Introduction
피부는 외부 자극을 감각하고 이로부터 인체를 보호할 뿐 아니라 여러가지 대사 기능을 수행하는 역동적인 기관이다(Bellu et al., 2021). 특히 각질층(stratum corneum, SC)은 외부 환경으로부터 인체를 보호하기 위해 화학적, 면역학적 피부장벽(skin barrier)을 형성하여 방어 및 선택적 투과 기능을 수행한다(Proksch et al., 2008; Park & Choi, 2010). 하지만 연령이 증가하고 신체가 마모되면서 피부는 노화되기 시작하면서 스트레스나 영양 부족, 자외선 등으로 인해 피부의 노화 속도는 점점 더 빨라진다(Kim et al., 2010).
이렇게 피부 노화가 진행되면 특히 외부 환경에 지속적으로 노출될 수밖에 없는 안면 피부에서 그 변화가 먼저 나타나게 되는데, 표피가 점점 얇아지고 늘어져 주름이 생기게 되고, 피부 표면의 색소가 불규칙이거나 과도하게 침착하게 되면서 안색은 창백해진다(Lee, 2009; Kim et al., 2019). 또한 피부의 탄력이 저하되면서 피부 표면의 모공이 확장되거나 중력 방향으로 늘어져 모공성 주름이 형성되기도 한다(Cha et al., 2015).
특히 피부장벽 기능이 손상되면 각질층의 수분 보유량이 급격히 감소해 피부는 건조해지고 표면은 거칠어진다(Park & Choi, 2010; Tobin, 2017). 또한 피부 항상성이 무너져 외부 자극에 과민해지고 다양한 피부 염증과 감염의 위험성이 증가되어(Lee, 2018), 이로 인해 피부의 노화는 더 가속된다(Choi, 2019). 더욱이 노화로 인해 손상된 피부장벽은 젊은 피부에 비해 장벽 이상 증상이 현격하게 나타나고 그 회복 속도도 늦어진다(Lee, 2009). 그러므로 피부장벽의 기능을 강화하거나 개선, 장벽의 손상을 복구하는데 도움이 되는 소재들을 항 노화 기술에 접목시키는 것을 매우 의미 있게 보고 있다(Lee, 2018). 피부의 지질장벽의 구성원인 세라마이드(ceramide)나 천연보습인자에 속하는 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 등은 이미 항 노화 소재로 연구되었으며, 최근 들어 피부장벽의 복구 또는 강화에 도움이 되는 생리활성성분들이 항 노화 소재로 보고되고 있는 것 또한 이에 대한 방증일 것이다(Kim et al., 2011; Lee, 2018).
한편, 건강한 피부 장벽은 완벽한 층상 구조(lamella structure)를 형성하여 인체에 필요한 수분이나 전해질 증발을 효과적으로 막고 피부 표면의 외부 물질을 차단한다. 그러나 이 과정에서 피부에 도포되는 유효한 활성성분의 흡수 또한 차단되어 그 도포 효과를 기대하기가 매우 어렵게 된다(Kim, 2011; Verma et al., 2016; Jang et al., 2017; Kim et al., 2022). 이에 따라 피부의 손상은 최소화하면서 피부 장벽을 효율적으로 투과하여 피부에 도포되는 활성성분의 흡수는 최대화하기 위한 방법으로(Prausnitz & Langer, 2008), 피부를 통해 활성성분을 표적 부위까지 흡수시키는 기술인 경피전달시스템(transdermal delivery system, TDS)에 대한 연구들이 꾸준히 진행되고 있다(Salminen et al., 2023).
특히 이러한 경피전달시스템은 화장품 산업에서 그 연구가 더욱 두드러지고 있는데, 피부의 성장 인자(growth factor)나 펩타이드(peptides) 등의 피부세포 친화 성분을 응용하여 활성성분을 효율적으로 흡수시키거나(Ryu et al., 2015; Kang et al., 2019), 나노 에멀젼, 리포좀 및 폴리머 미셀 등으로 나노 제형화 하여 피부 흡수를 높이는 방법 등이 그것이라 하겠다(Cho, 2015; Costa & Santos, 2017; Wang et al., 2019; Bellu et al., 2021). 또한 이온 영동(iontophoretic delivery)이나 초음파 시술(ultrasonic treatment) 등의 물리적 방법이나 생체 적합성 마이크로 니들(microneedle channeling system)을 활성성분과 함께 피부에 직접 적용하여 피부 흡수를 유도하였다(Prausnitz et al., 2004; Kim, 2011; Lee & Lee, 2014; Lee, 2019; Adatto & Adatto, 2020; Woo & Kwak, 2023). 더불어 제조 기술적으로는 기능성활성성분의 피부 투과도를 높이기 위해 초 고압 유화 제조공법을 보고하기도 하였다(Vladisavljević et al., 2006; Jang et al., 2017).
최근에는 이러한 경피전달시스템의 혁신적인 기술 중 하나로 마이크로스피큘(Micro-spicules)이 재발견되면서 활성성분을 담지한 스피큘 화장품에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Ha et al., 2017; Tansathien et al., 2021; Kim et al., 2022; Jitsaeng et al., 2023). 스피큘(sponge spicules)이란 해양이나 담수에 서식하는 해면(sponge)의 골격 형성에 관여하는 경화세포로, 말단이 스파이크와 같은 구조로 되어있으며(Sethmann & Wörheide, 2008), 모양과 크기가 불규칙한 분자 비대칭성을 가지는 천연 물질로 알려져 있다(Han et al., 2020). 이러한 스피큘을 피부 전달에 유용한 화장품 원료로 정제하여 피부에 적용하게 되면 최소 72시간 동안 피부 내에 머무르면서 활성성분의 피부 흡수율은 높이며, 이로 인한 피부장벽의 손상은 짧은 시간 내에 자연적으로 회복될 수 있어 피부에도 안전하다(Zhang et al., 2017).
이는 다양한 임상 연구로도 확증이 되어, 정제된 스피큘이 피부에 적용되면 자연스럽게 피부조직이 자극되면서 피부재생과정을 촉진해 세포의 성장인자 및 사이토카인 등의 발현을 도와 피부 개선이 능동적으로 일어나는 것으로 보고하였으며(Kim, 2011), 무엇보다도 스피큘이 피부 자극으로부터 안전하며 일반 기능성 화장품에 비하여 그 효능이 더 우수할 뿐 아니라(Park et al., 2017), 피부 네트워크를 해치지 않고 피부장벽을 관통하여 활성성분을 전달할 수 있음도 입증하여(Kim et al., 2022) 스피큘의 기능성 화장품으로의 응용 가능성을 보고하였다.
또한 정제된 스피큘에 활성 성분을 담지한 후 피부에 적용하였을 때 피부 흡수와 경피로의 침투율이 뛰어났으며(Han et al, 2020; Kim et al., 2022), 리포좀과 복합 사용하였을 경우 소간섭 RNA(small interfering RNA, SiRNA), 히알루론산(hyaluronic acid, HA)등과 같은 친수성 고분자들의 효과적인 피부전달도 가능하였다(Tansathien et al., 2019; Zhang et al., 2019; Liang et al., 2020). 이러한 스피큘 기반의 친수성 및 소수성 펩타이드가 경피 경로를 통해 투여되었을 경우 다른 경로에 비해 전달 시스템으로서의 효능도 뛰어났으며(Zhang et al., 2021), 피부에도 매우 안전하였다(Han & Kim, 2021; Zhang et al., 2021).
이에 본 연구에서는 이미 코스메슈티컬의 우수한 활성성분으로 검증되었던 저분자 펩타이드 콤플렉스(Han & Kim, 2024)에 독자 기술로 정제한 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품을 피부에 적용하였을 때 미백 효능, 모공 개선 및 피부장벽 강화 등에서 어떠한 차별성을 가지는지를 비교 검증하고자 하였다. 또한 이를 통해 마이크로스피큘 화장품의 우수성을 과학적으로 입증하여, 경피 전달시스템 기반 화장품의 새로운 방향성을 제시하고자 하였다.
이를 위하여 먼저 비인체 적용시험(in vitro test)을 통하여 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼의 미백 효능강도(efficacy)를 확인한 후, 이 결과를 토대로 인체적용시험(in vivo test)에서는 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼과 이 에멀젼에 독자 기술로 정제한 마이크로스피큘을 복합 포함한 화장품을 피부에 각각 적용하여, 시험 전후 나타나는 피부의 변화 정도를 비교 검증하였다
Methods
1. 시험제품
본 연구의 시험제품에 이용된 저분자 펩타이드 콤플렉스는 ㈜본에스티스(Vonestis, Korea)에서 독자 개발한 PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM (Vonestis)으로, 이는 galloyl pentapeptide-33과 acetyl hexapeptide-8, palmitoyl shtripeptide-1 amide 및 palmitoyl sh-tripeptide-3 amide, 그리고 palmitoyl tripeptide-53 amide 등을 조합하여 조성된 펩타이드 콤플렉스로, 피부 노화로 야기되는 다양한 피부 변화들을 복구하는 항노화 특화 원료이다.
또한 마이크로스피큘은 북유럽 청정 담수에 서식하는 해면(sponge)에서 채취한 스피큘을 원재료로 하여, 독자 기술인 고순도 분리정제 공법으로 불순물을 제거한 후 반복된 정제 과정을 거쳐 일정한 모양인 길이 약 200 μm, 두께 15-17 μm로 정제한 파우더형 고순도 마이크로스피큘(1989 PI-TOSOME spicule, Vonestis)을 이용하였다.
본 시험에서는 비교군(C군)으로 에멀젼 제형에 저분자 펩타이드 콤플렉스(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM, Vonestis)를 5중량% 투입하였으며, 시험군(E군)으로는 C군의 에멀젼에 정제된 마이크로스피큘(1989 PI-TOSOME spicule, Vonestis)을 0.2중량% 투입하여 각각 프로토타입(prototype)으로 제조하였다. 이 중 비인체 적용시험에 사용된 C군의 에멀젼은 희석액을, 이를 비교 검증하는 인체 적용시험에는 두 그룹 모두 프로토타입의 완제품을 사용하였다.
2. 세포 생존율 측정
본 세포 생존율 측정 시험에서는 NADH (환원형 NAD, reduced nicotinamide adenine dinucleotide) 등의 세포 내 환원성 물질에 의해 MTT 라디컬(radical)이 미토콘드리아에 포르마잔(formazan)을 생성하는 것을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 것으로 시험제품인 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀전의 세포에 대한 안전성 여부를 평가하였다. 흑색종(melanoma) 세포주인 B16F10 cell (한국세포주은행, Korea)을 사용하였으며, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay protocol에 의거하여 전 시험과정을 진행하였다.
B16F10 cell은 DMEM broth (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GE healthcare, USA)로 처리하여 CO2 배양기에서 세포를 배양하였으며 5%의 fetal bovine serum (FBS; Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 제조하였다. 이때 항생물질로 Penicillin-Streptomycin (100X) (Sigma-Aldrich) 1%를 사용하였다. 그 후 B16F10 cell을 96-well plate에 5.0×104 cells/well로 균등하게 분주하여 24 시간 배양하였다. 이후에 상층액을 제거한 후 DMEM broth에 희석 처리한 시험제품을 1 mg/mL 기준으로 하여 농도 기울기(25, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL)로 각각 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 그 후 재차 상층액을 제거한 뒤 MTT 용액(5 mg/mL)을 각 well에 처리하여 37℃, 약 5% 농도의 CO2 배양기 환경에서 MTT 포르마잔 결정을 생성시켰으며, 각 well에 생성된 포르마잔 결정이 제거되지 않게 상층액을 제거하고 각 well에 DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 고르게 용해하였다. 이후 UV-Visible Spectrophotometer (Ultrospec 3100 Pro; GE Healthcare)에서 540 nm 파장에서 cell의 흡광도 값(optical density, OD value)를 도출하였다.
3. 미백 효능 측정
본 시험에서는 피부 세포가 α-MSH (α-melanocyte-stimulating hormone) 및 자외선에 의해 자극을 받을 경우 멜라닌이 생성되는 원리를 이용하여 본 시험제품인 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀전의 멜라닌 생성 억제율을 측정하는 것으로 미백 효능을 측정하였다. 멜라닌을 생성하는 흑색종(melanoma) 세포주인 B16F10 cell을 세포 생존율 시험과 동일한 방법으로 전 배양한 후 세포 안정화를 위해 96-well plate에 5.0×104 cells/well로 균등하게 주입하여 24 시간 동안 배양하였다.
그런 후 상층액을 제거하고 대조군의 경우 B16F10 cell에 α-MSH를 1 nM 처리하였으며, 시험군의 경우 α-MSH가 1 nM 처리된 B16F10 cell에 시험제품을 1 mg/mL 기준으로 하여 농도 기울기(25, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL)로 각각 처리한 뒤 두 그룹 모두 자외선(UVB)을 조사하면서 24 시간 배양하였다. 그 후 상층액 100 μL와 griess reagent 100 μL를 골고루 혼합한 후, UV-Visible Spectrophotometer (Ultrospec 3100 Pro; GE Healthcare)에서 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성량을 측정하였다. 이에 도출된 값은 멜라닌 생성 억제율(%)로 환산하였으며, 억제율이 높을수록 미백 효능이 뛰어난 것으로 보고 대조군과 시험군을 비교 평가하였다.
Melanin inhibition ratio (%)=(1-(OD treated/OD control))×100
4. 인체적용시험
1) 시험참여자 선정 및 효능 평가 방법
본 연구에서는 미백 효능이 확인된 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀전에 대한 피부의 효능 강도(efficacy)를 검증하고, 이 결과를 토대로 인체적용시험(in vivo test)에서는 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼과 이 에멀젼에 독자 기술로 정제한 마이크로스피큘을 복합 포함한 화장품을 피부에 적용하여, 시험 전후 나타나는 피부의 변화 정도는 어떠한 차이가 있는지를 비교 확인하고자 하였다.
이를 위하여 피부의 노화가 인지되는 연령대부터 내, 외부 환경으로 인해 급격한 피부 노화가 나타나는 연령대인 30세 이상-60세 미만인 건강한 성인 20명을 참여자로 정한 후, 대한민국 보건복지부에서 지정한 공용기관 생명윤리위원회로부터 시험 승인을 받아(승인번호 P01-202301-01-02), 이에 준하는 모집 절차를 거쳐 최종 선정된 참여자를 대상으로 인체적용시험을 4주간 실시하였다.
이때 화장품은 에멀젼으로 제형화 하는 것이 목적하는 효능이 가장 잘 나타난다고 보고한 선행 연구(Tengamnuay et al., 2006)를 참조하여 에멀젼 제형으로 제조하였다. 매일 2회 지정된 시간에 동일한 세안제로 세안한 뒤 시험제품을 각각 약 3 g (4회 펌핑, 2회)을 덧바르는 방법으로 도포하되, 비교 연구 시 보고된 바 있는 안면분할연구(split-face study)를 시행하였다(Ha et al., 2017; Park et al., 2017). 이에 비교군(C군)인 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼은 안면의 코를 중심으로 안면 왼쪽 부위에, 시험군(E군)인 저분자 펩타이드 콤플렉스와 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품은 안면 오른쪽 부위에 펴 바르도록 하였다.
피부 변화를 평가하기 위하여 피부 측정할 때에도 본 연구 기간 동안 사용하였던 동일한 세안제로 세안하고 실내온도 20-25℃의 항온 환경과 상대습도 40-60%의 항습 환경이 마련된 측정실에 입실 후에는 약 30 분간 안정을 취하였다. 정확한 피부 상태를 측정하기 위해 약 1 시간의 측정 시간 동안은 수분 섭취를 제한하였다.
피부 측정은 평가항목에 따라 피부의 각 지정 부위인 이마, 눈가, 볼, 입가를 각각 측정하였으며, 이를 기반으로 해 도출된 각 항목의 피부 전체 평균값을 비교 분석하였다.
2) 평가 항목
본 시험참여자의 피부의 시험 전후의 피부의 변화 양상을 확인하기 위해 ANTERA 3D CS (Ver, 3.0; Miravex Limited, Ireland)를 이용하였으며, 피부장벽의 상태를 평가하기 위하여 Corner meter와 pH meter (SKIN-O-MAT device; Multi skin measurement, COSMOMED, Germany) 및 Vapometer (SWL5890; Delfin Technologies Ltd., Finland)를 이용하였다. 피부 측정 시에는 시험 전 지정하여 측정하였던 부위를 follow up 하여 시험 후에도 측정하였다.
평가 항목으로는 각 부위별 선택 영역에서의 피부의 브라이트닝(brightening) 여부를 확인하기 위하여 피부의 밝기 값(color image lightness average, Color L*)과 피부색 개체 유형 값(individual typology angle, ITA°)을 살폈으며, 피부의 색소 침착지수(pigmentation score) 및 색소 침착 과정에서 손상된 헤모글로빈이 집중되어 나타나는 홍반 농도지수(redness score)를 각각 살펴 피부의 화이트닝(whitening) 효능 여부를 비교 평가하였다.
또한 피부 모공 개선도를 통해 피부 탄력도를 평가하기 위하여 모공으로 인해 함몰된 피부의 총 부피(total pores volume)와 모공의 깊이, 크기 및 밀도의 전체 환산점수인 모공 지수(pores index)를 비교하였으며, 피부 장벽의 개선 여부를 살펴보기 위하여 각 부위별 선택 영역에서 시험 전후 수분 보유량(contents of moisture, CM)과 경피수분증발량(trans epidermal water loss, TEWL), 피부 표면의 pH 및 평균 거칠기(roughness average, Ra)를 각각 비교 평가하였다.
5. 통계 분석방법
본 연구의 수집된 자료는 SPSS WIN program (Ver. 28.0; IBM, USA)을 이용하여 분석하였으며, 비인체 적용시험의 결과는 descriptive statistics를 실시하여 평균(mean) 및 이에 대한 표준편차(standard deviation, SD)를 나타내어 측정치를 평가하였으며 대조군과의 비교는 paired samples t-test를 실시하여 결과를 도출하였다. 또한 인체 적용시험의 비교군과 시험군의 시험 전후 피부 변화를 분석하기 위해 paired samples t-test를 실시하였으며, 비교군과 시험군 간의 시간차에 따른 변화 양상을 비교 분석하기 위하여 two-way repeated measures (RM) ANOVA를 실시하였으며, 통계학적 처리에서는 유의 수준을 p< 0.05 기준으로 하여 검증하였다.
Results and Discussion
1. 세포의 생존 및 활성 효과
저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 화장품의 세포독성을 살펴 피부에 안전한지를 검증하기 위하여 본 시험을 실시하였다.
그 결과, B16F10 cell에서의 시험제품 1000 μg/mL 농도에서 세포 활성율은 시험제품이 도포되지 않은 대조군에 비하여 약 93.48% (p＜0.001)로 유의미하게 나타나, B16F10 cell에서의 저분자 펩타이드 콤플렉스 함유 화장품의 세포독성은 거의 없음을 확인하였다. 게다가 25 μg/mL 농도에서는 약 100.09% (p＜0.05)로 오히려 B16F10 cell의 생육을 활성시킨 것으로 나타났다(Figure 1).
2. 미백 활성 효능
피부가 자외선에 노출이 되면 표피의 각질형성세포(keratinocyte)가 자극되어 멜라닌형성세포 자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)의 합성을 촉진시켜 분비하게 되고, 분비된 호르몬은 멜라닌형성세포(melanocyte)를 활성화시켜 멜라닌 생성반응과정을 통해 멜라닌을 생성하여 피부를 보호하게 된다(Yoon et al., 2013). 이러한 원리를 이용하여 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼이 멜라닌 생성을 얼마나 저해할 수 있는지를 살펴보기 위하여 본 시험을 시행하였다.
그 결과, 멜라닌 생성 억제율(%)로 환산하여 비교하였을 때 대조군에 대한 시험제품 1000 μg/mL 농도에서의 멜라닌 생성 억제율이 약 23.62% (p＜0.001)로 유의미하게 나타났으며, 모든 농도에서도 각각 멜라닌 생성을 유의미하게 억제한 것으로 확인되었다(Figure 2).
이는 현재 상용되는 retinoic acid나 arbutin과 같은 미백 소재들의 한계를 극복하기 위한 접근방법으로 제시되었던 펩타이드가 임상적으로 피부에 안전하며 높은 활성을 가져 미백 효능도 우수하였다는 보고(Shin et al., 2010)와도 유사한 결과이며, 저분자 펩타이드 콤플렉스가 코스메슈티컬 활성 성분으로의 높은 활용성이 검증되었던 바(Han & Kim, 2024), 미백 활성에서도 그 우수성이 입증된 것으로 볼 수 있다.
3. 인체 적용시험에서의 피부 개선 효과
1) 피부의 미백 활성 효능
피부가 자외선에 과다 노출되면 피부 보호기전으로 발현되는 melanin이 과잉 생성되면서 기미나 주근깨를 형성하게 된다(Kim & Ryu, 2012; Yoon et al., 2013). 더욱이 피부가 노화되면 멜라노사이트(melanocyte)가 불규칙적으로 빠르게 증식하고 이로부터 발현된 melanin이 피부 표면으로 이동되면서 색소는 더 진해진다(Yamaguchi et al., 2007; Burger et al., 2016).
하지만 피부에 수분이 충분하게 공급되고 피부의 생리 활성이 원활해지면 피부색은 점차 밝아질 수(brightening) 있으며(Tao et al., 2021), 미백(whitening)에 유효한 원료들을 이용한 식품을 섭취하거나(Burger et al., 2016) 화장품 형태로 피부에 적용하게 되면 색소침착이 되었던 부위가 엷어질 수 있다(Tengamnuay et al., 2006; Nithitanakool et al., 2014; Boo, 2019).
이에 본 시험에서는 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼(C군)과 이 에멀젼에 마이크로스피큘을 복합 포함한 화장품(E군)을 피부에 도포할 경우 피부색을 밝게 해 브라이트닝(brightening)이 되는지와 색소가 침착 되었거나 침착이 진행되고 있는 피부를 개선하여 실제로 화이트닝(whitening)이 되는지를 살펴본 후, 두 그룹을 비교 분석하여 그 차이를 통찰하였다.
(1) 피부의 브라이트닝(brightening) 효능
피부가 노화되거나 색소침착이 일어나면 우선 피부가 칙칙해져 피부 안색(skin lightness)이 어두워진다(Wang et al., 2018). 특히 피부 표면에 수분이 부족하거나 이로 인해 피부 장벽이 손상되었을 경우에도 피부는 칙칙해지며, 그 진행 정도에 따라 Color L*이 감소하고 피부 안색은 더 어두워져(Choi & Oh, 1997; Suk et al., 2013), 피부의 브라이트닝 척도로 Color L*가 상용되고 있다.
또한 피부 측정 기술이 발달하면서 분광광도 측정을 기반으로 나타나는 나타내는 ITA°값으로 피부색 유형을 분류하게 되면서 ITA° 수치가 높을수록 피부색이 더 밝은 것으로 평가할 수 있어, 브라이트닝 효능을 평가할 때 Color L*a*b*과 더불어 ITA°도 그 척도로 사용할 것을 권장하고 있다(Suk et al., 2013; Wang et al., 2018; MFDS, 2020; NMPA, 2021).
따라서 본 시험에서 특정된 C군과 E군을 각각 도포한 후 피부 안색에 영향을 미쳤는지를 파악하기 위하여 Color L*과 ITA°의 변화를 동시에 확인하였으며 더불어 두 그룹의 효능에는 어떠한 차이가 있는지를 비교 분석하였다.
그 결과, 도포 전후 동일하게 선택된 영역에서의 Color L*의 경우, 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 6.69%, E군은 약 19.41% 모두 유의하게 증가한 것으로 나타나(p<0.001), 피부의 브라이트닝 효능이 매우 탁월한 것으로 나타났다(Table 1). 이는 두 그룹 간의 상호작용(time×group)에서 E군이 시간이 지나면서 피부 밝기가 월등하게 더 높아지는 데 유의미한 차이를 보여(F=86.072, p<0.001), E군의 브라이트닝 효능이 C군에 비하여 도포 시간이 길어질수록 훨씬 더 높아지는 것으로 나타났다(Table 2).
ITA°값의 경우, 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 3.99%, E군은 약 25.63% 모두 유의하게 증가한 것으로 나타나(p<0.001), 두 그룹 모두 피부색을 밝게 개선시키는 것으로 나타났다(Table 1). 이는 두 그룹의 상호작용(time×group)에서도 유의미한 차이가 나타나(F=165.502, p<0.001), E군이 시간이 지나면서 피부색을 생리적으로 더 밝게 하는 것으로 나타났다(Table 2).
이로써 C군과 E군 모두 다양한 요인으로 어둡고 칙칙해진 안색을 맑고 밝게 하는 브라이트닝 효능이 월등하며, 특히 활성 성분과 함께 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품인 경우 저분자 펩타이드 콤플렉스의 브라이트닝 효능이 더 탁월하게 나타남을 확인하여, 독자 기술로 정제된 마이크로스피큘의 경피전달시스템으로써의 가능성을 확증할 수 있었다.
(2) 피부의 화이트닝(whitening) 효능
화장품의 미백 측정 지수로 주로 사용되는 색소 침착지수는 선택한 영역에서 나타나는 다양한 수준의 색소(멜라닌)의 침착 농도와 손상 정도를 점수화한 값으로 점수가 낮을수록 피부는 정상에 가까운 것으로 해석을 할 수 있다(Wang et al., 2018). 또한 색소 침착 부위에서 발견되는 멜라닌 농도와 헤모글로빈 손상 정도에 따라 정량으로 관측되는 홍반의 농도는 높은 상관관계가 있음을 보고하며, 홍반 농도의 정도로 과 색소 침착 여부를 평가할 수 있다고 보고하고 있 (Yun et al., 2009). 이렇게 평가할 경우, 헤모글로빈 농도 지수가 낮을수록 멜라닌 양도 비교적 고르게 분포하고, 피부는 더 안정적이며 밝은 것으로 판단할 수 있으므로 본 시험에서 특정된 C군과 E군의 도포 전후 동일하게 선택된 영역에서의 색소 침착지수가 어떻게 변화하는지, 그리고 홍반지수는 어떤 변화가 있는지를 확인하였으며, 두 그룹의 변화량에는 어떠한 차이가 있는지를 비교 분석하였다.
그 결과, 피부의 전체 색소 침착지수의 경우 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 13.10%, E군은 약 41.17% 모두 유의하게 감소한 것으로 나타나(p<0.001), 피부의 화이트닝 효능이 높게 나타났다(Table 1). 이는 두 그룹 간 상호작용(time×group)에서도 역시 유의미한 차이로 감소하여(F=131.582, p<0.001), E군이 도포 시간이 지나면서 색소 침착된 부위를 더 미백시켜 피부를 개선하고 있음을 확증하였다(Table 2).
더욱이 홍반지수를 비교 분석한 결과에서도, 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 15.04%, E군은 36.95% 모두 유의하게 감소한 것으로 나타났으며(p<0.001) (Table 1), 두 그룹의 상호작용(time×group)에서도 E군이 시간이 지나면서 더 낮아져(F=93.206, p<0.001), 도포 시간이 길어질수록 E군의 헤모글로빈 손상 정도가 더 낮아지면서 피부 안색이 더 안정되어 간다는 것을 확증하였다(Table 2).
이는 앞서 시행된 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼의 멜라닌 생성억제능 시험에서 세포 내 멜라닌양이 대조군에 비하여 약 23.62% 감소한 결과를 투영해 해석한다면, 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼과 이 에멀젼에 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품이 피부에 다양한 요인으로 검어 진 색소 부위와, 불규칙하게 분포되었던 피부의 색소들로 인해 검고 얼룩덜룩하게 보이는 부위를 밝고 고른 안색으로 개선하는 데 기여할 수 있음을 입증한 결과로 생각된다.
특히 활성 성분과 함께 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품인 경우 저분자 펩타이드 콤플렉스의 화이트닝 효능이 더 탁월하게 나타남을 확인하여, 독자 기술로 정제된 마이크로스피큘의 경피전달시스템으로써의 가능성을 확증할 수 있었다.
2) 피부 모공(pore) 개선 효능
모공은 피부 표면에서 육안으로 확인이 가능한 털피지샘 단위의 개구부로, 주로 피부 표면의 탄력도에 따라 확장되거나 늘어지게 된다(Lee et al., 2012; Cha et al., 2015). 게다가 피부가 노화되면서 모낭을 지탱하던 결체조직이 느슨해진다거나 단백질이 위축되면 모공으로 인해 함몰되는 부피는 증가하며(Kim et al., 2014; Lee et al., 2016) 모공은 점차 확장되거니와, 이로 인해 안색도 칙칙해 보이고 심하면 주름으로 발전되기도 한다(Jung et al., 2014).
하지만 자극이 되었던 요인이 제거되고 노화된 피부의 요인들이 개선되면 피부에서 가장 먼저 개선되어 보이는 것도 모공이다(Dong et al., 2016). 위축되었던 결체조직이 개선되어 피부에 탄력이 부여되면 모낭을 지탱하는 힘과 모공의 수축력도 회복되며, 이에 따라 피부의 함몰 부피도 감소하게 된다(Lee et al., 2016). 또한 이러한 모공의 변화 정도로 피부의 탄력 개선 정도 예측도 가능하다(Kim et al., 2014).
이에 본 시험에서는 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼(C군)과 이 에멀젼에 마이크로스피큘을 복합 포함한 화장품(E군)을 피부에 도포할 경우, 모공으로 인해 함몰된 피부의 총 부피(total pores volume)와 모공 지수(pore index)가 얼마나 개선되는지를 살펴보고, 두 그룹의 변화량을 비교 분석하여 개선 정도의 차이를 통찰하였다.
그 결과, 도포 전후 피부의 함몰 총 부피의 경우, 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 45.62%, E군은 77.51% 모두 매우 유의하게 감소한 것으로 나타나(p<0.001), C군과 E군 모두 모공의 총 부피를 줄여줄 수 있는 효능이 매우 높은 것으로 나타났다(Table 1). 이는 두 그룹의 상호작용(time×group)에서도 유의미한 차이를 보여(F=13.770, p<0.001), E군이 시간이 지날수록 함몰 부피를 더 감소시킨다는 것을 확증하였다(Table 2).
그리고 모공 지수를 살펴본 결과에서도, 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 38.96%, E군은 74.10% 모두 매우 유의하게 감소한 것으로 나타나(p<0.001), 두 그룹 모두 모공 지수가 눈으로 확인할 정도로 감소하였음을 알 수 있다(Table 1). C군과 E군의 상호작용(time×group)에서도 유의미하게 차이가 나(F=24.336, p<0.001), 시간이 지날수록 E군이 모공 지수를 더 감소시킨다는 것을 확증하였다(Table 2).
이와 같은 결과는 피부 표면에서 측정되는 모공의 깊이, 크기, 밀도를 하나의 매개변수로 점수화한 모공 지수(pores index)가 감소하면 함몰 부피도 감소하고 피부는 탄력을 되찾을 수 있다는 보고(Dong et al., 2016; Messaraa et al., 2018; Ahmed El Attar & Nofal, 2021)를 확증한 결과이며, 저분자 펩타이드 콤플렉스를 함유한 에멀전을 도포한 경우 노화된 피부의 다양한 주름들이 놀랍게 개선되어 피부 탄력 효능을 검증하였던 바(Han & Kim, 2024), 피부의 탄력을 강화하는 것이 얼굴의 모공이 다양한 크기로 확장하거나 모공 지수의 증가를 예방하기 위한 기본 전략이 될 수 있다는 보고(Hameed et al., 2019)를 역설적으로 설명할 수 있는 결과라고 할 것이다.
이로써 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼과 이 에멀젼에 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품을 피부에 도포할 경우, 모공으로 인해 피부 표면이 함몰되고 점차 더 악화하여 주름으로 진행될 수도 있는 모공을 개선하여 피부 자국의 전체 부피가 감소되고 피부 표면의 울퉁불퉁한 볼륨이 개선되는 데 도움이 될 수 있음을 확인하였으며, 다양한 요인으로 피부가 노화되면서 점차 더 악화되는 모공의 깊이, 크기, 밀도가 종합적으로 개선되어 이로 인해 확장되고 늘어진 모공을 회복시키는 데 도움을 줄 수 있음을 확인하였다.
특히 활성 성분과 함께 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품의 경우 이와 같은 모공 개선 효능이 월등히 뛰어남을 확인하여, 독자 기술로 정제된 마이크로스피큘의 경피전달시스템으로써의 가능성을 확증할 수 있었다. 이는 미용적인 측면에서 확장된 모공을 치료하여 개선되는데 큰 기대와 욕구를 가진 현대인들에게는(Lee et al., 2012) 특별한 제안이 될 수 있을 것으로 생각된다.
3) 피부장벽(skin barrier) 개선 효능
건강한 피부의 각질층은 투과장벽기능을 통해 유해 물질의 침투를 방어하는 동시에 필요 물질은 피부 내로 이동시키는 반면 수분이나 전해질 등의 증발은 방지하며, pH를 조절하여 항균장벽기능도 수행하여 외부환경으로부터 인체를 방어한다(Kim & Kang, 2016). 이러한 피부장벽이 손상이 되면 미생물 감염이나 체액의 손실도 동반되기 때문에 결국 피부 항상성도 무너지게 된다(Hong et al., 2009).
피부는 장벽이 손상되면 즉각적 복구 기전으로 TEWL을 증가시켜 여러 단계의 회복 과정을 통해 피부장벽을 회복시키게 되며, 장벽 회복 후에는 TEWL은 정상으로 회복된다(Shin et al., 2000). 이러한 TEWL의 증감은 각질층의 두께와 상관 관계를 나타내며 피부장벽 기능에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 보고되면서(Park, 2008), 피부장벽 강화에 보습 및 TEWL 개선을 적용하는 연구가 지속적으로 이루어지고 있다(Cha & Kim, 2008). 따라서 화장품을 도포한 뒤 피부 표면에 얼마나 수분을 부여하는가(CM)와 외부로 소실되는 수분을 얼마나 차단할 수 있는가(TEWL)를 살펴보는 것으로 피부장벽 기능의 개선 여부를 검증할 수 있다고 하였다(Park, 2018).
이와 더불어 피부의 항상성을 유지하여 각질층을 보전할 뿐 아니라, 손상된 피부장벽을 복구하는 데에는 각질층의 산성 pH가 매우 중요한 역할을 한다(Shin et al., 2000). 이는 다양한 피부유형의 피험자들을 분석한 결과, 정상피부의 pH가 4.7에 가까웠음을 보고한 연구(Wiechers & Solutions, 2008)로도 설명이 되며, 피부 표면의 pH가 5 가까운 환경에서 피부 방어기능이 높은 활성을 보이고(Kim & Lee, 2008), pH가 5 미만일 때 미생물 군집이 확립될 뿐 아니라(Lambers et al., 2006), 천연보습인자(natural moisturizing factor, NMF) 함량이 피부 표면 pH와 음의 상관관계를 가지며 pH가 낮은 피부가 피부장벽기능은 더 우수하고 수분 흡수력도 더 높은 것으로 보고한(Li et al., 2023) 연구들로 방증할 수 있다.
이에 따라 피부장벽 복구 또는 개선 정도를 평가할 때 시험 전후의 각질층의 수분 보유량(contents of moisture, CM), TEWL과 pH의 변화 정도가 그 기준이 된다(So et al., 2015).
이에 본 시험에서는 시험 전후 CM과 TEWL의 변화를 살펴보고 이와 더불어 pH의 변화, 그리고 피부장벽이 손상되는 동시에 거칠어지는 피부 표면의 평균 거칠기(rough average, Ra)의 변화 등을 비교 분석하여, 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼(C군)과 이 에멀젼에 마이크로스피큘을 복합 포함한 화장품(E군)을 피부에 도포할 경우, 이미 손상된 피부장벽을 복구하거나 피부장벽의 기능을 개선하는지를 살펴보았으며, 두 그룹의 변화량을 비교 분석하여 변화 정도의 차이를 통찰하였다.
그 결과, CM의 경우에는 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 13.85%, E군은 약 22.19%로 모두 유의하게 증가한 것으로 나타나(p<0.001), 두 그룹 모두 피부 표면의 수분 보유량을 매우 높은 수준으로 증가시킨 것으로 나타났다(Table 1). 이는 두 그룹의 상호작용(time×group)에서도 E군이 도포 기간이 길어질수록 C군에 비하여 CM을 월등하게 증가시키는 것으로 나타났다(F=156.940, p<0.001) (Table 3).
TEWL의 경우, 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 37.16%, E군은 약 55.79%로 모두 유의하게 감소한 것으로 나타나(p<0.001), 두 그룹 모두 TEWL을 효과적으로 감소시킨 것으로 나타났다(Table 1). 이는 두 그룹의 상호작용(time×group)에서도 E군이 도포 기간이 길어질수록 C군에 비하여 TEWL을 월등하게 감소시키는 것으로 나타났다(F=44.521, p<0.001) (Table 3).
이는 pH 변화에서도, 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 6.41%, E군은 약 11.78%로 모두 유의하게 감소한 것으로 나타났으며 (p<0.001), 이는 두 그룹 모두 피부장벽을 강화하고 피부를 더 윤택할 수 있는 조건의 pH환경인 pH 5.0-4.7에 각각 가까워져 피부 항상성을 유지할 수 있게 하는 데 매우 탁월한 효능이 있는 것으로 나타났 (Table 1). 두 그룹의 상호작용(time×group)에서는 E군이 도포 기간 이 길어질수록 C군에 비하여 피부의 pH가 정상피부인 4.7의 산성환경에 더 가까워진 것이 유의미한 결과로 나타나(F=16.304, p<0.001), E군의 높은 활성도를 확인할 수 있었다(Table 3).
더불어 실제로 피부 표면의 보습도, TEWL, 그리고 pH 수준이 균형을 이루어 피부장벽 기능 장애에 반추 되어 나타나는 피부 표면의 평균 거칠기의 경우에서도 두 그룹 모두 도포 전에 비하여 C군은 약 10.41, E군은 약 35.890로 모두 유의하게 감소한 것으로 나타나(p<0.001), 두 그룹 모두 피부 거칠기를 효과적으로 감소시켜 피부를 유연하게 한 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 또한 C군과 E군 간의 상호작용(time×group)에서도 유의미한 결과를 보여(F=51.343, p<0.001), 도포 기간이 길어질수록 C군에 비하여 E군이 피부를 유연하고 매끄럽게 하여 피부를 더 윤택하게 한 것으로 나타났다(Table 3).
이와 같은 결과로, 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼과 이 에멀젼에 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품을 도포하면서 CM은 증가하고 TEWL은 감소하였으며, 높아지던 피부표면의 pH도 효과적으로 낮아지는 것을 확인할 수 있었으며, 더불어 피부 표면도 윤기 있고 매끄럽게 한 것을 확인할 수 있었다.
이는 피부장벽이 정상화되면 정상적인 산성 pH를 유지하게 되며(Proksch, 2018), 특히 피부장벽이 손상된 노화피부에 피부 친화적 물질을 도포할 경우 피부장벽 회복에 도움이 되는 것으로 보고한 연구(Shin et al., 2000)를 방증한 결과라고 사료된다. 또한 이는 노화 피부의 피부 장벽을 회복을 위한 방법을 제시한 보고(Park & Choi, 2010)에도 상응하는 결과이기도 하다. 게다가 피부장벽 기능이 강화되면 육안으로 나타나는 피부는 각질층의 두께와 밀도가 정상적으로 안정이 되어 피부가 매끄럽고 윤기가 남을 수 있다고 보고한 연구를(Kim et al., 2010; Ryu et al., 2015) 검증하였을 뿐 아니라, 마이크로스피큘을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품을 도포한 경우 더 역동적으로 피부장벽 기능을 개선할 수 있음이 입증되어, 독자 기술로 정제된 마이크로스피큘의 경피전달시스템으로써의 가능성을 확증할 수 있었다.
Conclusion
본 연구에서는 저분자 펩타이드 콤플렉스(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM; Vonestis)을 포함한 에멀젼이 멜라닌 생성을 얼마나 저해할 수 있는지를 살펴, 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는지를 확인하기 위하여 멜라닌 생성 억제 능 시험을 비인체 적용시험(in vitro test)을 통하여 실시하였다.
더불어 이러한 시험 결과가 실제로 피부에도 적용되어 다양한 피부 노화현상을 개선하는지를 검증하고자 인체 적용시험(in vivo test)을 4주간 시행하였으며, 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼을 비교군(C군)으로, 이 에멀젼에 독자 기술로 정제한 파우더형 마이크로스피큘(1989 PI-TOSOME spicule, Vonestis)을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품을 시험군(E군)으로 하여 각각 피부에 적용한 후 두 화장품의 피부 개선 정도를 비교 분석하였다. 결과는 다음과 같다.
1. Melanoma cell에서의 세포 활성 및 미백 효능
본 시험제품인 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀전을 멜라닌을 생성하는 melanoma 세포에서 도포한 후의 세포 생존율이 93% 이상으로 나타나, 세포독성은 거의 없어 피부에 안전한 것으로 확인되었으며, 시험제품을 도포한 후 자외선에 조사되었을 때 멜라닌 생성 억제율이 약 23.62%로 유의미하게 매우 높게 나타났다.
2. 인체 적용시험에서의 미백 활성 효능
브라이트닝(brightening) 효능에서 Color L*과 ITA°의 지수가 C군, E군 모두 유의미하게 증가하였으며, 특히 두 그룹의 상호작용(시간차 변화량 비교)에서는 Color L*과 ITA°에서 모두 월등한 차이로 E군이 C군에 비하여 브라이트닝 효능이 유의미하게 더 높은 것으로 나타났다.
화이트닝(whitening) 효능에서도 pigmentation score 및 pigmentation variation, redness score 및 redness variation의 지수가 C군, E군 모두 유의미하게 감소하였으며, 특히 두 그룹의 상호작용(시간 차 변화량 비교)에서는 모든 항목에서 E군이 C군에 비하여 유의미하게 월등한 차이를 보이면서 화이트닝 효능이 더 높은 것으로 나타났다.
3. 피부의 모공 개선 효능
모공으로 인한 피부의 함몰 총 부피(total pores volume)와 모공 지수(pores index)에서 C군, E군 모두 유의미하게 감소하였다. 특히 두 그룹의 상호작용(시간 차 변화량 비교)에서는 각 비교항목 모두 E군이 C군에 비하여 모공 개선 효능이 유의미하게 더 높은 것으로 나타났다.
4. 피부장벽 개선 효능
피부 표면의 수분 보유량인 CM에서 C군, E군 모두 매우 유의미하게 증가하였으며, TEWL, pH, 그리고 피부 거칠기인 Ra에서 C군, E군 모두 유의미하게 감소하였다. 특히 두 그룹의 상호작용(시간 차 변화량 비교)에서는 CM, TEWL, pH, Ra에서 모두 E군이 C군에 비하여 유의미하게 월등한 차이를 보이면서 피부장벽을 더 효과적으로 개선한 것으로 나타났다.
이와 같은 결과로 저분자 펩타이드 콤플렉스(PI THERAPY Ultimate Peptide Complex-PRTM; Vonestis)을 포함한 에멀젼은 세포 활성율이 우수하여 피부에 매우 안전하며, 에멀젼을 적용하지 않은 대조군에 비하여 멜라닌 생성 억제율이 농도 의존적으로 더 높은 것으로 확인되었다. 이는 저분자 펩타이드 콤플렉스의 경우 항산화, 항 노화 및 항주름 등의 코스메슈티컬의 활성 성분으로서 피부에 우수한 효능을 검증하였던 바(Han & Kim, 2024), 미백 활성 효능에서도 그 우수성이 입증된 결과로 볼 수 있다.
더불어 저분자 펩타이드 콤플렉스를 포함한 에멀젼과 이 에멀젼에 독자 기술로 정제한 파우더형 마이크로스피큘(1989 PI-TOSOME spicule, Vonestis)을 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품을 4주간 인체 피부에 적용한 뒤에는 피부의 브라이트닝 및 화이트닝 효능이 비인체 적용시험에서 확인된 미백 효능 강도보다 더 극적으로 호전되었을 뿐 아니라, 피부의 모공을 개선하고 피부장벽 기능을 강화함은 물론 손상된 장벽을 복구하는 효능이 매우 높은 것을 확인하였다.
또한 시험 전후 나타난 두 화장품에 대한 효능의 차이를 비교한 결과, 최근 경피전달시스템으로 집중되고 있는 마이크로스피큘을 활성 성분과 함께 복합 포함한 마이크로스피큘 화장품을 도포한 경우, 저분자 펩타이드 콤플렉스만 포함한 에멀젼에 비하여 모든 항목에서 월등한 차이를 보이며 더 우수한 효능을 나타내었음을 확인하여, 독자 기술로 정제된 마이크로스피큘이 경피전달시스템으로써의 효능이 매우 우수함을 검증하였다.
다만, 인체적용 시험의 범위에 있어 다양한 제조 공정과 다른 입자와 크기 등으로 제시되고 있는 타 스피큘 화장품이나 경피전달시스템으로 제시되는 다른 소재를 적용한 화장품을 동시에 비교하지 못한 한계는 있었다.
이처럼 저분자 펩타이드 콤플렉스가 함유된 화장품을 피부에 적용하였을 때 매우 우수한 미백 효능, 모공 개선 효능, 피부장벽 강화 및 복구 효능 등이 나타나, 코스메슈티컬의 활성 소재로서 저분자 펩타이드 콤플렉스의 사용성을 재 검증하였으며, 이 에멀젼에 마이크로스피큘을 복합 포함한 화장품의 우월한 효능 차이를 확인한 바, 독자 기술로 정제한 파우더형 마이크로스피큘(1989 PITOSOME spicule, Vonestis)이 저분자 펩타이드 콤플렉스의 경피 흡수(percutaneous absorption)를 촉진하여, 피부에는 안전하며 그 효능은 안정적으로 잘 나타났음을 입증하였다.
따라서, 스피큘을 경피전달 제제로 응용할 경우, 생리활성물질의 경피 흡수를 촉진함은 물론 피부에 절대적 안전성을 보장하기 위한 스피큘의 정제 기술, 그리고 그에 따른 화장품의 함량 비율 등을 확립하는데 있어 본 연구가 기준이 될 수 있을 것으로 보인다.
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