알칸디올의 세포독성 및 항균력의 상관관계와 적용한 제형 안정성에 미치는 영향
Correlation of Cytotoxicity and Antimicrobial Activity of Alkandiols and Their Impact on Stability in Emulsions
链烷二醇的细胞毒性和抗菌活性的相关性及其对乳液稳定性的影响
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Abstract
목적
본 연구는 1,2-octanediol과 1,2-hexanediol을 중심으로 ethyl hexanediol, methylpropanediol, 2-butyl-2-ethyl-1,3-propanediol, ethylhexylglycerin의 알칸디올을 유화 에멀젼 제형에 적용하여 미생물 오염에 대한 보존력과 함께 제형 내 상안정성을 확인하여 다양한 화장품 처방 개발에 기여하고자 한다.
방법
에멀젼에 적용하여 보존력과 3개월 동안 온도 보관에 따른 상안정성을 확인하고 섬유아세포의 세포독성과 균주별 항균력을 비교하였다.
결과
알칸디올류의 알킬 선형 탄소 사슬 길이가 길수록 보존력이 우수하나 제형 함유 함량이 높을수록 상안정성에 불안정성이 나타났다. 섬유아세포 세포독성 평가를 통해 세포막을 변형시켜 항균력을 나타나는 관계를 확인하였다.
결론
탄소수와 다이올의 화학구조에 의한 세포독성과 항균력의 상관관계를 활용하여 향 후 미생물 오염에 대한 항균력, 인체에 대한 안전성, 제형의 상안정성 항목에서 상승효과를 부여하는 이상적인 보존제 부스터를 개발하는데 기여할 것으로 기대된다.
Trans Abstract
Purpose
This study aimed to contribute to the development of various cosmetic formulations by adding alkanediols of ethyl hexanediol, methylpropanediol, 2-butyl-2-ethyl-1,3-propanediol, and ethylhexylglycerin (mainly 1,2-octanediol and 1,2-hexanediol) to emulsion formulations to determine their emulsion phase stability as well as their preservation against microbial contamination.
Methods
The alkanediols were added to the emulsions to assess their preservation effects and phase stability under various storage temperatures for 3 months. In addition, their fibroblast cytotoxicity and anti-bacterial activity against microorganisms were compared.
Results
A greater preservation effect was observed with longer linear alkanediol alkyl carbon chain lengths. However, higher formulation content revealed instability in phase stability. Furthermore, evaluation of fibroblast cytotoxicity showed that the relationship between cell membrane disruption and antimicrobial activity was affected.
Conclusion
Utilizing the correlation between cytotoxicity and antimicrobial activity because of the carbon number and diol chemical structure, these results are expected to contribute to the development of improved preservative boosters that provide synergistic effects in terms of antimicrobial activity against microbial contamination, human safety, and the phase stability of formulations in the future.
Trans Abstract
目的
本研究重点关注1,2-辛二醇和 1,2-己二醇，并将乙基己二醇、甲基丙二醇、2-丁基-2-乙基-1,3-丙二醇和乙基己基甘油等链烷二醇应用于乳液配方中，通过确认配方内的相稳定性和针对微生物污染的防腐能力，为各种化妆品配方的开发做出贡献。
方法
将链烷二醇添加到乳液中，评估其在不同储存温度下3个月的保存效果和相稳定性。此外，还比较了它们的成纤维细胞毒性和对微生物的抗菌活性。
结果
线性链烷二醇烷基碳链长度越长，保存效果越好。然而，较高的配方含量表明相稳定性不稳定。此外，成纤维细胞细胞毒性的评估表明细胞膜破坏与抗菌活性之间的关系受到影响。
结论
利用由于碳数和二醇化学结构而导致的细胞毒性和抗菌活性之间的相关性，这些结果有望有助于开发改进的防腐剂增强剂，这些增强剂在针对微生物污染的抗菌活性、人类安全和配方的相稳定性方面协同效应。
Introduction
화장품은 다량의 물과 탄소 및 질소를 공급하는 영양소 등이 포함되어 있기 때문에 미생물 오염에 매우 취약하다. 화장품 제조 과정 중 발생하는 1차 오염과 소비자가 사용 중 발생할 수 있는 2차 오염을 통해 화장품 제형의 변질과 부패를 방지하기 위해 보존제(방부제, preservatives)가 필요하다(Marouchoc, 1980; Lee et al., 2011). 보존제에 대한 연구가 시작되고 p-하이드록시벤조익애씨드 에스텔(파라벤, paraben)이 곰팡이에 대한 항진균효과가 있음이 알려지면서 1930년대부터 화장품에 사용되기 시작하였다(Orth, 1980). 그 후 화장품의 대량생산과 함께 화장품의 미생물에 의한 변질 문제가 나타나기 시작했으며 이에 대한 대책으로 1950년대에는 항균제 개발이 시작되고 화장품 회사마다 서로 다른 보존력(방부력)시험(challenge test)을 수행하였고 화장품에 있어서 효과적인 방부 시스템의 필요성이 대두되었다. 1960년대 후반 미국화장품협회(Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association (CTFA), 現 Personal Care Products Council (PCPC))을 통해 빠르게 발전했고 1960년 후반 조사에서 나타난 25% 오염 발생률에서 1972년에서 1975년까지 3년간 미국 전국 조사를 통해 화장품 및 세면도구 제품에 대한 오염률이 2%으로 낮아졌다는 사실도 입증되었다. 또한, 1960년대부터 1980년대 사이에는 제품 보존력 증진을 위해 보존제와 원료 간의 상호관계에 대한 기초 연구가 많이 진행되었다(Geis, 2006). 1970년대에는 CTFA의 성장과 함께 CTFA technical guideline에 의한 화장품 제조 환경의 미생물 측면에 대한 개선을 가져왔으며 이에 따라 화장품에 대한 미생물 오염 가능성은 상당히 감소되었다. 1980년 이후에는 무균, 위생에 대한 관심이 많아지면서 항생제와 보존제에 대한 과도하게 의존하는 시기이며 소비자 사용 중에 제품이 오염되는 것을 방지하기 위해 보존력 시험에 대한 관심이 높았다(Geis, 2006; Seo, 2005; Kim, 2024). 우리나라도 보존력시험이 2022년 10월 화장품 보존력 시험법 가이드라인(민원인 안내서)이 나오면서 산업계에 큰 도움이 되고 있다. 화장품에 사용되는 합성 보존제는 피부 자극 및 알레르기를 유발하여 부작용이 나타나지만(Jeong, 2013; Lidén et al., 2022), 화장품 산업의 증가로 인해 그 사용량 또한 증가하는 추세이다(Kim, 2024; Poddębniak & Kalinowska-Lis, 2024). 보존제의 위해평가를 통해 화장품법령의 사용상의 제한이 필요한 원료에 대한 사용기준에 의해 59종, 150여 성분으로 관리하고 있지만, 안전지향의 소비자들 요구로 인해 제품에 표기되는 파라벤 등 화학 보존제에 대한 소비자의 거부감이 크게 증가하고 있다(Johnson et al., 2012) 그래서 고시 보존제 대체 및 상승효과를 주는 부스터(booster)로서 천연소재 유래 성분도 많이 개발되었으나(Kim et al., 2023; Kim & Kim, 2022; Ku et al., 2013; Lee & Ahn, 2022) 안정성과 항균력이 떨어지고 2000년대부터 항균작용이 있는 1,2-알칸디올계 화합물들을 사용하여 방부 효과를 나타낼 수 있는 대안으로 활발하게 사용되고 있다(Levy et al., 2009; Ahn et al., 2007). 항균 작용이 있는 1,2-알칸디올계 성분 중 대표적으로 1,2-octanediol 과 1,2-hexanediol 성분 등이 혼합되어 고시 보존제의 종류와 함량을 줄이는데 기여하고 있다(Kabara & Orth, 1997; Gaonkar et al., 2006; Levy et al., 2009). 즉, 모든 제품의 종류가 오염으로부터 적절히 보호되고 소비자 안전을 위해서는 보존제에 따라 다른 방식으로 작용하기 때문에 사용할 수 있는 다양한 범주 성분들의 혼합 사용의 보존제 팔레트(preservatives palette) 개념이 필요하다(Choi, 2015). 본 연구는 1,2-octanediol과 1,2-hexanediol을 중심으로 ethyl hexanediol, methylpropanediol, 2-butyl-2-ethyl-1,3-propanediol, ethylhexylglycerin의 4가지 알칸디올을 유화 에멀젼 제형에 적용하여 (Glavač & Lunder, 2018; Ryu et al., 1992; Suh et al., 2018) 미생물 오염에 대한 보존력과 함께 제형 내 상안정성을 확인하여 다양한 화장품 처방 개발에 기여하고자 한다.
Methods
1. 실험 재료
1) 균주 배양
본 연구에서 사용된 8종의 미생물은 Table 1에 기재하였고 한국미생물보존센터(KCCM, Korea) 등에서 분양 구매하여 사용하였다. 미생물 배양에 사용한 배지는 potato dextrose agar, potato dextrose broth, nutrient agar, nutrient broth (SA, Difco Lab., USA)이다.
Tested microorganisms and culture conditions
2) 시약 및 기기
본 실험에서 사용한 6종의 알칸디올류는 Table 2에 정리하였고 양성대조군으로 고시 보존제(preservative)들은 11종은 Table 5에 기재하였고 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양을 위한 DMEM 배지, 항생제는 Welgene 제품을 사용하였다. 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma-Aldrich의 제품을 사용하였다. 미생물의 증식을 측정하기 위해 spectrophotometer (U2900; Hitachi, Japan)를 사용하여 550 nm에서 측정하였다. 제형 제조와 안정성평가를 위해 사용된 기기는 Homo mixer (T.K homo mixer mark Ⅱ; Tokushu kika kogyo Co, Japan), Brookfield viscometer (Brookfield engineering, USA), microplate reader (Molecular device, SpectroMax, USA) pH meter (Orion StarTM A211 pH benchtop meter; Thermo Sci Co, USA)를 사용하였다.
Alkanediols information for preservative test
Fibroblast cytotoxicity of preservatives and alkanediols
2. 실험 방법
1) 에멀젼 처방 및 제조 방법
Table 2에 기재된 1,2-octanediol, 1,2-hexanediol, ethyl hexanediol, methylpropanediol, 2-butyl-2-ethyl-1,3-propanediol, ethylhexylglycerin이 제형 안정성에 미치는 영향을 알아보기 위해 첨가한 에멀젼을 Table 3에 따라 제조하였다. 양성 대조군으로 고시 보존제인 methylparaben 0.15%, propylparaben 0.05%, phenoxyethanol 0.30%를 함유한 에멀젼을 사용하였다. 에멀젼은 water phase와 oil phase를 각각 계량한 후 water bath에서 80℃로 중탕시킨다. Homo mixer로 교반 한 후, oil phase를 천천히 넣어 1 min 간 유화시키고 triethanolamine (TEA)를 후첨하여 3 min 더 유화하였다. 제조된 에멀젼을 냉각 수조에서 온도계로 잘 섞어주면서 상온까지 냉각시켜 실험에 사용하였다.
Emulsion-based composition for preservative test
2) 보존력 시험
Personal Care Products Council (PCPC)에서 제공하는 방법을 수정하여 사용하였다. 6종의 알칸디올이 각각 농도별로 함유한 에멀젼에 Table 1에 기재된 세균은 107 CFUs/mL, 진균은 106 CFUs/mL로 접종하였으며 상온에 보관하여 실험에 사용하였다. 접종 후 0.1 mL 시료를 취하여 0, 1, 7, 14, 21, 28 일에 균 수를 측정하였다. 세균 E. coli, S. aureus, P. aeruginosa 의 경우는 7 일까지 초기 접종 균의 0.1% 이하(100 CFUs/plate)로 감소해야 하며, B. subtilis는 7 일에 균의 수가 유지되거나 감소해야 한다. 진균 C. albicans, A. niger는 7 일까지 초기 접종 균의 10% 이하(1000 CFUs/plate)로 감소해야 합격(pass/fail) 판정을 하였다.
3) 알칸디올 함유 제형의 안정성 평가
제조한 에멀젼을 통해 시료가 제형 안정성에 미치는 영향을 알아보았다. 상온, 4℃, 45℃, cycle조건에서 3 개월 동안 보관한 에멀젼을 약 3-4 시간 동안 상온에 보관한 후 실험을 진행하였다. pH 측정과 더불어 점도 측정은 spindle 4#, 30 rpm, 1 min 조건으로 측정하고 보관 온도에 따른 유화 안정성 평가를 위해 향취 및 유화 분리 등의 경시 변화를 관찰하였다.
3) 세포독성 평가
사람 정상 섬유아세포(American Type Culture Collection)를 배양하여 96 well plate에 5.0×103개/well을 시딩하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한다 다음 날 고시 보존제를 포함하여 15종을 농도별로 처리하고 48시간 동안 배양한다. MTT 0.1 mg를 3시간 처리하고 DMSO로 formazan을 잘 녹인 후 mi croplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포가 50%가 사멸되는 농도 IC50를 산출한다.
4) 항균력 실험
항균력을 비교하기 위해 paper disk diffusion법을 이용하였다. 각 균수가 5.0×105 CFUs/mL이 되도록 50℃로 식혀 둔 고체배지에 균액을 접종하여 현탁하였다. 각 균이 현탁된 고체배지를 bottom agar 표면에 균일하게 부어 굳힌 후 멸균된 paper disk (6 mm; Advantec Japan)를 밀착시키고, 각 시료를 DMSO에 희석하여 시료를 로딩하였으며, incubator에서 진균은 48 h, 세균은 24 h 동안 배양하여 결과를 확인하였다. 생육저해환은 disk 주위로 균이 저해된 clear zone(mm)의 크기를 가로, 세로, 대각선으로 총 3 회 측정하여 평균값으로 나타내어 항균력을 산출하였다.
최소 저지 농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 결정은 미생물의 증식 억제를 유도할 수 있는 시료의 최소 농도를 측정하여 정균 능력(bacteriostatic activity)을 알아본다. 실험 배양액을 550 nm에서 optical density (OD) 값을 측정하고 성장곡선을 이용해 균수를 측정하여 1.0×106 CFUs/mL가 되도록 한다. 96well plate에 시료 단계 희석을 하고 균주를 접종하고 성장 최적 온도가 유지되는 incubator에서 배양한다. 접종한 균이 증식한 well은 positive (+)로 하고 증식하지 않은 well은 negative (-)로 표기하며 접종균이 증식하지 않은 최초의 well의 시료 농도를 MIC로 한다.
Results and Discussion
1. 보존력 및 안정도 평가 결과
친수성기와 친유성기를 동시에 가진 양친매성 알칸디올계 화합물은 그람양성 및 그람음성균에 대한 항균 활성을 보이는데 미생물인 지질로 구성된 세포막에 결합하여 세포막을 변형시켜 파괴하는 데 용이하기 때문에 보존력 향상에 도움을 준다고 알려져 있다(Lee et al., 2011). 알킬 선형 탄소 사슬 길이가 길 수록 미생물의 세포막 인지질 사이로 깊이 들어가서 세포막을 변형시켜 세포막 수송과 에너지 생성을 방해하며 세포 안의 물질들이 누출되어 기전으로 항균력을 나타낼 수 있다.
에멀젼 제형에 각각 caprylyl glycol은 0.5, 1.0%, 1,2-hexanediol 은 2.0, 3.0%, ethyl hexanediol은 1.0%, methylpropanediol 은 5.0, 10.0%, 2-butyl-2-ethyl-1,3-propanediol은 4.0%, ethylhexylglycerin 1.0%를 후첨하여 파라벤과 페녹시에탄올을 함유한 제형을 대조군으로 비교하였는데(Table 4), 이는 고시 보존제에서 가장 널리 사용되는 혼합 사용의 대표적 사례로서 대조군 처방으로 설정하였다. 대조군은 우수한 보존력과 제형 상안정성도 우수하였으나 시료들은 0.5-2.0% 의 낮은 농도에서는 곰팡이에서 보존력이 불합격되었다. Caprylyl glycol은 가장 항균력이 좋은 시료로서 1.0%의 처방에도 보존력이 합격이지만 점도가 매우 낮아지는 불안정성을 보였다. 1,2-Hexanediol 3.0%는 사용해서 보존력이 합격이나 2.0%도 cycle 조건에서 유화 불안정성을 나타내었다. Ethyl hexanediol 1.0%에서 곰팡이만 불합격되고 다소 pH가 감소하고, 상안정성은 우수하여 더 높은 농도에서 좋은 결과를 나타낼 가능성이 있다. 알킬 사슬이 짧은 methylpropanediol은 5.0, 10.0% 고농도로 처방해서 보존력은 합격했지만 점도가 매우 낮아지고 고온에서 유화상태가 불안정하며, 2-butyl-2-ethyl-1,3-propanediol 4.0%는 곰팡이에서 불합격하나 점도도 떨어지고 특이취도 나며 상안정성이 좋지 않다. 탄소 사슬이 짧은 propanediol계열은 고농도에 영향을 주므로 부스터로서도 높은 상승효과를 보긴 어려울 것으로 보인다. Ethylhexylglycerin 1.0%는 곰팡이에서 불합격이지만 더 높은 농도 처방이 우수한 효과를 나타낼 것으로 보인다. 결국, 고시 보존제로 혼합하여 처방된 대조군은 보존력과 안정성을 유지하였지만 시료의 단독 처방으로 보존력과 안정성을 동시에 만족하기에는 문제가 되며 기존 보존제나 시료들끼리 서로 혼합하여 처방하는 것이 우수한 제형 적용성을 높일 것으로 평가된다.
Results of preservative test and stability of emulsions containing alkanediols
2. 세포독성 및 항균력 평가 결과
고시 보존제 11종과 caprylyl glycol, 1,2-hexanediol, methylpropanediol의 3가지 다이올의 세포독성을 비교하였고 세포독성이 높은 순서부터 나열 기재하였다(Table 5). 파라벤은 butylparaben, propylparaben, methylparaben 순서로 즉, 에스터 결합된 알킬기가 길수록 항균력이 높은 것으로 알려져 있는데 세포독성이 높아지는 상관관계를 나타냈다. 유기산류(salicylic acid, dehydroacetic acid, sodium benzoate)를 제외하고 고시 사용한도(usage limit)가 높을수록 세포독성 IC50도 높아 세포독성이 나타날수록 사용한도가 낮아지는 경향을 나타냈다. 알칸디올도 탄소 사슬이 긴 caprylyl glycol, 1,2-hexanediol, methylpropanediol 순서대로 현저하게 세포독성을 나타냈다(Table 5). 이는 탄소수가 길수록 섬유아세포의 인지질로 구성된 세포막을 깊이 침투하여 변형시켜 독성을 나타내고 이는 미생물의 세포막에도 동일하게 독성이 나타날 수 있는 기전으로 보인다. 이는 미생물을 제어하는 의미도 있지만 사람 피부세포에 손상을 줄 수 있어 인체 안전성에 주의할 필요가 있다는 것을 의미한다(Soni et al., 2005). Caprylyl glycol은 diazolidinyl urea와 butylparaben 수준으로 높은 세포독성을 나타냈다. 이는 paper disk법과 MIC를 측정한 항균력 결과에 의하면 항균력이 있으면 세포독성이 커지는 것을 알 수 있다(Table 6). Caprylyl glycol은 methyl paraben보다 대부분의 균주에서 항균력이 우수하나 세포독성이 높고 1,2-hexanediol은 phenoxyethanol, benzyl alcohol, dehydroacetic acid보다 MIC 항균력이 낮으나 세포독성은 더 높아서 고시 보존제 항균효과보다 우수하다고 보기 어렵다. 고시 보존제들과 대표적인 알킬다이올과의 세포독성과 항균력 결과는 추후 새로운 보존제 대체제를 개발하는데 유용한 방향을 제공할 수 있을 것으로 보인다(Sundberg & Faergemann, 2008).
Antimicrobial effects of preservatives and alkanediols
Conclusion
알칸디올은 에멀젼에 적용하여 보존력을 나타내는 농도 범위내에서는 유화 불안정성을 나타낸다. 반면, 알킬 사슬이 긴 알칸디올은 에멀젼에서 함유 농도를 낮출 수 있어서 제형 안정성과 더불어 보존력을 제공한다. 친수성기와 친유성기를 동시에 가진 양친매성 알칸디올계 화합물은 그람양성 및 그람음성균에 대해 우수한 항균 활성을 보이는데 세포독성 결과와 상관관계를 확인했을 때 미생물 인지질로 구성된 세포막에 결합하여 세포막을 변형시키므로 보존력 향상에 도움을 준다. 알킬 사슬이 길수록 항균력이 우수하여 에멀젼 제형 내 사용량이 감소하여 제형 안정성도 유지되지만 세포독성과 위해성을 주의해야 한다. 본 연구의 결과들의 바탕으로 탄소수와 다이올의 화학구조에 의한 세포독성과 항균력의 상관관계를 활용하여 새로운 알칸디올을 개발하는데 도움이 될 것이다. 더욱 다양한 알칸디올의 탄소수 및 구조에 따라 항균력, 제형 안정성과 더불어 안전성을 연구한다면 더욱 우수한 대체방부제가 개발될 것으로 사료된다. 향후 미생물 오염에 대한 항균력, 인체에 대한 안전성, 제형의 상안정성 측면에서 혼합 사용하여 상승효과를 부여하는 이상적인 보존제 부스터와 보존시스템을 개발하는데 기여할 것으로 기대된다.
Acknowledgements
This work was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (No. 2020R1A2C1005993) and the support of the purchase conditional new product development project of the Ministry of Trade, Industry and Energy and the Small and Medium Business Technology Information Promotion Agency in 2024 (S3347582). The author is grateful to Enprani Co. Ltd for technical supports.
Notes
Author's contribution
BK conceived the experiments and performed experiments and analyzed data and wrote the manuscript.
Author details
Bora Kim (Professor), Department of Cosmetics Engineering, Mokwon University, 88 Doanbuk-ro, Seo-gu, Daejeon 35349, Korea.
