엘더플라워(Sambucus nigra)를 활용한 기능성 화장품 소재로서의 주름개선 및 항산
Anti-wrinkle and Antioxidant Effects of Elderflower (Sambucus nigra) Water Extract as a Functional Ingredient of Cosmetics
接骨木花(Sambucus nigra)水提取物作为化妆品功能成分的抗皱和抗氧化作用
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Abstract
목적
엘더플라워(Sambucus nigra) 추출물을 이용하여 항산화 효과, 주름개선 효능, 세포독성 평가를 실시함으로써 화장품 소재로서의 활용 가능성을 검토하였다.
방법
항산화 활성으로는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)와 superoxide dismutase (SOD)-like activity, 주름개선 효능으로는 elastase 저해 활성을 측정하였다. B16-F10 mouse melanoma cells과 CCD-986sk human dermal fibroblast cells을 대상으로 세포독성 평가를 실시하였다.
결과
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity 방법으로 실시한 항산화 활성은 시료의 농도 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL에서 Sambucus nigra water extract (SNE)가 77%, 76.4%, 75.2%의 radical 소거 활성을 나타내었으며, SOD-like activity를 측정한 결과, 시료의 농도 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL에서 SNE가 78%, 70%, 66%의 활성을 나타내었다. 또한 SNE는 500 µg/mL의 농도에서 48%의 elastase 저해 활성을 나타내었다. B16-F10 mouse melanoma cells에 대한 세포 독성은 시료의 농도 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 μg/mL에서 각각 118%, 115%, 109%의 세포 생존율을 나타내었고, CCD-986ks human dermal fibroblast cells에 대한 세포 독성은 시료의 농도 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL에서 마찬가지로 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다.
결론
본 연구 결과 엘더플라워 추출물은 항산화 효과 및 주름개선 효능이 우수함을 나타내어 기능성 화장품 소재로서의 높은 활용 가능성 확인할 수 있었다.
Trans Abstract
Purpose
This study examined the potential of elderflower (Sambucus nigra) water extract (SNE) as a cosmetic material by evaluating its anti-wrinkle, antioxidant, and cytotoxic effects.
Methods
We determined the antioxidant effect of SNE by measuring its 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical–scavenging and superoxide dismutase (SOD)-like activity and determined the anti-wrinkle effect of SNE by measuring its elastase inhibition activity. In addition, we assayed the viability of B16-F10 mouse melanoma and CCD-986sk human dermal fibroblast cells in the presence of SNE.
Results
SNE showed a DPPH radical–scavenging activity of 77%, 76.4%, and 75.2% at a concentration of 1000, 500, and 250 μg/mL, respectively, and SOD-like activity of 78%, 70%, and 66% at a concentration of 200, 100, and 50 μg/mL, respectively. In addition, 500 μg/mL of SNE exhibited 48% elastase inhibition activity. Furthermore, B16-F10 cells showed a viability of 118%, 115%, and 109% when treated with 200, 100, and 50 μg/mL of SNE, respectively, and CCD-986sk cells showed high cell viability when treated with 200, 100, and 50 μg/mL of SNE.
Conclusion
The results of this study indicate that SNE has excellent antioxidant and anti-wrinkle effects, confirming its high applicability as a functional cosmetic material.
Trans Abstract
目的
本研究通过评估接骨木花(接骨木)水提取物(SNE)的抗皱、抗氧化和细胞毒性作用，探讨其作为化妆品材料的潜力。
方法
我们通过测量SNE的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除和超氧化物歧化酶(SOD)样活性来确定SNE的抗氧化作用，并通过测量其弹性蛋白酶抑制活性来确定SNE 的抗皱作用。此外，我们还检测了B16-F10小鼠黑色素瘤细胞和CCD-986sk人真皮成纤维细胞在SNE存在下的活力。
结果
SNE在浓度为1000、 500和250 μg/mL时，显示出DPPH自由基清除活性，分别为77%、76.4%和75.2%；在浓度分别为 200、100和 50 μg/mL时，显示出SOD活性分别为78%、70%和66%。此外，500 μg/mL的SNE表现出48%的弹性蛋白酶抑制活性。此外，SNE在浓度为 500 μg/mL时，显示出48%的弹性蛋白酶抑制活性。针对B16-F10小鼠黑色素瘤 细胞的细胞毒性显示，在用SNE浓度为200 μg/mL、100 μg/mL和50 μg/mL处理时，细胞存活率分别为118%、 115%和109%，而CCD-986sk细胞在用浓度200 μg/mL、100 μg/mL和50 μg/mL的SNE处理时，表现出高细胞存活率。
结论
本研究结果表明，SNE具有优异的抗氧化和抗皱功效，证实了其作为功能性化妆品材料的高度适用性。
Introduction
화장품은 ‘인체를 청결 미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용하는 물품으로써 인체에 대한 작용이 경미한 것’을 말한다(Kyong, 2006). 다만, 약사법 제2조 제4항의 ‘의약품에 해당되는 물품은 제외한다’라고 화장품 법에 규정하고 있다(Kim et al., 2004).
K-뷰티는 한국산 화장품이 해외에서 각광받기 시작하여 나타났다. K-POP, K-Drama에 등장하는 한국 연예인들의 외모나 사용하는 화장품에 관심을 갖게 되는 외국인이 늘어나면서 한국 브랜드 화장품을 구매하고, 사용하며 화장법을 따라 하는 경향이 늘어나고 있다(Zhao, 2016). 뷰티(beauty)의 사전적 의미는 ‘아름다움, 미(美), 매력’의 뜻을 나타내며, 나를 아름답게 혹은 매력 있게 표현할 수 있는 외적인 부분을 변화시키는 행위와 밀접한 관계를 가지고 있다(Oh, 2020). 또한 코스메슈티컬의 의미는 코스메틱(화장품)과 파마슈티컬(의약품)의 뜻이 합쳐진 신조어로 화장품의 안전성과 의약품의 효과성을 같이 볼 수 있는 화장품을 의미한다(Lee et al., 2019). 그리고 기능성 화장품 성분을 혼합해야만 특정한 효능을 발휘하는 2중 기능성 화장품들이 최근에 활성화되고 있으며 소비량이 증가하고 있다(Jang & Lee, 2021).
현재 국내 기능성 화장품의 수요는 점점 증가하는 추세이다(Jang & Lee, 2021). 식품의약품안전처에 따르면 국내 화장품 생산 실적이 2019년도에 16조 2,633억 원으로 18년(15조 5,028억 원) 대비 4.9% 증가한 것으로 나타났다. 또한 2019년 기능성 화장품 생산실적은 5조 3,448억 원으로 18년(4조 9,803억 원) 대비 7.3% 증가했으며, 기능성 화장품의 평균 성장률 또한 2015년에서 2019년까지 8.5%로 꾸준한 성장세를 보이고 있다(Kim, 2021). 이로써 국내 가능성 화장품 산업이 꾸준한 성장세를 가진다는 것을 확인할 수 있다. 이러한 시장 성장에 맞추어 화장품 연구 및 제조 기술도 비약적으로 발전하고 있다(Lee, 1998).
국내 기능성 화장품을 구매하는 고객층이 고령의 연령대가 점차 증가하고 있다(Kim, 2009). 이는 현대 사회의 고령화와 밀접하게 연관되어 있다. 국내의 65세 이상 고령자 인구 비율이 37.4%으로 고령화는 현재 사회의 중요한 문제점으로 대두되고 있다(You & Kwon, 2017). 2018년 현재 40-64세에 해당하는 중년여성 인구는 여성 총 인구 대비 39.4%를 차지하고 있으며(Kim & Kim, 2020), 2019년 발표된 OECD Health Statistics 에 의한 한국 여성의 평균 수명이 85.7로 증가하였다(Ahn et al., 2020). 자세히 살펴보면 1973 년엔 66세, 1983년엔 71.5세, 1993년엔 76.8세, 2005년엔 80.8세, 2014년 엔 85.0세로 계속 증가하는 추세이다(Park & Shin, 2015). 이는 고령화로 확대되고 있는 실버층의 구매력이 확산됨을 의미하며, 안티에이징 제품 시장의 수요가 증가한다는 것을 알 수 있다(Lee & Lee, 2021). 이를 통해 화장품 산업은 인구 고령화와 삶의 질에 대한 인식으로 인해 지속적인 규모의 성장이 예측된다(Jang & Lee, 2021).
최근에는 화장품 기능뿐만 아니라 피부에 안전한 소재에 대한 관심이 높아지면서 자극이 적은 천연물에 대해 연구가 활발히 진행되고 있다(Choi, 2022). 또한 화장품은 피부에 일상적으로 사용되나, 다양한 환경인자와 스트 레스로 인해 피부트러블을 일으킬 수 있으므로 자연친화적인 것을 추구하는 경향이 있다(Jang, 2017). 따라서 노화 현상이 가속화되는(Lim, 2003) 고령사회에 맞추어 관련 화장품 산업의 새로운 소재 개발이 필요한 부분이다.
엘더플라워(Sambucus nigra)는 유럽, 아시아, 북아프리카, 북미 대륙의 그늘지고 습한 지역에 분포하여 있으며, 딱총나무속(연복초과)에 속하여 있다. 또한 항산화(Coreana Cosmetics Co., LTD, 2021), 항염증, 항바이러스(Bartak et al., 2020), 항알레르기, 혈관 보호성, 주름개선(Coreana Cosmetics Co., LTD, 2021) 및 항암 등 다양한 약물 효능을 더불어 미백효과도 가지고 있다고 알려져 있다. 하지만 이러한 효과가 알려져 있는 반면 그 연구 결과는 미흡한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 엘더플라워(Sambucus nigra) 추출물을 이용하여 화장품 소재로의 가능성을 확인하고자 항산화 활성, 주름개선 효능을 평가하였다. 항산화 활성으로는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity과 SOD-like activity를 조사하였으며, 주름개선 효능평가로는 elastase inhibition assay을 확인하였다. 이를 통해 천연자원 물 기반 기능성 화장품 원료로써 효능을 확인하고자 하였다.
Methods
1. 실험재료 및 시약
본 연구에서 사용한 엘더플라워(Sambucus nigra)는 노르웨이 Frontier Co-op에서 제조한 엘더플라워(Sambucus nigra)를 공급받아 사용하였다. 공급받은 건조 엘더플라워 전초를 핸드믹서(HB818BCE; Ningbo Kajafa Electric Appliance Co., Ltd, China)를 사용하여 분쇄 후, 50 mesh 체로 걸러서 사용하였다. 엘더플라워 분말시료 100 g에 증류수 2 L (w/v%)를 첨가하여 분쇄한 후, 5℃에서 20 h 저온숙성을 시켜준다(Kang et al., 2021). 그리고 면포를 사용하여 Pellet을 분리시켜 준 후 2,500 rpm 20 min 원심분리를 시켜준다. 시료 총 2L 중 900 mL을 얻어 사용하여 0.45%의 추출 수율을 얻었으며, 이후 상층액을 감압 농축기(EYELA N-1000; Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 후에 동결 건조하여 실험에 사용하였으며, 이후 시료를 Sambucus nigra water extracts (SNE)로 명명하였다.
2. In vitro assay
1) Antioxidant activity
(1) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity
엘더플라워(Sambucus nigra)추출물의 항산화 활성을 측정하기 위하여 DPPH method를 사용하여 radical 소거 능력을 측정하였다(Kim & Lee, 2022). Positive control로는 L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA)를 50 μg/mL의 농도로 사용하였다. 96 well plate에 시료를 에탄올로 각 농도별로 조제한 용액에 1.5×10-4 M의 DPPH를 150 μL가 하여 10 s 진탕한 후, 37℃, 30 min 배양한 다음 microplate reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거 작용을 3회 반복하여 측정하였다.
Radical scavenging activity (%)=[(Sample-Blank)/Control] Absorbance×100
(2) SOD-like activity
SOD 유사 활성은 Marklund & Marklund (1974)의 방법에 따라 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사 활성으로 나타내었다. 시료 용액 2 mL에 Tris-HCl의 완충용액(50 mM Tris+10 mM EDTA, pH 8.5) 3.0 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL를 가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1N HCl 0.1 mL를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 측정하였다.
SOD-like activity (%)=[(Sample-Blank)/Control] Absorbance×100
2) Anti-wrinkle effects
피부의 주름개선 효과를 측정하기 위하여 elastase inhibition activity를 측정하였다. Elastase 저해 활성은 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide (Sigma-Aldrich) 8.8 mM 농도의 기질 20 μL를 가한 후, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreatic elastase (2,000 U/mL) 20 μL, 25℃, 15 min 반응 후, 410 nm에서 흡광도를 비교하였다. Positive control로 는 ursolic acid (Sigma-Aldrich) 500 µg/mL를 사용하였다.
Elastase inhibition activity (%)=[1-(Sample-Blank)/Control] Absorbance×100
3) MTT assay
MTT 실험으로 악성 흑색종 세포인 B16-F10 mouse melanoma cells과 인간 섬유아세포인 CCD-986sk human dermal fibroblast cells을 대상으로 세포 생존율을 조사하여 세포에 대한 독성 평가를 진행하였다. Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM; Gibco)에 1×105 cells/well 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 24 h 배양하였으며 부착 및 안정화를 시켰다. 이후 각 농도별로 희석한 엘더플라워 추출물을 처리하여 24 h 배양 후, CCK-8 assay kit (Enzo, Life Science, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 대신 PBS를 사용한 흡광도를 기준으로 세포의 생존율을 나타내었다(Kim & Lee, 2022). Cell viability (%)=[(Exp.-Blank)/Control]×100
3. 통계처리
본 연구의 모든 실험은 동일한 조건하에 진행하였으며, 3회 이상 실시한 측정값을 토대로 활용하였다. 모든 실험 결과는 means±SD로 표기하였다.
Results and Discussion
1. In vitro results and discussion
1) Antioxidant activity
엘더플라워 추출물의 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity 방법과 SODlike activity로 측정하였다. 먼저 열수 추출물인 SNE의 DPPH radical 소거 활성을 보면(Figure 1), positive control인 L-ascorbic acid는 50 µg/mL의 농도에서 95%의 활성을 나타내었고, 시료의 농도가 62.5, 125, 250, 500, 1000 µg/mL일 때 열수 추출물인 SNE의 활성은 각각 73.7%, 74.5%, 75.2%, 76.4%, 77%의 활성을 나타내었다. SOD는 생체 내에서 O2-(superoxide)를 제거하는 효소이며, 생체 내에 생성된 활성산소를 H2O2로 전환시키는 반응을 촉매 하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD-like activity로 나타내었다(Lam et al., 1994). SNE의 SOD-like activity는 높게 나타났으며, positive control인 L-ascorbic acid는 1mM의 농도에서 40%의 활성을 나타내었고, 시료의 농도가 25, 50, 100, 200 µg/mL의 농도에서 40%, 65%, 68%, 80%의 활성을 보여주었다(Figure 2).
DPPH radical–scavenging activity of SNE.
L-ascorbic acid (50 µg/mL) was used as a positive control. Antioxidant effects of SNE at concentrations of 1000, 500, 250, 125, and 62.5 µg/mL. Each value is expressed as the mean±SD of triplicate measurements. *Statistically significant compared to the control(*p<0.05, **p<0.01). DPPH, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; SD, standard deviation; SNE, Sambucus nigra water extract.
SOD-like activity of SNE.
L-ascorbic acid (1 mM) was used as a positive control. Antioxidant effects of SNE at concentrations of 200, 100, 50, and 25 µg/ mL. Each value is expressed as the mean±SD of triplicate measurements. *Statistically significant compared to the control (*p<0.05). SD, standard deviation; SNE, Sambucus nigra water extract; SOD, superoxide dismutase.
2) Anti-wrinkle effects
탄력과 주름에 관여하는 collagen은 피부의 형태와 강도를 유지하는 단백질이며, collagen 분해가 일어나면 피부의 탄력과 주름에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. Collagen 구조는 3중 나선 구조로 되어 있고, collagen은 크기와 기능, 조직 분포와 구조, 초분자 기질 등에 따라 분류되어 있다. 나이가 들면서 진피에 존재하는 collagen이 파괴되고, 이와 함께 elastin의 수와 직경이 감소하며 잘게 끊어진 것처럼 길이가 짧아진다. 이로 인해 피부의 탄력이 감소하여 피부가 늘어지고 주름이 생기게 된다(Kim & Lee, 2022). 본 연구에서는 엘더플라워 추출물의 주름개선 효능을 측정하기 위하여 porcine pancreatic elastase 저해 활성을 측정하였다. Elastase 저해 활성의 positive control로는 elastase 저해제로 알려진 대표적인 ursolic acid를 사용하여 분석하였다. 시료의 농도는 62.5, 125, 250, 500 µg/mL의 농도이며, SNE의 결과는 20%, 35%, 42%, 48%의 저해 활성을 나타내었고, ursolic acid는 500 µg/mL의 농도에서 40%의 저해 활성을 나타내었고, 시료의 저해 활성은 농도가 증가함에 따라 저해 활성 또한 증가하였다(Figure 3).
Elastase inhibition assay of SNE.
Ursolic acid (500 μg/mL) was used as a positive control. Elastase inhibition by SNE at concentrations of 500, 250, 125, and 62.5 µg/mL. Each value is expressed as the mean±SD of triplicate measurements. *Statistically significant compared to the control (*p<0.05, **p<0.01). SD, standard deviation; SNE, Sambucus nigra water extract.
3) MTT assay
엘더플라워 추출물의 세포독성평가를 조사하기 위하여 악성 흑색종 세포인 B16-F10 mouse melanoma cells과 인간 섬유아 세포인 CCD-986sk human dermal fibroblast cells을 대상으로 MTT assay를 실시하였다. 먼저 B16-F10 mouse melanoma cells에 대한 활성을 보면(Figure 4), 시료의 농도 50 µg/mL에서 100%의 생존율이 확인되었고, 100 µg/mL의 농도에서는 95%의 생존율로 농도가 증가함에 따라 세포의 성장에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있다. 인간 섬유아 세포인 CCD-986sk human dermal fibroblast cells에 대한 활성을 보면(Figure 5), 100 µg/mL의 농도에서는 115%의 생존율을 확인하였다.
MTT assay of B16-F10 mouse melanoma cells with SNE.
Cytotoxicity assessments were performed using B16-F10 mouse melanoma cells with SNE. B16-F10 cells were treated with various concentrations (200, 100, 50, 25, 12.5 µg/mL) of SNE. Each value is expressed as the mean±SD of triplicate measurements. *Statistically significant compared to the control (*p<0.05). MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide; SD, standard deviation; SNE, Sambucus nigra water extract.
MTT assay of CCD-986sk human dermal fibroblast cells with SNE.
Cytotoxicity assessments were performed using CCD-986sk human dermal fibroblast cells with SNE. CCD-986sk cells were treated with various concentrations (200, 100, 50, 25, 12.5 µg/mL). Each value is expressed as the mean±SD of triplicate measurements. *Statistically significant compared to the control (*p<0.05. MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; SD, standard deviation; SNE, Sambucus nigra water extract.
Conclusion
본 연구에서는 엘더플라워(Sambucus nigra)를 대상으로 열수 추출물의 항산화 활성, 주름개선 효과 및 세포독성 평가를 실시하여 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다. 항산화 활성으로는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity와 SOD-like activity를 실시하였고, 주름개선 효능평가로는 elastase inhibition assay를 실시하였다. 세포독성 평가인 MTT Assay로는 B16-F10 mouse melanoma cells과 CCD-986sk human dermal fibroblast cells을 대상으로 세포 생존율을 조사하였다. DPPH를 실시한 결과 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL 각각의 농도에서 77%, 76.4%, 75.2%의 항산화 효능을 나타내었으며, SOD-like activity 실험을 한 결과, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL 각각의 농도에서 78%, 70%, 66%의 항산화 효과를 나타내었다. 또한 엘더플라워(Sambucus nigra)는 500 µg/mL의 농도에서 48%의 Elastase 억제 효과(주름개선 효과)를 나타내었다. 세포독성평가인 MTT Assay를 실험한 결과 엘더플라워(Sambucus nigra) 추출물은 B16-F10 mouse melanoma cells을 대상으로 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL의 농도에서 각각 118%, 115%, 109%의 세포 생존율이 확인되었다. 또한 CCD-986sk human dermal fibroblast cells을 대상으로 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL의 농도도 마찬가지로 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 바탕으로 엘더플라워(Sambucus nigra)추출물은 항산화, 주름개선 효과가 뛰어난 기능성 화장품의 소재임이 증명되었고, 앞으로 기능성 화장품 소재로서의 산업적 가치를 지니는 것으로 여겨진다.
Notes
Author's contribution
HJJ designed the experiments and collected the Elderflower materials. HJJ and SYH tested the Elderflower material. SYH conducted the experiments and collected and organized the data. JHL oversaw the execution of the project and contributed to all aspects of analysis and experimental design. HJJ wrote the manuscript with assistance from SYH and JHL.
Author details
Hyo Jung Jung (Student), Department of Pharmaceutical Engineering, Silla University, 140 Baegyang-daero 700beon-gil, Sasang-gu, Busan 46958, Korea; Seo Yeon Heo (Student), Department of Pharmaceutical Engineering, Silla University, 140 Baegyang-daero 700beon-gil, Sasang-gu, Busan 46958, Korea; Jae Hwa Lee (Professor), Department of Pharmaceutical and Cosmetics, Silla University, 140 Baegyang-daero 700beon-gil, Sasang-gu, Busan 46958, Korea.
Acknowledgements
본 과제(결과물)는 교육부와 한국연구재단의 재원으로 지원을 받아 수행된 3단계 산학연협력 선도대학 육성사업(LINC 3.0)의 연구결과 입니다.