페퍼민트 추출물의 다기능적 피부 장벽 강화: 각질세포 분화, 타이트 정션 무결성, 항스트레스 및 대식세포 항염 효과
요약
목적
본 연구는 페퍼민트 추출물(Mentha piperita extract, MPE)의 피부 장벽 강화 효능을 평가하고, 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 검토하고자 하였다.
방법
MPE는 페퍼민트 잎을 70% 에탄올로 추출하여 제조하였다. 피부 장벽 기능은 인간 각질세포(HaCaT)에서 분화 관련 유전자 발현과 cornified envelope (CE) 형성 분석을 통해 평가하였다. Tight junction (TJ) 완전성은 관련 유전자 발현과 단백질 국소화를 통해 확인하였다. 장벽 항상성은 RAW 264.7 면역세포에서 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 유도된 prostaglandin E2 (PGE2) 발현 억제를 측정하였으며, 스트레스 조건에서는 HaCaT 세포에서 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11β-HSD1)억제와 코르티솔에 의해 지연된 상처 회복 개선 여부를 통해 평가하였다.
결과
MPE는 HaCaT 세포에서 involucrin (IVL), keratin 10 (KRT10), transglutaminase 1 (TGM1), filaggrin (FLG), caspase 14 (CASP14), calpain 1 (CAPN1) 각질세포 분화 관련 유전자의 발현을 증가시켰으며, CE 형성을 농도 의존적으로 유의하게 촉진하였다. 또한 claudin3 (CLDN3), claudin4 (CLDN4), claudin7 (CLDN7), occludin (OCLN), zonula occludens-1 (ZO-1)의 TJ 관련 유전자의 발현을 증가시켰으며, CLDN4와 OCLN 단백질의 세포 간 접합 부위 발현을 강화하였다. RAW 264.7 세포에서는 LPS로 유도된 PGE2 생성을 유의하게 억제하였고, HaCaT 세포에서는 11β-HSD1 활성을 억제하며 코르티솔에 의해 지연된 상처 회복을 촉진하였다.
결론
이상의 결과는 MPE가 각질세포 분화 촉진, 세포 간 접합 강화, 항염증 활성, 항스트레스 효과를 통해 피부 장벽을 강화하는 다기능성 화장품 원료로 활용될 수 있음을 시사한다.
핵심용어: 페퍼민트, 피부 장벽, 조밀 연결, 항염증, 항스트레
Abstract
Purpose
This study evaluated the bioactivity of Mentha piperita extract (MPE) to determine its potential as a skin barrier-enhancing ingredient and assess its applicability as a functional cosmetic material.
Methods
MPE was prepared by extracting M. piperita leaves with 70% ethanol. Barrier function was assessed by analyzing keratinocyte differentiation-related gene expression and cornified envelope formation in human keratinocytes. Tight junction (TJ) integrity was analyzed by evaluating the expression of genes related to TJ and their protein localization. Barrier homeostasis was assessed by measuring lipopolysaccharide (LPS)-induced prostaglandin E2 (PGE2) production in immune cells and by determining 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11β-HSD1) inhibition as well as the recovery of cortisol-delayed wound healing in keratinocytes under stress conditions.
Results
MPE increased the expression of keratinocyte differentiation–related genes, including involucrin (IVL), keratin 10 (KRT10), transglutaminase 1 (TGM1), filaggrin (FLG), caspase 14 (CASP14), and calpain 1 (CAPN1) and strongly promoted cornified envelope formation in a dose-dependent manner in HaCaT cells. The expression of TJ–related genes, such as claudin3 (CLDN3), claudin4 (CLDN4), claudin7 (CLDN7), occludin (OCLN), and zonula occludens-1 (ZO-1), was also elevated, with proteins CLDN4 and OCLN being upregulated at cell–cell junctions. In RAW 264.7 macrophages, MPE significantly reduced LPS-induced PGE2 production. Additionally, MPE suppressed 11β-HSD1 activity and improved wound closure delayed by cortisol treatment in HaCaT cells.
Conclusion
These findings suggest that MPE is a potential multifunctional cosmetic ingredient that strengthens the skin barrier by promoting keratinocyte differentiation, enhancing TJ cohesion, reducing inflammation, and protecting against stress-induced damage.
Keywords: Mentha piperita, Skin barrier, Tight junction, Anti-inflammatory effects, Anti-stress effects
中文摘要
目的
本研究旨在评估薄荷提取物(MPE)的生物活性，以确定其作为皮肤屏障增强成分的潜力，并评估其作为功能性化妆品原料的应用前景。
方法
采用70%乙醇提取薄荷叶制备MPE。通过分析人角质形成细胞中角质形成细胞分化相关基因的表达和角质层包膜的形成来评估屏障功能。通过评估紧密连接(TJ)相关基因的表达及其蛋白定位来分析紧密连接完整性。通过测量免疫细胞中脂多糖(LPS)诱导的前列腺素E2 (PGE2）生成、测定11β-羟类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)抑制情况以及在应激条件下皮质醇延迟的角质形成细胞伤口愈合恢复情况来评估屏障稳态。
结果
MPE可增加HaCaT细胞中角质形成细胞分化相关基因的表达，包括包膜蛋白(IVL)、角蛋白10(KRT10)、转谷氨酰胺酶1(TGM1)、丝聚蛋白(FLG)、半胱天冬酶14(CASP14)和钙蛋白酶1(CAPN1)，并以剂量依赖的方式显著促进角质包膜的形成。紧密连接相关基因的表达，如claudin3 (CLDN3)、claudin4 (CLDN4)、 claudin7 (CLDN7)、occludin (OCLN)和zonula occludens-1 (ZO-1)的表达也升高，其中CLDN4和OCLN蛋白在细胞间连接处表达上调。在RAW 264.7巨噬细胞中，MPE显著降低了LPS诱导的PGE2生成。此外，MPE抑制了11β-HSD1活性，改善了HaCaT细胞中皮质醇治疗延迟引起的伤口愈合。
结论
这些研究结果表明，MPE是一种潜在的多功能化妆品成分，它通过促进角质形成细胞分化、增强紧密连接凝聚力、减少炎症和防止应激引起的损伤来增强皮肤屏障。
关键词: 薄荷, 皮肤屏障, 紧密连接, 抗炎作用, 抗应激作用
Introduction
피부의 가장 바깥층인 표피에서 각질세포(keratinocyte)의 분화는 장벽 형성의 핵심 과정으로, 외부 환경으로부터 신체를 보호하고 수분 손실을 방지하는 데 필수적이다( Bouwstra et al., 2023; Kim et al., 2010; Oh & Jang, 2015; Rajkumar et al., 2023). 각질세포는 기저층에서 시작하여 유극층, 과립층, 각질층의 네 구획을 거쳐 최종적으로 분화된 corneocyte로 위치하며, 내부에 cornified envelope (CE)을 형성한다( Akiyama, 2017). CE는 filaggrin (FLG), involucrin (IVL), loricrin (LOR), keratin (KRT) 등 여러 구조 단백질이 transglutaminase 1 (TGM1)에 의해 교차 결합하여 형성되며, 외부의 지질 envelope (주로 세라마이드)와 함께 장벽의 기계적 견고성과 수분 차단성을 부여한다. 또한, 과립층(stratum granulosum)에는 tight junction (TJ)이 존재하여 세포 간 공간을 밀폐하고 이온, 용질, 수분 이동을 제한하며, 선택적 투과성 및 조직 극성(polarity) 유지에 기여한다( Akiyama, 2017; Bergmann et al., 2020; Citi et al., 2024). TJ은 각질층이 불완전하거나 손상된 경우 보조적 장벽 역할을 하며, 피부 투과장벽(barrier integrity) 유지, 수분 조절, 병원균 침입 방어에 중요한 기능을 수행한다. 이 구조는 표피 상부 과립층에 위치하며 claudin (CLDN), occludin (OCLN), zonula occludens-1 (ZO-1) 등 단백질로 구성되어 인접한 세포를 밀폐시켜 물질의 투과와 확산을 선택적으로 제한한다( Baek et al., 2013; Brandner et al., 2002; Tokumasu et al., 2016). 한편, 심리적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축을 활성화시켜 코르티솔(cortisol) 분비를 증가시키고, 이는 상처 치유 지연 및 각질세포 분화 억제를 유도하여 피부 장벽 기능을 더욱 악화시킨다( Altemus et al., 2001; Choe et al., 2018; Maarouf et al., 2019). 코르티솔 활성을 조절하는 것은 생리적 또는 스트레스 유도 조건에서 피부 장벽 항상성을 회복시키는 중요한 전략이 된다. 피부 내 코르티솔의 활성은 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11β-HSD1)에 의해 조절된다. 이 효소는 비활성형 코르티손(cortisone)을 활성형 코르티솔(cortisol)로 전환시키며, 정상 수준에서는 스트레스 대응에 필요하지만 과도하게 활성화되면 피부 장벽 기능 저하 및 상처 치유 지연과 같은 부정적 영향을 초래한다( Choe et al., 2018; Lee et al., 2020; Nam et al., 2016; Tiganescu et al., 2013).
Mentha piperita는 꿀풀과( Lamiaceae)에 속하는 다년생 식물로 전 세계에 널리 분포하며, 전통 의약과 화장품 분야에서 오랫동안 활용되어 왔다. 이 식물의 대표적 활성 성분인 멘톨(menthol)은 청량감과 진정 효과뿐 아니라 항염, 항균, 항가려움 효능으로 잘 알려져 있다. 또한 멘톤(menthone), 로즈마린산(rosmarinic acid), 루테올린(luteolin)과 같은 플라보노이드 및 폴리페놀 성분을 비롯한 다양한 대사산물이 함유되어 있으며, 항산화, 항염증, 항미생물 활성이 보고된 바 있다( Tafrihi et al., 2021; Zhao et al., 2022). 이전 연구에서는 Mentha piperita extract (MPE)가 keratinocyte에서 FLG과 IVL 유전자 발현을 증가시켜 각질세포 분화를 촉진할 수 있음이 제시되었다( Han et al., 2021). 그러나 MPE가 피부 장벽 기능을 조절하는 구체적인 기전은 아직 충분히 규명되지 않았으며, 특히 CE 형성 촉진이나 TJ 단백질 발현 증가와 관련된 연구는 부족하다. 또한, MPE가 코르티솔과 같은 스트레스 호르몬에 의해 유도된 피부 손상을 완화할 수 있는지에 대해서도 명확히 밝혀지지 않았다. 이러한 연구적 공백은 MPE의 피부 장벽 조절 효능, 특히 염증 및 스트레스 조건에서의 장벽 회복 가능성을 규명하는 연구의 필요성을 시사한다.
본 연구에서는 MPE가 HaCaT 세포에서 각질세포 분화, CE 형성 및 TJ 단백질 발현에 미치는 영향을 평가하였으며, 동시에 대식세포에서의 항염증 활성을 확인하고, 코르티솔에 의해 유도된 피부 기능 저해 모델에서의 보호 효과를 검증함으로써, 피부 장벽 강화용 다기능성 화장품 소재로서의 가능성을 평가하고자 하였다.
Methods
1. MPE 준비
본 실험에 사용한 MPE는 페퍼민트 잎(우중영농조합법인, Korea)을 35℃에서 16시간 이상 건조시킨 후 분쇄하였다. 건조된 페퍼민트 잎 100 g을 70% ethanol (1 L)로 75℃, 3시간 동안 추출하였다. 추출 후 5 µm charcoal filter로 필터 후 감압 농축하여 MPE를 제조하고 실험에 사용하였다.
2. 세포주 및 세포배양
본 실험에서는 인간 각질세포주 HaCaT 세포(남성 기원) (CLS, Germany)와 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포(BALB/c 마우스, 암컷 기원) (KCLB, Korea)를 사용하였다. 모든 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA) 및 1% penicillin-streptomycin (P/S; Invitrogen, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Welgene, Korea) 이용하여 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었다.
3. 세포 독성 평가
HaCaT 와 RAW 264.7 세포에 대한 MPE의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 세포가 약 80% 정도 증식하였을 때, 1% FBS가 포함된 DMEM 배지에 희석한 MPE를 처리하였다. 24시간 후 MTT 용액(1 mg/mL)을 1시간 처리한 뒤, 반응 용액을 제거하고 생성된 formazan crystal을 DMSO에 용해하였다. 이후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(Epoch; Bio-Tek Instruments; USA).
4. 세포 형태 관찰
HaCaT 세포의 형태학적 변화를 확인하기 위해 위상차 현미경 (IX71; Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 이미지는 20× 대물렌즈와 0.63× 카메라 어댑터를 사용하여 촬영하였으며, 유효 총 배율은 약 12.6× 였다.
5. 분화 관련 유전자 발현 분석
총 RNA는 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Takara Bio, Japan)을 이용하여 추출하였다. 이후 1 µg의 total RNA를 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, USA)로 역전사하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)은 CronoSTAR TM 96 Real-Time PCR System (Takara Bio)을 이용하여 수행하였다. 실험에 사용된 primer 서열은 Table 1에 제시하였다.
6. TJ 단백질 발현 분석
세포는 3.8%로 희석한 formaldehyde solution (Sigma-Aldrich, USA)으로 상온에서 15 min간 고정하였다. 고정 후 PBST (PBS+0.2% Triton X-100)를 상온에서 10 min간 처리하여 세포 투과를 유도하였다. 1차 항체 처리 전, 비특이적 결합을 차단하기 위해 2% BSA 용액을 상온에서 1시간 처리하였다. 이후 1차 항체인 1:200 CLDN4 (ab53156; Abcam, UK), 1:500 ZO-1 (339100; Invitrogen), 1:100 OCLN (331500; Invitrogen)을 각 희석 배수에 맞게 처리하고 4℃에서 16시간 이상 반응시켰다. 반응 후 PBS로 10 min씩 3회 세척하였다. 그 다음, 암실 조건에서 2차 항체 1:1000 Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 (ab150077; Abcam, UK), 1:1000 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Alexa FluorTM 488 (A-11001; Invitrogen)를 처리하였다. PBS로 10 min씩 3회 세척한 뒤 Hoechst (Invitrogen)를 이용하여 핵에 염색하였다. 형광 이미지는 Laser confocal 현미경(K1-Fluo, NANOSCOPE SYSTEMS, Korea)을 이용하여 100× 배율에서 획득하였다.
7. CE 형성 평가
HaCaT 세포 내 CE 함량은 기존 방법을 일부 변형하여 정량하였다( Hasegawa et al., 2011). HaCaT 세포를 1% FBS가 포함된 DMEM 배지에 희석한 MPE와 함께 90%까지 confluency에 도달할 때까지 6일간 처리하였다. 이후 세포를 회수하여 2% sodium dodecyl sulfate (SDS, Sigma-Aldrich)로 균질화하였다. 단백질 함량은 Pierce TM BCA Protein Assay Kit (BCA; Thermo, USA)로 측정하였다. 이어서 12,000×g에서 15 min간 원심분리 후, 침전물을 2% SDS와 20 mM dithiothreitol (DTT, Thermo)이 포함된 용액으로 1시간 동안 가열하였다. 교차결합된 CE 함량은 310 nm에서의 흡광도로 측정하였으며, 최종 결과는 단백질 농도로 정규화하였다.
8. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성량 평가
PGE2 생성량은 세포 배양 상등액을 이용하여 ELISA로 측정하였다. RAW 264.7 세포를 24-well plate에 접종하여 24시간 배양한 뒤, 1% FBS가 포함된 DMEM에 희석한 MPE를 지시된 농도에서 1시간 전처리하였다. 이후 염증 반응을 유도하기 위해 lipopolysaccharide (LPS; Sigma-Aldrich, USA) 100 ng/mL를 첨가하여 24시간 동안 처리하였다. 배양액 상등액을 회수하여 Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit (R&D Systems, USA)를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 통해 PGE2 생성량을 정량하였다.
9. 11β-HSD1 활성 평가
11β-HSD1 프로모터 하에서 발현되는 gaussia luciferase (GL) 발현 수준을 통해 11β-HSD1 활성을 확인하였다. 11β-HSD1 프로모터-GL 벡터가 도입된 HaCaT 세포를 24-well plate에 접종하여 24시간 배양한 뒤, 1% FBS가 포함된 DMEM에 희석한 MPE를 지시된 농도에서 1시간 처리하였다. 이후 1 µM cortisone (Sigma-Aldrich)을 처리하고 16시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양액 상등액은 Gaussia Flash Assay Kit (Thermo)로 반응시킨 후 luminometer (Infinite® 200 PRO; TECAN, Switzerland)를 이용해 발광을 측정하였다. BVT.2733 (Sigma-Aldrich)은 양성 대조군으로 사용하였다.
10. 상처 치유 효능 평가
HaCaT 세포가 100% confluency에 도달했을 때, 멸균된 tip을 이용하여 인위적인 상처를 유도하였다. 이후 배지를 1% FBS가 포함된 DMEM으로 교체하였으며, 이때 1 µM cortisol과 MPE를 지정된 농도에서 함께 처리하였다. 배지 교체 직후 상처 부위를 촬영하여 기준점(T0)으로 설정하고, 16시간 후 동일 부위를 재촬영하였다(T16). 획득된 이미지는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. Find Edges 기능으로 상처 영역을 구분한 후 wand tool을 사용하여 상처 면적을 측정하였다. 상처 회복률은 아래 수식으로 계산하였다.
Relative wound healing (%)=(T0-T16)/T0 x 100
11. 통계 분석
모든 데이터는 세 번의 독립적 반복 실험을 수행하여 얻은 평균±표준편차 (mean±standard deviation, M±SD)로 제시하였다. 그룹 간 통계적 유의성은 Student’s t-test를 통해 그룹 간 통계적 유의성을 분석하였으며, *p<0.05를 유의 수준으로 간주하였다.
Results and Discussion
1. HaCaT 각질세포와 RAW 264.7 대식세포에서 MPE의 세포 독성 평가
MPE의 비독성 농도 범위를 확인하기 위해 HaCaT 각질세포와 RAW 264.7 대식세포를 대상으로 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 200 ppm까지는 유의한 세포 독성이 나타나지 않아 해당 농도 범위에서 안전하게 사용할 수 있음을 확인하였다( Figure 1A, B). 이후의 모든 실험은 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 농도에서 수행하였다.
2. MPE에 의한 각질세포 분화 및 CE 형성 촉진
MPE가 각질세포 분화에 미치는 영향을 평가하기 위해 HaCaT 세포에 10, 50, 100, 200 ppm 농도로 처리한 뒤, 주요 분화 관련 유전자의 발현을 qPCR로 분석하였다. 그 결과, IVL, KRT10, TGM1, FLG, CASP14, CAPN1의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 증가하였으며, 200 ppm 처리군에서는 TGM1을 제외한 모든 유전자가 통계적으로 유의하게 증가하였다( Figure 2A). 또한 위상차 현미경 관찰 결과, MPE를 처리한 세포는 대조군의 뚜렷한 다각형 형태와 달리 세포 간 경계가 흐려지고 불규칙한 형태를 보여, 각질세포 분화와 일치하는 형태학적 변화를 나타냈다( Figure 2B). 더불어, 각질세포 분화의 최종 지표인 CE 형성을 분석한 결과, MPE 처리군에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 최고 농도인 200 ppm에서 약 2.75배 증가하였다( Figure 2C). 이러한 결과는 MPE가 각질세포 분화를 촉진하고 최종적인 장벽 형성을 강화함을 시사한다.
3. MPE에 의한 TJ 관련 인자 발현 증가 및 단백질 국소화 촉진
MPE가 TJ에 미치는 영향을 확인하기 위해 CLDN3, CLDN4, CLDN7, ZO-1, OCLN 유전자의 발현을 qPCR로 분석하였다. 그 결과, 이들 유전자의 mRNA 발현은 농도 의존적으로 증가하였으며, 200 ppm 처리군에서 CLDN3과 CLDN7은 약 3.5배, CLDN4는 약 2.3배, ZO-1은 약 1.8배 증가하여 통계적으로 유의한 변화를 보였다( Figure 3A). 또한 면역형광염색을 통해 CLDN4, ZO-1, OCLN 단백질의 발현 및 세포 내 분포를 분석한 결과, CLDN4와 OCLN은 MPE 처리 시 세포 간 접합 부위에 뚜렷하게 국소화되었으나, ZO-1은 대조군과 비교하여 뚜렷한 차이를 보이지 않았다( Figure 3B). 이는 MPE가 특정 TJ 단백질(CLDN4, OCLN)의 발현과 세포 간 접합 부위 국소화를 촉진함을 보여주며, ZO-1의 경우 mRNA 증가에도 불구하고 단백질 수준에서 뚜렷한 변화가 관찰되지 않아, mRNA 발현 증가는 단백질 변화와 반드시 일치하지 않을 수 있음을 시사한다.
4. MPE의 LPS 유도 PGE 2 생성 억제 효과
피부 염증 억제는 장벽 항상성 유지에 핵심적인 역할을 하므로, 항염증 활성을 가지는 물질은 피부 장벽 강화 원료로 활용될 수 있다. 페퍼민트 역시 항염증 효과가 보고되어 있으며, 대식세포 실험에서 NO, TNF-α, PGE 2 등 다양한 염증 매개물질의 억제 효능이 알려져 있다( Li et al., 2017; Sun et al., 2014). 이전 보고를 재확인하기 위해 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 PGE 2 생성 억제 효과를 평가하였다. 그 결과, MPE 처리군에서 PGE 2 생성이 농도 의존적으로 유의하게 감소하였으며, 이는 이전 보고와 일치하는 결과였다( Figure 4).
5. MPE에 의한 11β-HSD1 promoter 활성 억제와 코르티솔로 지연된 상처 회복의 개선
MPE가 코르티솔 활성 조절에 대한 영향을 확인하기 위해, 11β-HSD1 promoter에 의해 발현되는 luciferase 활성을 측정하였다. 그 결과, 코르티손(1 µM)에 의해 유도된 11β-HSD1 promoter 활성은 MPE 처리 시 농도 의존적으로 유의하게 감소하였고, 최고농도인 200 ppm에서는 약 2.5배 감소를 보였다( Figure 5A). 또한, scratch wound healing assay를 통해 MPE가 코르티솔로 인해 지연된 상처 회복에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과, 코르티솔 단독 처리군에 비해 MPE 병용 처리군에서 상처 회복률이 농도 의존적으로 증가하였으며, 최고 농도에서는 약 30%의 회복 촉진 효과가 나타났다( Figure 5B). 이러한 결과는 MPE가 11β-HSD1 활성을 억제함으로써 과도한 코르티솔에 의한 피부 장벽 손상과 상처 치유 지연을 완화하고, 심리적 스트레스 조건에서 피부 장벽을 보호할 수 있는 잠재적 원료임을 시사한다.
Conclusion
피부 장벽은 각질세포의 terminal differentiation을 통해 구조적·기능적 완전성을 확보하고, 세포 간 접합 구조의 치밀성을 통해 선택적 투과성과 보조적 장벽기능을 수행한다. 외부 자극에 의한 염증 반응과 심리적 스트레스는 피부 장벽을 손상시키는 주요 요인이며, 이에 대한 보호는 장벽 항상성 유지에 필수적이다. 따라서 피부 장벽 강화 전략은 다각적인 측면에서 고려되어야 한다.
본 연구에서 MPE는 각질세포 분화와 CE 형성을 촉진하여 피부 장벽의 구조적·기능적 완전성을 강화하였으며, TJ 관련 인자의 발현을 증가시켜 세포 간 접합 부위의 구조적 치밀성을 높이고 장벽의 선택적 투과성과 보조적 기능을 동시에 향상시켰다. 또한 항염증 활성을 통해 장벽 항상성 유지에 기여하였으며, 코르티솔의 활성 조절과 코르티솔에 의해 억제된 상처 치유를 회복시키는 효과도 확인되었다. 이러한 구조적·기능적 양측면에서의 효능을 고려할 때, MPE는 피부 장벽 강화를 위한 잠재적 화장품 원료로 활용될 수 있다.
Figure 1.
Effects of Mentha piperita extract (MPE) on cell viability in HaCaT keratinocytes and RAW 264.7 macrophages.
(A) HaCaT keratinocytes and (B) RAW 264.7 macrophages were exposed to different MPE concentrations (0–200 ppm) for 24 h, and their viability was subsequently measured via the MTT assay. Relative values were calculated against the untreated control (−). Data are presented as the mean±SD (n=3). The Student’s t-test was applied for group comparisons (*p<0.05).
Figure 2.
Effects of Mentha piperita extract (MPE) on keratinocyte differentiation and cornified envelope (CE) formation.
HaCaT cells were treated with different MPE concentrations (10–200 ppm) for 24 h followed by re-treatment for an additional 24 h. (A) Relative mRNA levels of keratinocyte differentiation markers (IVL, KRT10, TGM1, FLG, CASP14, and CAPN1). PUM1 was used as the reference gene. (B) Representative phase-contrast microscopy images (scale bar=500 μm). (C) Quantification of CE formation after 6 days of treatment with MPE. CaCl2 served as a positive control. Relative values were calculated against the untreated control (−). Data are expressed as the mean±SD (n=3). The Student’s t-test was employed for group comparisons (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the untreated control (−)).
Figure 3.
Effects of Mentha piperita extract (MPE) on the expression of genes and proteins related to tight junction (TJ).
HaCaT cells were treated with different MPE concentrations (10–200 ppm) for 24 h followed by re-treatment for an additional 24 h. (A) Relative mRNA levels of TJ-related genes (CLDN3, CLDN4, CLDN7, OCLN, and ZO-1). PUM1 was used as the reference gene. CaCl2 served as a positive control. (B) Representative immunofluorescence images of TJ-related proteins (CLDN4, OCLN, and ZO-1) in HaCaT cells after treatment with MPE (200 ppm). Images show merged signals (Hoechst, nuclei; Alexa Fluor 488, target proteins) alongside quantitative analysis of Alexa Fluor 488 fluorescence intensity (scale bar=25 μm). Relative values were calculated against the untreated control (−). Data are expressed as the mean±SD (n=3). The Student’s t-test was employed for group comparisons (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the untreated control (−)).
Figure 4.
Effects of Mentha piperita extract (MPE) on PGE2 production induced by lipopolysaccharides (LPS) in RAW 264.7 macrophages.
RAW 264.7 macrophages were exposed to different MPE concentrations (10–200 ppm) for 1 h prior to stimulation with LPS (100 ng/ml) for 24 h. The levels of PGE2 in the culture supernatants were quantified using an ELISA kit and expressed as absolute concentrations (pg/ml). Celecoxib (Cel., 1 nM) was used as a positive control. Data are expressed as the mean±SD (n=3). The Student’s t-test was applied for group comparisons (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the untreated control (−); #p<0.05 compared with the control group without inducer treatment).
Figure 5.
Effects of Mentha piperita extract (MPE) on 11β-HSD1 activity and cortisol-induced impairment of wound healing.
(A) Relative 11β-HSD1 activity. HaCaT cells were pretreated with different MPE concentrations (10–200 ppm) for 1 h, followed by treatment with cortisone (1 μM) for 16 h. 11β-HSD1 activity was measured using a GL reporter assay. BVT.2733 (200 μM) was used as a positive control. (B) Representative images of wound healing at 0 h (T0) and 16 h (T16) after scratch induction in HaCaT cells. Cells were co-treated with cortisol (1 μM) and MPE (10–200 ppm) for 16 h. Wound closure was quantified as the difference between T0 and T16, expressed relative to the untreated control (−). Relative values were calculated against the untreated control (−). Data are presented as the mean±SD (n=3). The Student’s t-test was employed for group comparisons (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the untreated control (−); #p<0.05, ##p<0.01 compared with the control group without inducer treatment).
Table 1.
RT-qPCR primer sequences for human keratinocyte differentiation and tight-junction genes
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Gene name |
Accession number |
Primer sequence |
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PUM1
|
NM_001101.5 |
F: CGGTCGTCCTGAGGATAAAA |
|
R: CGTACGTGAGGCGTGAGTAA |
|
IVL
|
NM_005547.4 |
F: CCCACAAAGGGAGAAGTATTG |
|
R: CACTGCGGGTGGTTATTT |
|
KRT10
|
NM_000421.5 |
F: AGGGGGCAGTTTCGGAGGTG |
|
R: AAGTAGGAAGCCAGGCGGTCATT |
|
TGM1
|
NM_000359.3 |
F: ACGACACGCCTTTCATTT |
|
R: GCCTTCTCCTCCACATAAAC |
|
FLG
|
NM_002016.1 |
F: CTCAGCATCCCAAGATGGTC |
|
R: ATCTACCGATTGCTCGTGGT |
|
CASP14
|
NM_012114.2 |
F: GCCCCTTCTCCAAGATCAGT |
|
R: AGCACCCTTGTCTGATCCAA |
|
CAPN1
|
NM_005186 |
F: GCTTCCAGAATGGCTATGC |
|
R: ACTAGCTTCCCGTCCTTG |
|
CLDN3
|
NM_001306 |
F: CATCACGTCGCAGAACATCT |
|
R: GTGTCTGAGGGTTCATCACG |
|
CLDN4
|
NM_001305.3 |
F: AACCTGTCCCCGAGAGAGA |
|
R: GCAAGTGTGAGCAGACCAGT |
|
CLDN7
|
NM_001307.5 |
F: CTGGTGCTCAGGTTTCTTCC |
|
R: ACTCACCTGAACCGGAAGTC |
|
ZO-1
|
NM_003257.3 |
F: GGTCAGAGCCTTCTGATCATTC |
|
R: CATCTCTACTCCGGAGACTGC |
|
OCLN
|
NM_002538.3 |
F: CACTATGAGACAGACTACACAACTGG |
|
R: TTGATCTGAAGTGATAGGTGGATATT |
References
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