의 배양을 위해서 RPMI-1640 medium (R8758; Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였다. 세포는 세포배양기를 이용하여 37℃, 5% CO2 상태에서 배양 및 유지하였다.
3. 세포 생존율 및 독성 평가
1) 마우스 대식세포를 이용한 세포 생존율 측정
세포 독성의 평가는 water-soluble tetrazolium salt (WST-1) assay를 통해 진행되었다. 96-well plate에 RAW 264.7 세포가 5×103 cells/well의 농도가 되도록 분주하여 세포배양기에 24 h 동안 배양하였다. 이후 Derma GenieTM (0-400 μg/mL) 또는 PPD (0-100 μM)를 처리한 뒤, 48 h 동안 추가 배양하였다. 배양된 세포는 세포 배양액을 제거한 뒤 phosphate buffer saline (PBS; Welgene, Korea)을 이용하여 1회 세척한 후 EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit reagent (DoGenBio, Korea) 혼합액을 100 µL씩 처리하여 30 min 동안 세포배양기에서 반응시켰다. 이후 Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader (Bioteck, USA)를 통해 450 nm 파장에서 흡광도를 측정한 뒤 결과 값을 분석하였다.
2) 파라페닐렌디아민에 의한 독성 모델에서의 세포 생존율 측정
PPD에 의해 유도된 독성 모델에서 Derma GenieTM의 세포 생존율 개선 효과는 WST-1 assay를 통해 분석되었다. RAW 264.7 세포는 96-well plate에 5×103 cells/well 농도가 되도록 분주하여 24 h 동안 배양하였다. 이후 Derma GenieTM (0-400 μg/mL)와 PPD (50 μM)를 병용 처리하여 24 h, 48 h 동안 추가 배양하였다. 음성 대조군으로는 PPD (50 μM) 단독 처리군을 사용하였으며, WST-1 assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다.
3) 파라페닐렌디아민에 의한 독성 모델에서의 세포 증식률 측정
PPD에 의해 유도된 독성 모델에서 Derma GenieTM의 세포 증식률 개선 효능을 측정하기 위해서 crystal violet staining assay를 진행하였다. RAW 264.7 세포는 12 well plate에 1×105 cells/well 농도가 되도록 접종한 후 24 h 동안 배양하였다. 이후 Derma GenieTM (0-400 μg/mL)와 PPD (50 μM)를 병용 처리하여 48 h 동안 추가 배양하였다. 48 h 이후 세포 배양을 중단한 뒤, 각 well 당 PBS를 500 μL씩 분주하여 2회 세척한 후 남은 PBS를 제거하였다. 건조된 12 well plate를 0.5% crystal violet (Biopure, Korea) solution으로 2 h 동안 염색하였다. 염색이 완료된 세포는 증류수로 10회 세척한 후 완전히 건조시켰다. 이후 100% methanol solution으로 세포 내 염착된 crystal violet solution을 녹여낸 후에 Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader (Bioteck)을 이용하여 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
4) 파라페닐렌디아민에 의한 독성 모델에서의 세포 사멸 분석
세포 사멸(cell death) 정도를 측정하기 위해, 손상된 세포 및 사멸된 세포에서 방출되는 lactate dehydrogenase 활성을 배양액으로부터 확인하였다. RAW 264.7 세포는 96-well plate에 각 well 당 5×103 cells씩 분주하여 배양하고, Derma GenieTM (0-400 μg/mL)와 PPD (100 μM)를 병용 처리하여 48 h 동안 추가 배양하였다. 음성대조군으로는 PPD (100 μM) 단독 처리군을 사용하였다. 배양이 완료된 세포의 배양 상층액을 각 10 μL씩 새로운 96-well plate에 분주한 후 EZ-LDH Cell Cytotoxicity Assay Kit reagent (Biomax, Korea) 혼합액을 각각 100 μL씩 처리하여 30 min 동안 세포배양기에서 반응시킨 후, Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader (Bioteck)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR)
Derma GenieTM를 처리한 RAW 264.7 세포 내의 유전자 발현 변화를 분석하고자 RT-PCR을 이용하였다. Total RNA는 RiboEX reagent (GeneAll Biotechnology, Korea)를 통해 추출하였고 cDNA는 1 µg의 total RNA와 1.5 mM dNTPs, oligo dT primers, 5×First-Strand Buffer, 0.1 M DTT, 그리고 M-MLV reverse transcriptase (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용해 합성하였다. 유전자 발현량을 정량하기 위해 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gapdh)를 사용하였다. 분석에 사용된 특정 유전자의 primer 서열의 경우 Table 1과 같다.
List of primers for reverse transcription polymerase chain reaction
5. Western blot analysis
Derma GenieTM를 처리한 RAW 264.7 세포 내의 단백질 발현 변화를 분석하고자 Western blot analysis를 수행하였다. RAW 264.7 세포는 60 mm dish 당 7.5×105 cells 농도가 되도록 접종한 뒤에 24 h 동안 배양하였다. 이후 Derma GenieTM (0-400 μg/mL)와 PPD (0-100 μM)를 병용 처리하여 24 h 동안 추가 반응시켰다. 세포는 RIPA buffer로 용해한 뒤에, 최대 20 μg의 단백질 용해물을 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 겔을 통해 80V 로 2 h 동안 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 이후 단백질이 분리된 겔은 electro-blotter를 이용하여 80V로 최대 2 h 동안 PVDF membrane에 옮겼다. PVDF membrane은 5% skim milk solution 에 1 h 동안 교반하였으며, TBST buffer를 통해 3회 washing 하였다. Membrane은 1차 항체를 사용해 4℃에서 overnight 하였고, 다시 TBST buffer로 3회 washing 한 뒤 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP; Cell Signaling Technology, USA)를 1:1000으로 희석하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. TBST buffer로 3회 washing 후 ECL kit (Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 필름에 감광시키는 방법을 통해 단백질의 발현을 조사하였다. Western blot 분석에 사용된 항체는 다음과 같다. β-actin (1:1000; Santa Cruz, USA), Bcl-2 (1:1000; Cell Signaling Technology), Bax (1:1000; Cell Signaling Technology), NF-κB (1:1000; Cell Signaling Technology).
6. 통계분석 방법
본 연구는 동일하고 독립적인 조건하에 3회 이상의 반복 실험을 실시하였다. 통계 분석에는 GraphPAD Prism 8.0 (GraphPad Software, USA)이 사용되었으며, 각 실험에 관하여 one-way ANOVA 분석을 이용하여 p-value<0.05 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001) 이하일 경우 통계적으로 유의하다고 검정하였다.
Results and Discussion
1. 세포 생존율 및 독성 평가
1) Derma GenieTM-H002의 세포 생존율 평가
PPD에 의한 독성 및 염증 모델에서 Derma GenieTM-H002의 세포 보호 및 항염 효과를 평가하기 전에, RAW 264.7 세포에서 Derma GenieTM의 단독 처리에 따른 세포 독성을 확인하였다. 0, 20, 50, 100, 200, 400 μg/mL의 Derma GenieTM를 RAW 264.7 세포에 처리한 후, WST-1 assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다. 실험 결과, Derma GenieTM의 최대 농도(400 μg/mL)에서도 세포 독성이 나타나지 않았으며, Derma GenieTM 20, 50, 100, 200, 400 μg/mL 처리 농도에서 각각 126.49%, 143.49%, 155.06%, 144.42%, 133.89%로 대조군(vehicle-treated group)에 비해 세포 생존율이 유의하게 증가함을 확인하였다(Figure 1A). 따라서 최대 400 μg/mL 농도의 Derma GenieTM를 사용하여 이후 실험을 진행하였다.
Effects of Derma Genie™-H002 and PPD on cell viability in RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were seeded in 96-well plates (6×103 cells/well) and treated with the indicated concentrations of Derma Genie™-H002 (A) or PPD (B) for 48 h. Cell viabilities of RAW 264.7 cells were measured via a WST-1 assay. Results are the mean±SD of three independent experiments analyzed using a one-way ANOVA, followed by Tukey’s test. *p<0.05; **p<0.01; ***,###p<0.001 compared to the vehicle-treated group.
2) PPD의 세포 생존율 평가
PPD는 주로 흑색 염모제에 사용되는 화합물로 피부 자극을 유발할 수 있는 성분으로 알려져 있다(McFadden et al., 2011; Mukkanna et al., 2017). 또한 PPD의 과량 노출은 급성 신부전(acute renal failure), 간 괴사(hepatic necrosis), 호흡 곤란(respiratory distress) 등의 신체 독성을 야기할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 조직에서의 독성 반응을 보이는 것으로 보고되어 있다(Chaudhary et al., 2013; Woo et al., 2021). 따라서 본 실험에서는 PPD 자극을 통한 in vitro 독성 모델을 확립하고자 하였으며, 이를 위해서 PPD 단독 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 생존율을 평가하였다. RAW 264.7 세포에 5, 10, 25, 50, 100 μM의 PPD를 48 h 동안 처리한 후 WST-1 assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다(Figure 1B). 실험 결과, 25, 50, 100 μM 농도에서 각각 71.69%, 54.95%, 27.17%로 대조군에 비해 세포 생존율이 유의하게 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는 PPD가 25 μM 이상에서 농도 의존적으로 세포 독성을 증가시킴을 보여준다.
2. PPD에 의한 in vitro 독성 모델에서 Derma GenieTM의 세포 보호 효과
1) 세포 생존율 개선 효과
PPD에 의해 독성이 유발된 세포에서 Derma GenieTM의 세포 보호 효과를 확인하기 위해, RAW 264.7 세포에서 PPD (50 μM)와 Derma GenieTM (0-400 μg/mL)를 24 h 또는 48 h 동안 병용 처리하였다. 이후 세포 생존율은 WST-1 assay를 통해 분석되었다(Figure 2A). 그 결과, PPD (50 μM)만 처리한 음성 대조군에서는 세포 생존률이 24 h에서는 76.57%, 48 h에서는 64.93%로 시간 의존적으로 감소하는 경향성을 확인할 수 있었다. 반면 PPD (50 μM)와 Derma GenieTM (0-400 μg/mL)를 병용 처리한 군에서는 음성 대조군에 비해 상당한 세포 생존율 개선 효과를 보였다(Figure 2A). 특히 48 h 동안 병용 처리한 군에서는 Derma GenieTM의 농도 의존적으로 세포 생존율이 개선되었는데, 400 μg/mL 농도에서 103.48%로 회복되어 대조군과 유사한 세포 생존율을 보였다. 이와 같은 경향성은 현미경 촬영 결과에서도 확인되었으며, PPD (50 μM)를 단독 처리할 때 나타나는 세포 수의 감소가 Derma GenieTM (200, 400 μg/mL)의 병용 처리에 의해 상당히 개선됨을 확인하였다(Figure 2B).
Protective effects of Derma Genie™-H002 on PPD-induced cytotoxicity in RAW 264.7 cells.
(A) Improved cell viability of RAW 264.7 cells treated with Derma Genie™-H002 against PPD stimulation. RAW 264.7 cells were cotreated with Derma Genie™-H002 and PPD for 24 and 48 h, with cell viabilities being measured via a WST-1 assay. (B) Representative images of PPD-induced RAW 264.7 cells captured by phase-contrast microscopy. (C) Proliferation rate of PPD-induced RAW 264.7 cells measured via crystal violet assay. (D) Proliferation rate of Derma Genie™-H002 treated RAW 264.7 cells measured via crystal violet assay. Results are the mean±SD of three independent experiments analyzed using a one-way ANOVA, followed by Tukey’s test. ##p<0.01; ###p<0.001 compared to the vehicle-treated group; ***p<0.001 compared to the PPD-treated group.
2) 세포 증식률 개선 효과
세포 생존율(cell viability)은 건강한 세포의 수를 나타내는 지표로, 이는 주로 약물 독성을 평가하는 데 활용된다(Kupcsik, 2011). 세포 생존율 분석에는 다양한 방식이 이용되는데, 그 중 WST-1 assay는 화학물질의 세포 독성을 평가하는 데 널리 사용되는 시험법 중 하나이다(Thangaraj, 2016). WST-1 시약은 테트라졸리움(tetrazolium) 기반 분석을 통해 세포 생존 가능성을 평가하며, 이는 살아 있는 세포의 미토콘드리아 탈수소 효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 테트라졸리움 염이 포르마잔(formazan) 염료로 분해되어 색 변화로 나타난다(Berridge et al., 2005). 그러나 해당 방법은 다른 화학물질과의 상호작용 및 미토콘드리아 효소의 작용으로 인한 혼란을 초래할 수 있다(Scarcello et al., 2020). 따라서 이후 실험에서는 PPD에 의해 감소된 세포 생존율을 개선하는 Derma GenieTM의 보호 효능을 뒷받침하기 위해, crystal violet staining assay를 수행하였다. Crystal violet staining assay는 DNA에 결합할 수 있는 triarylmethane 계열 염료를 통해, 부착된 세포만을 염착시켜 세포 증식률을 분석하는 실험 방법이다(Feoktistova et al., 2016). 실험 결과에 따르면, PPD에 의한 세포 증식률의 감소가 Derma GenieTM의 병용 처리로 인해 완화되었다(Figure 2C). PPD (50 μM)를 48 h 동안 단독 처리한 음성 대조군에서는 40.46%의 세포 증식률을 보였으나, Derma GenieTM (0-400 μg/mL)를 병용 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 증식률이 개선됨을 확인하였다(Figure 2C). 특히 400 μg/mL의 Derma GenieTM 병용 처리군에서는 음성 대조군에 비해 세포 증식률이 32.32% 개선됨을 보였는데, 이를 통해 Derma GenieTM의 우수한 세포 보호 효능을 확인할 수 있었다. 이후 실험에서는, 이러한 세포 증식률 개선 효능이 단순한 증식 증가에 의한 현상이 아님을 확인하고자 하였다. 이를 위해 RAW 264.7 세포에 Derma GenieTM를 48 h 동안 단독 처리하였다. 그 결과, 50, 100 μg/mL 농도의 Derma GenieTM 처리는 세포 증식률에 유의한 영향을 미치지 않았다. 반면 200, 400 μg/mL 농도의 Derma GenieTM 처리는 각각 105.56%, 107.19%의 미미한 세포 증식률의 증가를 보였으나, 이는 PPD로 인한 세포 독성을 회복하는데 주요하게 영향을 미치지 않았다는 것으로 사료된다(Figure 2D).
3) 세포 사멸 보호 효과
Lactate dehydrogenase (LDH) assay는 세포 외 배지로 누출된 LDH의 활성을 측정하는 방법으로, LDH의 손실과 배양 배지로의 방출은 세포막 손상으로 인한 세포 사멸을 나타내는 중요한 지표이다(Fotakis & Timbrell, 2006). 본 연구에서는 PPD에 의한 세포 사멸 환경을 모방하기 위해 RAW 264.7 세포에 고농도의 PPD (100 μM)를 48 h 동안 처리하고, 이후 LDH 활성을 측정하여 세포의 사멸 정도를 분석하였다. 결과적으로, PPD (100 μM)를 단독 처리한 음성대조군은 LDH 활성이 279.68%를 나타내며, 대조군에 비해 유의하게 증가하는 양상을 확인할 수 있었다(Figure 3A). 반면 PPD (100 μM)와 Derma GenieTM를 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 병용 처리한 군에서는 LDH의 활성이 각각 263.17%, 231.75%, 212.22%, 149.68%로 음성 대조군에 비해 농도 의존적인 감소 효능을 확인하였다(Figure 3A). 이러한 결과는 Derma GenieTM가 RAW 264.7 세포에서 독성을 유발하지 않으며, PPD로 인한 세포 사멸을 상당히 보호하는 효과가 있음을 시사한다.
Antiapoptotic effects of Derma Genie™-H002 on PPD-induced apoptosis in RAW 264.7 cells.
(A) PPD-induced cell death was quantified by measuring LDH activity from damaged cells cotreated with Derma Genie™-H002 and PPD for 48 h. (B) mRNA expression level of apoptosis-related genes (Bax and Bcl-2) detected via RT-PCR. Gapdh served as a loading control. (C) Quantification of mRNA level carried out using ImageJ. (D) Protein level of Bax and Bcl-2 analyzed via Western blotting. β-actin served as a loading control. (E) Quantification of protein level carried out using ImageJ. Results are the mean±SD of three independent experiments analyzed using a one-way ANOVA, followed by Tukey’s test. ###p<0.001 compared to the vehicle-treated group; ***p<0.001 compared to the PPD-treated group.
4) 세포 사멸 관련 유전자 및 단백질 발현 분석
Bcl-2 패밀리는 세포 생존, 증식 그리고 사멸과 관련된 주요한 단백질로, pro-apoptotic 및 anti-apoptotic 단백질로 구분된다(Reed, 1998). Bax와 Bcl-2는 이 중 대표적인 Bcl-2 패밀리 구성원으로, 각각 pro-apoptotic과 anti-apoptotic 기능을 수행하며 세포 사멸을 조절한다(Antonsson & Martinou, 2000). 해당 실험에서는 PPD가 유도된 독성 모델에서 세포 보호 효능을 보인 Derma GenieTM가 세포 사멸과 연관된 유전자 및 단백질의 발현에도 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 이를 위해 RAW 264.7 세포에 24 h 동안 PPD (100 μM) 및 Derma GenieTM (200, 400 μg/mL)를 처리한 후, Bax 및 Bcl-2의 발현을 조사하였다(Figure 3B-E). RT-PCR 결과에 따르면, PPD (100 μM) 단독 처리 시 Bcl-2의 mRNA 발현은 현저히 감소하였으며, Derma GenieTM의 병용 처리에 따라 농도의존적으로 회복되었다. 그러나 Bax의 mRNA 발현에는 유의한 차이가 존재하지 않았다(Figure 3B, C). 유사하게, Western blotting 결과에서는 PPD (100 μM)를 단독 처리한 음성 대조군에서 Bcl-2의 상당한 단백질 발현 감소를 보였으며, Derma GenieTM의 병용 처리에 따라 회복되는 경향성을 확인할 수 있었다. 반면 유전자 발현에서는 유의한 차이가 없던 Bax의 단백질 발현은 음성 대조군에서 유의하게 증가하였는데, 이는 Derma GenieTM의 병용 처리에 따라 다시 감소되었다(Figure 3D, E). 이러한 결과는 PPD가 pro-apoptotic protein인 Bax의 발현량은 증가시키고, anti-apoptotic protein인 Bcl-2의 발현량은 감소시키는 것을 통해 세포 사멸을 야기할 수 있음을 보여준다. 또한 PPD와 Derma GenieTM의 병용 처리는 Bax와 Bcl-2의 유전자 및 단백질 발현을 조절하여 상당한 항 세포 사멸 기능을 수행할 수 있음을 시사한다.
3. PPD에 의한 in vitro 염증 모델에서 Derma GenieTM의 항염 효과
1) Inflammasome 연관 유전자 발현 분석
과산화수소와의 반응으로 모발 색상을 변화시키는 PPD는 피부에 쉽게 침투하여 피부 감작과 ACD를 유발하는 것으로 알려져 있다(Oakes et al., 2017). 특히 PPD는 ACD를 유발하는 대표적인 hapten 물질로 알려져 있는데, hapten은 단백질 친화도가 높은 1 kDa 이하의 작은 분자를 일컫는다. 그 자체로는 면역 반응을 유발하지 않지만, carrier protein과의 공유 결합을 통해 haptenation 되면, 체내에서 항원으로 작용하여 면역 반응을 유도한다(Adair et al., 2021). 체내에 생성된 hapten은 세포 내 다양한 신호 반응을 촉매할 수 있는데, 각질 형성세포(keratinocyte), 수지상 세포(dendritic cell) 및 대식 세포(macrophage) 등에서 톨 유사 수용체(toll-like receptor)를 통해 염증 신호를 활성화하거나, 세포 내 다른 단백질과의 상호 작용을 통해 ROS 및 ATP 등의 손상 연관 분자 패턴(damage associated molecular pattern, DAMPs)을 생성하는 것으로 알려져 있다(Kaplan et al., 2012). 또한 hapten은 DAMPs의 생성을 통해 inflammasome signaling을 활성화시킨다(Erkes & Selvan, 2014). Inflammasome은 NLRP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein-3) 등으로 구성되며, 염증성 세포 사멸을 촉진하고 IL-1β 및 IL-18 등의 전 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 분비를 유도하는 단백질 복합체로 알려져 있다(Yang et al., 2019). 따라서 본 연구에서는 PPD에 의해 유도된 세포 내 염증 모델에서 Derma GenieTM의 항염 작용을 확인하고자 하였다. Figure 4는 RT-PCR을 사용하여 inflammasome 연관 유전자(Nlrp3, Il-1β, Il-18)의 mRNA 발현을 분석한 결과이다. PPD (50 μM)를 24 h 동안 단독 처리한 음성 대조군에서는 Nlrp3 및 그의 하위 사이토카인인 Il-1β 및 Il-18 의 발현이 모두 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다(Figure 4A,B). 반면 Derma GenieTM를 병용 처리한 군에서는 농도 의존적으로 해당 인자들의 발현이 감소함을 확인하였다. 특히 PPD (50 μM)와 400 μg/mL의 Derma GenieTM를 병용 처리한 군에서는 Il-1β, Il-18, Nlrp3 의 유전자 발현량이 음성 대조군에 비해 각각 327.91%, 56.85%, 26.05% 감소하여, 상당한 inflammasome 연 관 유전자 발현의 감소를 확인할 수 있었다. 결과적으로 PPD에 의한 염증 반응에 있어, Derma GenieTM가 inflammasome 관련 인자들의 하향 조절을 유도하고, 이를 통해 세포 내 항염 효과를 가질 수 있음을 확인하였다.
Inhibitory effects of Derma Genie™-H002 on PPD-induced inflammasome signaling in RAW 264.7 cells.
(A) mRNA expression level of inflammasome-related genes (Il-1β, Il-18, and Nlrp3) detected via RT-PCR. Gapdh served as a loading control. (B) Quantification of mRNA level carried out using ImageJ. Results are the mean±SD of three independent experiments analyzed using a one-way ANOVA, followed by Tukey’s test. ###p<0.001 compared to the vehicle-treated group; **p<0.01; ***p<0.001 compared to the PPD-treated group.
2) Pro-inflammatory cytokine 유전자 발현 분석
대식세포는 M1 활성과 M2 활성으로 분극화 되는 특징이 있으며, 전자는 세포 증식 억제와 조직 손상을 초래하고, 후자는 세포 증식과 조직 복구를 촉진하는 역할을 수행한다(Mills, 2012). 염증 환경에서 활성화되는 세포인 M1 macrophage는 toll-like receptor 및 IFN 신호 전달과 연관되어 있다. 특히 전 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)이자 M1 macrophage의 표식 유전자(signature genes)인 Cox-2, Il-6, Tnf-α 와 같은 유전자의 증가는, 염증 신호의 활성을 통해 세포 증식 억제 및 조직 손상을 초래한다고 알려진 바 있다(Atri et al., 2018). 이전 실험에서는 Derma GenieTM 가 inflammasome 연관 유전자를 하향 조절하였기 때문에, 이후 실험에서는 전 염증성 사이토카인 유전자의 발현에 Derma GenieTM가 미치는 영향을 확인하고자 하였다. RT-PCR 결과에 따르면, PPD (50 μM)를 단독 처리한 음성 대조군에서는 Cox-2, Il-6, Tnf-α 유전자의 발현이 유의하게 증가하였으나, Derma GenieTM (200, 400 μg/mL)를 병용 처리한 군에서는 해당 유전자의 발현이 음성 대조군에 비해 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 5A, B).
Inhibitory effects of Derma Genie™-H002 on PPD-induced contact dermatitis signaling in RAW 264.7 cells.
(A) mRNA expression level of M1 macrophage signature genes (Cox-2, Il-6, and Tnf-α) detected via RT-PCR. Gapdh served as a loading control. (B and D) Quantification of mRNA level carried out using ImageJ. (C) mRNA expression level of ACD-related genes (Il-22 and Il-24) detected via RT-PCR. Gapdh served as a loading control. Results are the mean ± SD of three independent experiments analyzed using a one-way ANOVA, followed by Tukey’s test. ###p<0.001 compared to the vehicle-treated group; ***p<0.001 compared to the PPD-treated group
3) 알레르기성 접촉 피부염 연관 유전자 발현 분석
PPD에 의한 접촉 과민증에서 interleukin-24 (IL-24)는 주요한 사이토카인으로 작용하며, 이로써 케모카인(chemokine) 생성과 극 세포증이 유도된다(Van Belle et al., 2019). 더불어 interleukin-22 (IL-22)는 아토피성 피부염 뿐만 아니라 PPD에 의한 ACD 조직에서도 유의하게 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다(Nograles et al., 2009; Van Belle et al., 2019). 따라서 해당 실험에서는 ACD를 유발하는 물질로 알려져 있는 PPD에 대한 Derma GenieTM의 영향을 확인하고자 ACD와 연관된 염증성 인자인 Il-22 와 Il-24 의 발현을 분석하였다(Figure 5C,D). PPD 처리 시 Il-22 와 Il-24 의 mRNA 발현이 유의하게 증가하였으나, Derma GenieTM (400 μg/mL)를 병용 처리한 군에서는, 유전자 발현량의 상당한 감소 효능을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Derma GenieTM가 PPD에 의해 유발된 염증성 사이토카인 및 알레르기성 접촉 피부염과 관련된 인자를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
4) 염증 신호 전달 경로 분석
Nuclear factor kappa B (NF-κB)는 세포 내에서 발생하는 주요한 염증 및 면역 신호 전달 경로 중 하나로, 활성화됨에 따라 다양한 염증성 사이토카인의 발현을 증가시킨다(Lawrence, 2009). Figure 4와 5에서는 PPD에 의해 유도된 염증 인자들에 대한 Derma GenieTM 의 발현 억제 효과를 입증하였기 때문에, 이후 실험에서는 이의 상위 기전인 NF-κB의 단백질 발현에도 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. PPD (50 μM)의 처리는 NF-κB의 subunits인 p50과 p105의 단백질 발현을 증가시켰다. 반면, 이러한 증가는 Derma GenieTM의 병용 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되었다(Figure 6A, B). 이러한 결과는 Derma GenieTM가 염증 신호 전달 기전 중 NF-κB의 단백질 발현량을 통제함으로써 PPD에 의해 증가된 염증 인자를 감소시키고, 이를 통해 항염 효과를 가질 수 있음을 시사한다.
Anti-inflammatory effects of Derma Genie™-H002 on PPD-induced inflammation in RAW 264.7 cells.
(A) Protein level of NF-κB subunits (p50 and p105) analyzed via Western blotting. β-Actin served as a loading control. (B) Quantification of protein level carried out using ImageJ. Results are the mean±SD of three independent experiments analyzed using a one-way ANOVA, followed by Tukey’s test. ###p<0.001 compared to the vehicle-treated group; **p<0.01; ***p<0.001 compared to the PPD-treated group.
Conclusion
본 연구에서는 5종의 생약 복합 추출물(측백, 한련초, 병풀, 곰취, 녹차)인 Derma GenieTM-H002가 PPD로 유도된 RAW264.7 세포 내에서 상당한 세포 보호 및 항염 효능을 가지는 것을 확인하였다.
Derma GenieTM는 최고 농도인 400 μg/mL에서도 RAW 264.7 에서 독성을 유발하지 않았으며, 오히려 저농도(20 μg/mL)에서부터 세포 생존율이 개선됨을 확인하였다. 그에 반해 PPD는 저농도(25 μM)에서부터 세포 생존율을 감소시켰는데, 이를 통해 PPD가 세포 독성을 상당히 유발하는 물질임을 확인하였다. 이후 실험에서는 PPD로 독성을 유도한 RAW264.7 세포 내 Derma GenieTM의 세포 보호 효과를 확인하고자 하였다. 실험 결과, PPD를 단독으로 처리하였을 때 감소된 세포 생존율 및 증식률이 Derma GenieTM를 병용 처리함으로써 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 사멸된 세포에서 방출되는 효소인 LDH의 활성도 및 세포 사멸 관련 인자(Bcl-2 family)들의 발현을 분석한 결과, PPD에 의해 유발된 세포 사멸을 Derma GenieTM가 상당히 억제하는 것을 관찰하였다. 특히 Derma GenieTM는 PPD에 의해 감소된 Bcl-2 (anti-apoptotic protein)의 단백질 발현량은 증가시키고, PPD에 의해 증가된 Bax (pro-apoptotic protein)의 단백질 발현량은 감소시켜, 상당한 항 세포 사멸 효능을 입증하였다. 이후에는 PPD에 의한 염증 모델에서 Derma GenieTM 의 항염 효과를 확인하였는데, 그 결과 Derma GenieTM는 PPD에 의해 증가된 inflammasome 연관 유전자(Il-1β, Il-18, Nlrp3), 전 염증성 사이토카인(Cox-2, Il-6, Tnf-α) 및 알레르기성 접촉 피부염 연관 유전자(Il-22, Il-24)들의 발현량을 유의하게 감소시켰다. 특히 Derma GenieTM는 염증성 사이토카인 발현의 상위 전사인자로 알려진 NF-κB 신호 전달 경로를 하향 조절하는 양상을 보여주며, PPD에 의해 유도된 염증 모델에서 상당한 항염 효과를 가지는 것으로 판단되었다.
따라서 본 연구에서는 PPD에 의해 유도된 독성 및 염증을 완화시키는 천연물 유래의 항염 기능성 소재로써 Derma GenieTM-H002의 적용 가능성을 확인하였다.
Notes
본 연구는 2023년도 한국미용학회 제60회 동계학술대회에서 발표된 것을 수정 및 보완하여 작성된 논문입니다..
Author's contribution
Conceptualization, SP, YJL, and SB (Seunghee Bae); Methodology, SP, YJL, and SB; Software, SP; Validation, SP, YJL, HSK, HJS, SYJ, SC, JSK, SB (Seyeol Baek), SA, and SB (Seunghee Bae); Formal analysis, SP and YJL; Investigation, SP, YJL, HSK, HJS, SYJ, SC, JSK, SB (Seyeol Baek), SA, and SB (Seunghee Bae); Resources, SA and SB (Seunghee Bae); Data curation, SP and YJL; Writingoriginal draft preparation, SP, YJL, and SB (Seunghee Bae); Writing-review and editing, SP, YJL, HSK, HJS, SYJ, SC, JSK, SB (Seyeol Baek), SA, and SB (Seunghee Bae); Visualization, SP, YJL, and SB (Seunghee Bae); Supervision, SA and SB (Seunghee Bae); Project administration, SA and SB (Seunghee Bae); Funding acquisition, SB (Seunghee Bae). All authors read and agreed to the published version of the manuscript.
Author details
Seokmuk Park (Graduate Student), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Ye Jin Lim (Graduate Student), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Hee Su Kim (Graduate Student), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Hee-Jae Shin (Graduate Student), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Seok Yun Jeong (Graduate Student), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Suhyeon Cho (Graduate Student), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Ji-Seon Kim (Graduate Student), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Seyeol Baek (Graduate Student), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Sungkwan An (Senior Researcher), ANX, Inc., 373 Chang-ui-ri, Seorak-myeon, Gapyeong-gun, Gyeonggi-do 477852, Korea; and Seunghee Bae (Professor), Department of Cosmetics Engineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea.