대체 보존제와 킬레이트제 간의 항균 시너지 효과에 대한 연구
요약
목적
화장품은 보존제의 사용을 줄이기 위해서 피부 컨디셔닝제이면서 항균효과가 있는 대체 보존제를 사용한다. 본 연구에서는 화장품에서 대체 보존제로 사용되고 있는 1,2-hexanediol, ethylhexylglycerin, caprylyl glycol을 대상으로 킬레이트제에 따른 항균 시너지 효과를 확인하였다.
방법
그람 양성균, 그람 음성균 및 효모균에 대하여 항균력의 변화를 확인하고자 하였다. 단독으로 사용시 minimum inhibitory concentration (MIC)와 minimum bactericidal concentration (MBC)를 확인하였고, 대체 보존제와 킬레이트제를 조합하여 checkerboard assay를 통해 시너지 효과를 확인하였다.
결과
MIC와 MBC 결과는 대체 보존제가 2% 이하의 농도에서 모든 균주(S.aureus, E.coli, C.albicans)에 대해 항균효과가 있음을 나타냈다. 킬레이트제는 S.aureus에서 disodium EDTA 0.06%, tetrasodium EDTA 0.03%로 뛰어난 MIC 결과를 보였고, tetrasodium EDTA 0.25%로 비교적 높은 MBC 결과를 나타내었다. Checkerboard assay 결과는 모든 균주에서 시너지 효과가 나타났으며, ethylhexylglycerin과 tetrasodium EDTA 조합이 ethylhexylglycerin 단독으로 사용할 때보다 2-25배 낮은 농도로 모든 균주를 제어하기에 용이하다고 판단되었다.
결론
대체 보존제 3종과 킬레이트제 6종 조합의 항균 시너지 효과가 있음을 확인하였다. 대체 보존제와 적절한 킬레이트제를 선택적으로 사용함으로써 대체 보존제 사용량을 감소시켜 피부자극 및 안정성 부분에 있어서 화장품 산업에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
핵심용어: 대체 보존제, 킬레이트제, 항균, 시너지, 화장품
Abstract
Purpose
To minimize the use of preservatives in cosmetics, the cosmetic industry has attempted to use alternative preservatives that can function as skin conditioning agents and possess antimicrobial effects. In this study, the antimicrobial synergistic effects of 1,2-hexanediol, ethylhexylglycerin, and caprylyl glycol, which are used as alternative preservatives in cosmetics, with various chelating agents were investigated.
Methods
Changes in the antimicrobial activity of the preservatives against gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, and yeast were examined. The minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentrations (MBC) of these agents when used alone were confirmed, and the synergistic effects were confirmed by combining alternative preservatives and chelating agents through a checkerboard assay.
Results
The MIC and MBC results confirmed the antimicrobial effects exerted by the alternative preservatives on all strains (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Candida albicans) at concentrations of ≤2%. The chelating agent exhibited excellent MIC results with 0.06% disodium EDTA and 0.03% tetrasodium EDTA in S.aureus and a relatively high MBC was observed with tetrasodium EDTA 0.25%. The checkerboard assay results demonstrated a synergistic effect against all strains, and the combination of ethylhexylglycerin and tetrasodium EDTA was determined to be easy to control all strains at concentrations that were 2–25 times lower than that of ethylhexylglycerin alone.
Conclusion
Antimicrobial synergistic effects were confirmed for combinations of three alternative preservatives and six chelating agents. The selective use of alternative preservatives and appropriate chelating agents can reduce the amount of alternative preservatives used which could benefit the cosmetic industry in terms of reducing skin irritation and stability.
Keywords: Alternative preservative, Chelating agent, Antimicrobial, Synergy, Cosmetics
中文摘要
目的
为了最大限度地减少化妆品中防腐剂的使用，化妆品行业尝试使用可作为皮肤调理剂并具有抗菌作用的替代防腐剂。在这项研究中，研究了用作化妆品替代防腐剂的1,2-己二醇、乙基己基甘油和辛二醇与各种螯合剂的抗菌协同效应。
方法
检测防腐剂对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌抗菌活性的变化。确认了这些药物单独使用时的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，并通过棋盘测定法确认了替代防腐剂和螯合剂组合的协同效应。
结果
MIC和MBC结果证实了替代防腐剂在浓度≤2%时，对所有菌株(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌)具有抗菌作用。该螯合剂在金黄色葡萄球菌中使用0.06% disodium EDTA和0.03% tetrasodiumEDTA时，表现出优异的MIC结果，并且使用0.25% tetrasodium EDTA时，观察到相对较高的MBC。棋盘测定结果表明，乙基己基甘油和tetrasodium EDTA的组合对所有菌株均具有协同作用，且在比单独使用乙基己基甘油低2-25倍的浓度下，可轻松控制所有菌株。
结论
三种替代防腐剂和六种螯合剂的组合证实具有抗菌协同作用。选择性使用替代防腐剂和适当的螯合剂可以减少替代防腐剂的用量，这在减少皮肤刺激和稳定性方面有利于化妆品行业。
关键词: 替代防腐剂, 螯合剂, 抗菌剂, 协同作用, 化妆品
Introduction
화장품은 수분을 포함한 각종 유기물 및 영양성분을 함유하기 때문에 미생물에 쉽게 노출되며 오염에 취약하다. 미생물에 오염된 화장품은 향취와 색상변화 등으로 화장품의 안정성을 저하시키며, 최근 화장품의 미생물 오염을 방지하기 위해서 pH, 수분활성도 조절 및 보존제를 첨가하는 등 다양한 기법을 제품 개발에 활용하고 있다( Halla et al., 2018). 대체 보존제로는 1,2-alkanediol계 화합물을 주로 사용하고 있으며, 1,2-alkanediol계 화합물은 탄소사슬의 1,2의 위치에 OH를 포함하고 있어 물에 대한 용해성이 매우 높아 대체 보존제 사용에 적합하며 탄소 사슬에 따라 분류되고, 탄소사슬이 증가할수록 물에 대한 용해도는 낮아진다( Kim, 2024; Shin et al., 2007; Wilbur et al., 2012). 1,2-alkanediol계 화합물 중 1,2-hexanediol은 미생물의 세포막 파괴가 용이하고, 0.25%-2% 농도에서 항균 효과를 나타내며 피부 자극이 없음이 보고되었다( Yogiara et al., 2015). Caprylyl glycol은 양친매성 물질로, 다른 보존제의 항균력 증가에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 단독으로는 항균효과가 미미하며, ethylhexylglycerin 등과 함께 혼합하여 사용한다( Lawan et al., 2009; Varvaresou et al., 2009; Ziosi et al., 2013). Ethylhexylglycerin은 친수성 glycerin과 소수성 alkiyl group의 축합 생성물이며 계면활성제, 피부 컨디셔닝제 역할을 하는 다기능 물질이다. 또한, 미생물 세포막의 표면 장력을 감소시키고 다른 항균 물질이 세포막에 접촉하도록 돕는다고 알려져 있어 항균효과에 도움을 주는 것으로 알려져 있다( Lawan et al., 2009; Varvaresou et al., 2009). 킬레이트제는 금속이온봉쇄제로 불리며 화장품의 안정성 또는 성상에 악영향을 끼치는 금속이온과 결합하여 불활성화 시킨다. 킬레이트제가 화장품의 항균력에 영향을 미치는 원리는, 전자쌍을 주고받는 배위결합에 의해 착화합물이 형성되며, 금속이온(+)과 리간드(-)의 배위결합이 2개 이상일 때 고리가 만들어지는데, 이 고리를 킬레이트 고리라고 한다. 이러한 킬레이트화 반응을 제품 내 금속이온(Fe 2+, Cu 2+, Mg 2+)과 킬레이트제의 여러 리간드와 결합하면서 미생물 세포막을 불안정화 시키고, 미생물의 이온 섭취를 감소시켜 미생물 증식을 저해하는 것으로 알려져 있다( Finnegan & Percival, 2015; Qiu et al., 2011; Siegert, 2014). 이에 본 연구에서는 대체 보존제로 활용되고 있는 alkanediol계 화합물 3종(1,2-hexanediol, caprylyl glycol, ethylhexylglycerin)과 킬레이트제 6종(disodium EDTA, tetrasodium EDTA, sodium citrate, citric acid, sodium phytate, hydroxypropyl cyclodextrin)을 선정하여 대체 보존제와 킬레이트제의 조합에 따른 상호 연관성을 알아보고자 하였다. Minimum inhibitory concentration (MIC)와 minimum bactericidal concentration (MBC)를 통해 총 9종의 항균력을 확인하였고, 대체보존제와 킬레이트제의 조합을 그람 양성균( Staphylococcus aureus), 그람 음성균( Escherichia coli), 효모균( Candida albicans)에 대하여 checkerboard assay로 FBC 지수 값을 확인하였다. 그 결과를 통해 시너지 효과(synergy), 부가 효과(additivity), 무관함(indifference) 및 상쇄 효과(antagonism) 판단 지표로 나타내었고, 각 조합의 항균 시너지를 확인함으로써 최적의 조합을 찾고 항균력의 향상 가능성을 확인하였다( Lundov et al., 2011).
Methods
1. 시료의 준비
본 실험에 사용된 대체 보존제 3종은 1,2-hexanediol (Cosmann, Korea), ethylhexylglycerin (Cosmann, Korea), caprylyl glycol (BioNteck, Korea), 킬레이트제 6종은 disodium EDTA (Nouryon, USA), tetrasodium EDTA (Hansong, Korea), sodium citrate (Jungbunzlauer, Austria), citric acid (Jungbunzlauer, Austria), sodium phytate (KPT, Korea), hydroxypropyl cyclodextrin (Morechem, Korea)을 사용하였다( Table 1). 모든 시험에 적용된 대체 보존제 3종은 dimethyl sulfoxide (DMSO; Samchun Chemicals, Korea)를 용매로, 킬레이트제 6종은 정제수를 용매로 희석하였다. 화장품 제형 개발 시 사용성과 안정성을 고려하여, 킬레이트제와 대체 보존제의 농도를 0.01%-2%로 설정하였다. 실험 진행 시 변수들을 통제하고 결과를 얻기 위해 시료를 동일조건으로 당일 제조하였다.
2. 사용 균주 및 배지
실험에 사용된 균주는 화장품 병원성 미생물 중에서 대표 균주인 그람 양성균 Staphylococcus aureus ( S.aureus, ATCC6538)와 그람 음성균 Escherichia coli ( E.coli, ATCC8739)와 효모균 Candida albicans ( C.albicans, ATCC10231)로 총 3종의 균주를 선정하였으며, American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 각 균주의 배양배지 및 배양조건은 그람 양성균과 그람 음성균의 경우 tryptic soy agar (TSA) 배지와 tryptic soy broth (TSB) 희석배지를 사용하고 효모균의 경우 sabouraud dextrose agar (SDA) 배지와 sabouraud dextrose broth 희석배지를 사용하며, Table 2에 나타내었다. 균주 활성화 및 배양에 사용한 배지는 Difco (USA)사의 제품을 사용하였다.
3. 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정
후보물질 9종의 MIC는 Clinical and Laboratory Standards Institute of the United States of America (CLSI)에 적용하여 2회 반복 실시하였다( CLSI, 2012). MIC를 측정하기 위해서 96-well plate에 후보물질을 농도별로 100 μL, 희석배지를 100 μL씩 분주하여 well 하나에 총 부피는 200 μL로 한다. 희석배지로는 세균은 TSB, 효모균은 SDB를 사용하였다. S.aureus, E.coli, 및 C.albicans 시험 균주의 농도를 설정하기 위하여 분광광도계(X-ma 3000; Human corp, Korea)를 이용하였으며, optical density 600 nm (OD 600)에서 시험 균주의 균액 농도가 세균은 10 6-7 CFU/mL, 효모균은 10 5-6 CFU/mL 되도록 설정하였다. Well 내에 균액을 20 μL씩 접종하여 각 well당 세균은 10 5-6 CFU/mL, 효모균은 10 4-5 CFU/mL로 최종균 농도가 되도록 하였다. 접종 후 세균은 32.5℃에서 18-24 h, 효모균은 22.5℃에서 48-72 h 배양시켰다. 배양 후 육안으로 균의 증식이 관찰되지 않은 well의 농도 중 최소 농도를 MIC로 결정하였다.
4. 최소살균농도(minimum bactericidal concentration, MBC) 측정
MBC는 MIC 시험에서 육안으로 균의 증식이 관찰되지 않은 well의 100 μL를 취하여 플레이트에 분주한 후 세균은 TSA, 효모균은 SDA를 Pour plate method로 진행하였다. 세균은 32.5℃에서 18-24 h, 효모균은 22.5℃에서 48-72 h 배양 후에 검출된 집락을 확인하여 초기에 접종된 균수와 비교하였을 때, 99.9% 사멸율이 넘는 최소 농도를 MBC로 결정하였다. MBC 시험은 2회 반복 실시하였다.
5. Synergy testing by checkerboard assay
Figure 1과 같이 96-well plate에 대체 보존제 3종과 킬레이트제 6종을 각 농도별로 50 μL씩 분주하고, 희석배지를 100 μL씩 분주하여 well 하나에 총 부피는 200 μL로 한다. 또한, 균액은 20 μL 접종하여 각 well당 세균은 10 5-6 CFU/mL, 효모균은 10 4-5 CFU/mL로 최종 균 농도가 되도록 하였다. 그 외에 시험 방법은 MBC와 동일하게 진행하였으며, 배양 후 육안으로 균의 증식이 관찰되지 않은 최소 농도의 배합비율을 구하여 부분 억제 농도(fractional bactericidal concentration, FBC)를 구하여 FBC 지수(FBC index)를 계산하였다.
물질 A의 FBC=(배합물질에서의 물질 A의 MBC)/(물질 A를 단독으로 사용하였을 때의 MBC)
물질 B의 FBC=(배합물질에서의 물질 B의 MBC)/(물질 B를 단독으로 사용하였을 때의 MBC)
FBC 지수=물질 A의 FBC+물질 B의 FBC
Result and Discussion
1. Minimum inhibitory concentration (MIC)
각 균주에 대한 대체 보존제와 킬레이트제를 각각 단독으로 사용했을 때 최소억제농도(MIC)를 확인하였으며, Table 3에 정리하였다. 킬레이트제는 disodium EDTA, tetrasodium EDTA에서 미생물 저해효과가 뛰어났으며, disodium EDTA는 0.06%, tetrasodium EDTA에서는 0.03%의 최소억제농도를 보였다. 그 외 나머지 킬레이트제의 항균효과는 미비하였고, 그 중 hydroxypropyl cyclodextrin물질은 S.aureus, E.coli, C.albicans 모두 2% 이하의 농도에서는 저해되지 않음을 확인하였다. 대체 보존제는 시험균주( S.aureus, E.coli, C.albicans) 모두 전반적으로 넓은 스펙트럼의 항균효과를 나타냈다. 일반적으로 1,2-alkanediol계 화합물은 탄소사슬이 증가할수록 항균력이 높아진다고 알려져 있으며( Wilbur et al., 2012), S.aureus와 C.albicans에서는 탄소 사슬이 증가할수록 항균력이 높아짐을 확인하였다. 다만, E.coli에서 탄소사슬이 8개인 caprylyl glycol은 탄소사슬이 11개인 ethylhexylglycerin보다 저해농도가 낮았으며, 결과를 보아 그람 음성균에서의 1,2-alkanediol의 구조적인 항균 연구가 필요할 것으로 판단된다.
2. Minimum bactericidal concentration (MBC)
최소살균농도(MBC)는 최소억제농도(MIC)에서 균의 증식이 관찰되지 않은 농도를 설정하여 실험을 진행하였으며 그 결과는 Table 4에 나타내었다. 후보물질 모두 전반적으로 MIC와 동일한 경향을 보였으며, 대체 보존제는 탄소사슬이 8개 이상인 caprylyl glycol과 ethylhexylglycerin의 1% 이하 농도에서 살균효과가 확인되었다. Ethylhexylglycerin은 S.aureus, C.albicans에 대한 최소사멸농도가 0.25% 였으며, 양성대조군인 methyl paraben의 농도보다 낮게 나타났다. Caprylyl glycol은 E.coli에서 최소사멸농도가 0.5%로 양성 대조군인 methyl paraben의 최소사멸농도 0.75%보다 낮은 농도이므로 살균효과가 우수함을 확인하였다. 킬레이트제 6종 중 sodium citrate와 citric acid 두 물질은 E.coli에서 2% 이하의 농도에서 최소 살균농도가 확인되지 않았고, S.aureus에서 tetrasodium EDTA는 0.25 %로 나타나며 후보물질 중 가장 항균효과가 뛰어났다.
3. Synergy testing by checkerboard assay
S.aureus, E.coli 및 C.albicans에 대한 높은 항균력의 최적 배합 조건을 결정하기 위해 대체 보존제와 킬레이트제를 조합하여 checkerboard assay을 통한 FBC 지수로 항균 시너지 효과를 연구하였다. 킬레이트제 5종과 대체 보존제 3종에 관한 checkerboard test 결과는 Table 5- 7에 나타내었다. 킬레이트제 중 hydroxypropyl cyclodextrin은 MIC와 MBC에서 결과가 확인되지 않아 checkerboard assay를 진행하지 않았다.
S.aureus에서의 checkerboard assay 결과는 Table 5에 정리하였다. 모든 대체 보존제(1,2-hexanediol, caprylyl glycol, ethylhexylglycerin)는 disodium EDTA, tetrasodium EDTA의 킬레이트제와 시너지 효과를 나타내었고, ethylhexylglycerin은 citric acid와 추가로 시너지 효과를 나타내어 S.aureus에서는 총 7가지 조합의 시너지 효과를 확인할 수 있었다. 1,2-hexanediol은 disodium EDTA, tetrasodium EDTA 와의 조합에서 1,2-hexanediol 단독으로 사용할 때보다 16-200배 낮은 농도로 시너지 효과를 나타냈다. caprylyl glycol은 disodium EDTA, tetrasodium EDTA와 조합한 경우에 caprylyl glycol 단독으로 사용할 때보다 100배 낮은 농도로 시너지 효과를 보였다. 또한, ethylhexylglycerin은 disodium EDTA, tetrasodium EDTA을 조합이 단독으로 적용한 경우보다 8-25배 낮은 농도를 확인했으며, citric acid와 조합한 경우에는 단독으로 사용할 때보다 25배 낮은 농도로 시너지 효과가 확인되었다. 추가로, sodium phytate는 대체 보존제 3종(1,2-hexanediol, caprylyl glycol, ethylhexylglycerin) 모두 무관함을 보였다.
E.coli의 checkerboard assay 결과는 Table 6에 정리하였다. Ethylhexylglycerin은 disodium EDTA, tetrasodium EDTA의 킬레이트제와 조합에서 시너지 효과를 나타났고, ethylhexylglycerin 단독으로 사용할 때보다 4배 낮은 농도로 시너지 효과를 보였다. 킬레이트제 중 citric acid와 sodium phytate 두 물질은 MBC에서 결과가 확인되지 않아 checkerboard assay를 진행하지 않았다.
C.albicans의 checkerboard assay 결과는 Table 7에 정리하였고, 총 7가지 조합의 시너지 효과가 확인되었다. 1,2-hexanediol은 tetrasodium EDTA, citric acid 및 sodium phytate 3종의 킬레이트제와 조합에서 1,2-hexanediol 단독으로 사용할 때보다 4-200배 낮은 농도로 시너지 효과를 확인하였다. Caprylyl glycol은 disodium EDTA 및 sodium phytate 2종의 킬레이트제와 조합이 caprylyl glycol 단독으로 사용할 때보다 8배 낮은 농도로 시너지 효과를 나타냈다. Ethylhexylglycerin은 tetrasodium EDTA 및 sodium phytate 2종의 킬레이트제와 조합 시 ethylhexylglycerin 단독으로 사용할 때 보다 25배 낮은 농도로 시너지 효과가 확인되었다.
해당 균주 중 그람 음성균인 E.coli에서 가장 적은 시너지 조합이 확인되었는데, 이와 같은 결과는 항균 메커니즘으로 예측 할 수 있다. 박테리아는 phospholipid와 inner membrane proteins (IMP)으로 구성된 내막(inner membrane)으로 둘러싸여 있는데, 그람 음성균은 그람 양성균과 달리 내막(inner membrane)과 외막(outer membrane)으로 구성되어 두꺼운 구조로써 항균효과가 있는 보존제가 침투하기 쉽지 않다. 외막(outer membrane)은 phospholipid와 lipopolysaccharides (LPS) 및 단백질로 구성되는데, 제일 바깥에 위치하고 있는 LPS성분 중 올리고당의 음전하를 안정화시키는 2가 양이온을 제거하는 역할이 EDTA다. EDTA가 2가 금속 양이온(Cu 2+, Mg 2+)을 제거하여 LPS를 방출하고 내막(inner membrane)의 phospholipid를 노출시켜 대체 보존제가 침투하여 항균효과를 나타낸 것이라고 예상된다( Finnegan & Percival, 2015; Sperandeo et al., 2008; Sun et al., 2022).
Conclusion
본 연구에서는 대체 보존제와 킬레이트제 사이에서의 항균 시너지 효과를 확인하고 최적의 조합을 찾고자, 킬레이트제 6종과 대체 보존제 3종을 선정하여 그람 양성균, 그람 음성균, 효모균에 대한 항균력을 MIC와 MBC를 통해 확인한 후, checkerboard assay를 통한 FBC 지수 값으로 항균 시너지 효과를 연구하였다.
대체 보존제는 전반적으로 모든 균주(S.aureus, E.coli, C.albicans)에서 항균효과를 확인하였고, 킬레이트제는 disodium EDTA, tetrasodium EDTA에서 일부 미생물의 저해 효과를 보였다. 대체 보존제와 킬레이트제 간의 항균 시너지 효과는 시너지, 부가효과 및 무관함으로 평가하여 확인하였다. 1,2-hexanediol은 tetrasodium EDTA와의 조합이 모든 균주(세균, 효모)에서 우수한 효과를 나타냈다. Caprylyl glycol은 disodium EDTA의 조합이 S.aureus에서 시너지 효과가 가장 높게 나타났고, C.albicans에서는 sodium phytate의 조합이 가장 우수했다. 하지만, E.coli에서는 킬레이트제와의 시너지 효과가 나타나지 않았다. Ethylhexylglycerin은 disodium EDTA와의 조합에서 세균(S.aureus, E.coli)이 가장 우수한 시너지를 보였으며, C.albicans는 sodium phytate 조합에서 가장 높은 시너지 효과를 나타냈으며, 미생물 종에 따라서 대체 보존제와 킬레이트제 간의 항균시너지 효과의 차이가 발생함을 확인하였다.
이와 같은 결과를 통하여 S.aureus, E.coli 및 C.albicans에 대하여 모두 시너지 효과가 있는 조합은 ethylhexylglycerin과 tetrasodium EDTA임을 확인하였다 또한, 세균에서의 항균력을 높이기 위한 조합으로 ethylhexylglycerin과 EDTA 2종(disodium EDTA, tetrasodium EDTA)을 적용하고, 효모균에서의 항진균력을 높이기 위한 조합으로는 sodium phytate와 대체 보존제 3종(1,2-hexanediol, caprylyl glycol, ethylhexylglycerin)을 선택적으로 활용할 수 있을 것이라 사료된다.
이번 연구를 통해 대체 보존제와 킬레이트제 조합에 관하여 항균력에 대한 경향을 파악하였다. 이를 바탕으로 상업적으로 활용하기 위해선 각 물질의 조합에 대하여 화장품 제형에 적용하여 방부력시험, 피부자극시험, 광독성시험 및 인체적용시험과 같은 안정성을 추가로 연구할 필요가 있다.
Figure 1.
Checkerboard assay for comparing the synergistic activities of alternative preservatives and chelating agents.
In a 96-well plate, an alternative preservative and chelating agent were dispensed at concentrations of 2% to 0.01%. Subsequently, the dilution broth and inoculum were dispensed and cultured. White wells indicate the absence of microbial growth and gray wells indicate microbial growth.
Table 1.
List of alternative preservatives and chelating agents
|
INCI |
Chemical formula |
Function1)
|
|
disodium EDTA |
C10H16N2O8*2Na |
chelating agents |
|
tetrasodium EDTA |
C10H16N2O8*4Na |
chelating agents |
|
sodium citrate |
C6H5O7*3Na |
chealting agents, pH control agents |
|
citric acid |
C6H8O7
|
chealting agents, pH control agents |
|
sodium phytate |
C6H6O24P6*12Na |
chelating agents |
|
hydroxypropyl cyclodextrin |
C42H70-nO35(C3H8O2)n |
chelating agents, skin conditioning |
|
1,2-hexanediol |
C6H14O2
|
skin conditioning agents |
|
caprylyl glycol |
C8H18O2
|
hair and skin conditioning agents |
|
ethylhexylglycerin |
C11H24O3
|
skin conditioning agents |
Table 2.
Culture media and conditions for bacteria and yeast used in this study
|
Strain |
Type |
Media
|
Temperature (℃) |
Time (h) |
|
Agar |
Broth |
|
S. aureus
|
Gram-positive |
TSA1)
|
TSB2)
|
32.5 |
18–24 |
|
E. coli
|
Gram-negative |
TSA |
TSB |
32.5 |
18–24 |
|
C. albicans
|
Yeast |
SDA3)
|
SDB4)
|
22.5 |
48–72 |
Table 3.
Minimum inhibitory concentration (MIC) of alternative preservatives and chelating agents
|
Materials |
MIC (%)
|
Gram (+) bacterial
|
Gram (-) bacterial
|
Yeast
|
|
S.aureus
|
E.coli
|
C.albicans
|
|
disodium EDTA |
0.06 |
2 |
2 |
|
tetrasodium EDTA |
0.03 |
1 |
1 |
|
sodium citrate |
2 |
>2 |
2 |
|
citric acid |
2 |
2 |
2 |
|
sodium phytate |
1 |
2 |
1 |
|
hydroxypropyl cyclodextrin |
>2 |
>2 |
>2 |
|
1,2-hexanediol |
0.5 |
1 |
0.5 |
|
caprylyl glycol |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
|
ethylhexylglycerin |
0.12 |
0.5 |
0.12 |
|
methyl paraben1)
|
0.38 |
0.2 |
0.1 |
Table 4.
Minimum bactericidal concentration (MBC) of alternative preservatives and chelating agents
|
Materials |
MBC (%)
|
Gram (+) bacterial
|
Gram (-) bacterial
|
Yeast
|
|
S.aureus
|
E.coli
|
C.albicans
|
|
disodium EDTA |
2 |
2 |
2 |
|
tetrasodium EDTA |
0.25 |
2 |
2 |
|
sodium citrate |
2 |
>2 |
2 |
|
citric acid |
2 |
>2 |
2 |
|
sodium phytate |
2 |
2 |
2 |
|
hydroxypropyl cyclodextrin |
>2 |
>2 |
>2 |
|
1,2-hexanediol |
2 |
2 |
2 |
|
caprylyl glycol |
1 |
0.5 |
0.5 |
|
ethylhexylglycerin |
0.25 |
1 |
0.25 |
|
methyl paraben1)
|
0.75 |
0.75 |
0.38 |
Table 5.
Checkerboard assay result for S.aureus
Synergy testing by checkerboard assay
|
|
Strain |
A |
B |
MBC (%) for materials combinations
|
FBC index |
Interpretation1)
|
|
A |
B |
|
S.aureus
|
1,2-hexanediol |
disodium EDTA |
0.12 |
0.12 |
0.12 |
synergy |
|
tetrasodium EDTA |
0.01 |
0.12 |
0.49 |
synergy |
|
sodium citrate |
0.01 |
2 |
1.01 |
indifference |
|
citric acid |
0.01 |
1 |
0.51 |
additivity |
|
sodium phytate |
0.01 |
2 |
1.01 |
indifference |
|
caprylyl glycol |
disodium EDTA |
0.01 |
0.12 |
0.07 |
synergy |
|
tetrasodium EDTA |
0.01 |
0.12 |
0.49 |
synergy |
|
sodium citrate |
0.01 |
1 |
0.51 |
additivity |
|
citric acid |
0.01 |
1 |
0.51 |
additivity |
|
sodium phytate |
0.50 |
2 |
1.50 |
indifference |
|
ethylhexylglycerin |
disodium EDTA |
0.01 |
0.12 |
0.10 |
synergy |
|
tetrasodium EDTA |
0.03 |
0.06 |
0.36 |
synergy |
|
sodium citrate |
0.01 |
1 |
0.54 |
additivity |
|
citric acid |
0.01 |
0.5 |
0.29 |
synergy |
|
sodium phytate |
0.01 |
2 |
1.04 |
indifference |
Table 6.
Checkerboard assay result for E.coli
Synergy testing by checkerboard assay
|
|
Strain |
A |
B |
MBC (%) for materials combinations
|
FBC index |
Interpretation1)
|
|
A |
B |
|
E.coli
|
1,2-hexanediol |
disodium EDTA |
2 |
0.12 |
1.06 |
indifference |
|
tetrasodium EDTA |
1 |
1 |
1 |
additivity |
|
sodium citrate |
N.D.2)
|
N.D. |
N.D. |
N.D. |
|
citric acid |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
|
sodium phytate |
0.25 |
2 |
1.13 |
indifference |
|
caprylyl glycol |
disodium EDTA |
1 |
0.01 |
2.01 |
indifference |
|
tetrasodium EDTA |
0.5 |
0.5 |
1.25 |
indifference |
|
sodium citrate |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
|
citric acid |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
|
sodium phytate |
0.06 |
2 |
1.12 |
indifference |
|
ethylhexylglycerin |
disodium EDTA |
0.25 |
0.06 |
0.28 |
synergy |
|
tetrasodium EDTA |
0.25 |
0.5 |
0.5 |
synergy |
|
sodium citrate |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
|
citric acid |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
N.D. |
|
sodium phytate |
0.5 |
1 |
1 |
additivity |
Table 7.
Checkerboard assay result for C.albicans
Synergy testing by checkerboard assay
|
|
Strain |
A |
B |
MBC (%) for materials combinations
|
FBC index |
Interpretation1)
|
|
A |
B |
|
C.albicans
|
1,2-hexanediol |
disodium EDTA |
1 |
2 |
1.50 |
indifference |
|
tetrasodium EDTA |
0.01 |
0.06 |
0.04 |
synergy |
|
sodium citrate |
0.25 |
1 |
0.63 |
additivity |
|
citric acid |
0.5 |
0.25 |
0.38 |
synergy |
|
sodium phytate |
0.01 |
0.25 |
0.13 |
synergy |
|
caprylyl glycol |
disodium EDTA |
0.06 |
0.5 |
0.37 |
synergy |
|
tetrasodium EDTA |
0.01 |
1 |
0.52 |
additivity |
|
sodium citrate |
0.01 |
1 |
0.52 |
additivity |
|
citric acid |
0.5 |
2 |
2 |
indifference |
|
sodium phytate |
0.06 |
0.12 |
0.18 |
synergy |
|
ethylhexylglycerin |
disodium EDTA |
0.12 |
0.5 |
0.73 |
additivity |
|
tetrasodium EDTA |
0.01 |
0.5 |
0.29 |
synergy |
|
sodium citrate |
0.06 |
1 |
0.74 |
additivity |
|
citric acid |
0.06 |
2 |
1.24 |
indifference |
|
sodium phytate |
0.01 |
0.25 |
0.17 |
synergy |
References
Alvarez-Rivera G, Llompart M, Lores M, Garcia-Jares C. Chapter 9-Preservatives in cosmetics: regulatory aspects and analytical methods. In Analysis of Cosmetic Products (Second Edition). In: Salvador A, Chisvert A, eds. Elsevier. pp175-224. 2018.
Bellio P, Fagnani L, Nazzicone L, Celenza G. New and simplified method for drug combination studies by checkerboard assay. MethodsX 8: 101543. 2021.    Bonapace CR, Bosso JA, Friedrich LV, White RL. Comparison of methods of interpretation of checkerboard synergy testing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 44: 363-366. 2002. Clinical and laboratory standards institute (CLSI). CLSI Document M07-A9: Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: approved standard (19th edition). CLSI, Wayne. USA. pp1-63. 2012.
Darbre PD, Aljarrah A, Miller WR, Coldham NG, Sauer MJ, Pope GS. Concentrations of parabens in human breast tumours. Journal of Applied Toxicology 24: 5-13. 2004. Finnegan S, Percival SL. EDTA: an anti-microbial and antibiofilm agent for use in wound care. Advances in Wound Care 4: 415-421. 2015. Halla N, Fernandes IP, Heleno SA, Costa P, Boucherit-Otmani Z, Boucherit K, Rodrigues AE, Ferreira ICFR, Barreiro MF. Cosmetics preservation: a review on present strategies. Molecules 23: 1571. 2018. Jung SJ, Hwang YS, Choi CM, Park AS, Kim SU, Kim HJ, Kim JH, Jung K. Examination and quantification of preservatives in cosmetics for children. Journal of the Society of Cosmetic Scientists of Korea 41: 219-227. 2015. Kim BR. Correlation of cytotoxicity and antimicrobial activity of alkandiols and their impact on stability in emulsions. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 22: 335-343. 2024.  Lawan K, Kanlayavattanakul M, Lourith N. Antimicrobial efficacy of caprylyl glycol and ethylhexylglycerine in emulsion. Journal Health Research 23: 1-3. 2009.
Lundov MD, Johansen JD, Zachariae C, Moesby L. Low-level efficacy of cosmetic preservatives. International Journal of Cosmetic Science 33: 190-196. 2011. Matwiejczuk N, Galicka A, Brzóska MM. Review of the safety of application of cosmetic products containing parabens. Journal of Applied Toxicology 40: 176-210. 2020. Nowak K, Jabłońska E, Ratajczak-Wrona W. Controversy around parabens: alternative strategies for preservative use in cosmetics and personal care products. Environmental Research 198: 110488. 2021. Qiu DH, Huang ZL, Zhou T, Shen C, Hider RC. In vitro inhibition of bacterial growth by iron chelators. FEMS Microbiology Letters 314: 107-111. 2011. Shin KH, Kwack IY, Lee SW, Suh KH, Moon SJ, Chang IS. Effects of polyols on antimicrobial and preservative efficacy in cosmetics. Journal of the Society of Cosmetic Scientists of Korea 33: 111-115. 2007.
Siegert W. Boosting the antimicrobial efficiency of multifunctional additives by chelating agents. SOFW-International Journal for Applied Science 140: 32-39. 2014.
Sperandeo P, Lau FK, Carpentieri A, De Castro C, Molinaro A, Dehò G, Silhavy TJ, Polissi A. Functional analysis of the protein machinery required for transport of lipopolysaccharide to the outer membrane of Escherichia coli. Journal of Bacteriology 190: 4460-4469. 2008. Sun J, Rutherford ST, Silhavy TJ, Huang KC. Physical properties of the bacterial outer membrane. Nature Reviews. Microbiology 20: 236-248. 2022. Varvaresou A, Papageorgiou S, Tsirivas E, Protopapa E, Kintziou H, Kefala V, Demetzos C. Self-preserving cosmetics. International Journal of Cosmetic Science 31: 163-175. 2009. Wilbur J, Wilma F, Donald V, Ronald A, Curtis D, Daniel L, James G, Ronald C, Thomas J, Paul W. Safety assessment of 1,2-glycols as used in cosmetics. International Journal of Toxicology 31: 147-168. 2012.
Hwang SJ, Park S, Hwang JK, Pan JG. Food-grade antimicrobials potentiate the antibacterial activity of 1,2-hexanediol. Letters in Applied Microbiology 60: 431-439. 2015. Ziosi P, Manfredini S, Vandini A, Vertuani S, Fraternali M. caprylyl glycol/phenethyl alcohol blend for alternative preservation of cosmetic. Cosmetics & Toiletries Magazine 128: 538-549. 2013.
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