LPS에 유도된 RAW 264.7 세포에서 오미자(Schisandra chinensis) - 토복령(Smilax china)의 항염증 효능 평가
요약
목적
본 연구는 지질다당류(LPS)로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 오미자(Schisandra chinensis)-토복령(Smilax china) 복합 추출물의 항염증 효과를 조사하는 것을 목표로 하였다.
방법
에탄올 추출 방법으로 건조된 오미자(Schisandra chinensis)-토복령(Smilax china)에서 복합추출물을 얻었다. SSCE의 RAW 264.7 세포의 세포 생존력은 MTT 분석을 통해 측정하였다. 항염증 활성은 Griess reagent 분석을 이용한 NO 생성 억제, Western Blot 분석을 이용한 iNOS 단백질 발현, RT-PCR 분석을 이용한 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 확인하여 검증하였다.
결과
SSCE가 RAW 264.7 세포에서 세포 독성 및 항염증 활성에 미치는 영향을 분석하였다. SSCE는 RAW 264.7 세포에서 다양한 농도(25-200 μg/mL)에서 독성이 없는 것으로 확인되었다. SSCE는 NO 생성, iNOS 단백질 발현 및 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 mRNA 발현 수준을 25-200 μg/mL에서 농도 의존적으로 억제하였다. 특히 SSCE 200 μg/mL에서 NO 생성은 60.9%의 억제 효과와 iNOS 단백질 발현은 69.8%의 발현억제 효과를 보였다. 또한 염증성 사이토카인인 TNF-α는 68.6%, IL-1β는 75.7%, IL-6는 64.5%의 억제효과를 확인하였다.
결론
이와 같은 연구 결과들로부터 오미자(Schisandra chinensis)-토복령(Smilax china) 복합추출물의 항염증 효과를 확인하였으며, 염증 관련 질환 치료를 위한 기능성 소재 및 제품 개발에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
핵심용어: 오미자, 토복령, 항염, NO, RAW 264.7 macrophages
Abstract
Purpose
This study investigated the anti-inflammatory effects of a Schisandra chinensis–Smilax china complex extract (SSCE) in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 macrophages.
Methods
SSCE was prepared from dried S. chinensis and S. china using ethanol extraction. Cell viability of macrophages (RAW 264.7 cells) following SSCE treatment was assessed by MTT assay. Anti-inflammatory activity was assessed by measuring nitric oxide (NO) production using the Griess reagent, analyzing iNOS protein expression by Western blotting, and quantifying pro-inflammatory cytokine mRNA levels by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).
Results
SSCE exhibited no cytotoxicity at concentrations of 25–200 μg/mL in RAW 264.7 macrophages. Treatment with SSCE significantly reduced NO production and downregulated the expression of iNOS and pro-inflammatory cytokines, including tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), and interleukin-6 (IL-6) in a concentration-dependent manner. Particularly, 200 μg/mL of SSCE inhibited NO production by 60.9% and iNOS expression by 69.8%. Moreover, SSCE suppressed TNF-α, IL-1β, and IL-6 mRNA expression by 68.6%, 75.7%, and 64.5%, respectively.
Conclusion
These findings confirm that the S. chinensis–S. china complex extract imparts potent anti-inflammatory effects in LPS-stimulated macrophages. SSCE may therefore represent a promising natural candidate for the development of functional materials or therapeutic agents targeting inflammation-related diseases.
Keywords: Schisandra chinensis, Smilax china, Anti-inflammatory, Nitric oxide, RAW 264.7 macrophages
中文摘要
目的
本研究探讨了五味子-土茯苓复合提取物(SSCE)对脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7巨噬细胞的抗炎作用。
方法
采用乙醇提取法，以干燥的五味子和土茯苓为原料制备SSCE。采用MTT法检测SSCE处理后巨噬细胞(RAW 264.7细胞)的细胞活力。通过Griess试剂测定一氧化氮(NO)的生成量、Western blotting分析iNOS蛋白的表达以及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)定量促炎细胞因子mRNA水平，来评价SSCE的抗炎活性。
结果
在浓度为 25–200 μg/mL时，SSCE对RAW 264.7巨噬细胞无细胞毒性。SSCE处理显著降低了NO的产生，并以浓度依赖的方式下调了iNOS和促炎细胞因子(包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)和白细胞介素-6 (IL-6)) 的表达。特别是，200 μg/mL的SSCE抑制了NO产生60.9%，抑制了iNOS表达69.8%。此外，SSCE分别抑制了TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达68.6%、75.7%和64.5%。
结论
这些研究结果证实，五味子-土茯苓复合提取物对脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞具有显著的抗炎作用。因此，五味子-土茯苓复合提取物可能是一种有前景的天然候选物，可用于开发针对炎症相关疾病的功能材料或治疗药物。
关键词: 五味子, 土茯苓, 抗炎, 一氧化氮, RAW 264.7 巨噬细胞
Introduction
현대를 살고 있는 인류는 산업화 과정으로 인하여 경제성장과 더불어 생활환경과 서구화된 식습관의 변화로 생활습관병이 증가하고 생물학적, 화학적 유해 환경 등에 노출되어 생체내의 면역 조절 기능 이상으로 염증성 피부질환의 발명이 증가하고 있다( Kim et al., 2022a). 염증반응은 외부로부터의 감염과 같은 자극에 대한 신체조직의 방어반응으로 자극에 대한 조직의 손상을 회복하는 생체방어 시스템이며, 신체 보호 및 회복을 위한 생리학적, 병리학적 기작이다( Kim et al., 2012; Shin et al., 2023). 염증반응에 관여하는 세포인 macrophage는 염증의 초기부터 발달 및 해소에 주요한 역할을 하는 면역세포 중 하나로 외부 병원체에 대한 방어와 후천성 면역 세포와 면역반응을 조절하는 면역시스템에서 중요한 역할을 한다( Orecchioni et al., 2019; Yang et al., 2014). 염증 반응이 시작되면 대식세포는 염증성 매개물질의 형성을 촉진시켜 nitric oxide (NO), prostaglandin E 2 (PGE 2) 및 염증성 cytokine 등의 염증 매개물질들의 생성을 활성화시킨다( Lee et al., 2018; Roh et al., 2017). 체내 염증 과정에서 중요한 역할을 하는 NO는 L-arginine이 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 L-citrulline으로 합성될 때 생성되는 물질이다( Knowles & Moncada, 1994). NOS에는 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS) 및 inducible NOS (iNOS)의 isoform이 존재하는데 nNOS와 eNOS는 정상적인 세포에서 발현되며, iNOS는 염증성 사이토카인과 LPS 등에 의해 발현된다. 과잉 발현된 iNOS는 NO 생성을 촉진하여 염증 반응을 증가시킨다( Kim et al., 2012; Jang & Hwangbo, 2023). Interleukin-1β ( IL-1β)는 선천 면역체계에서 생성되는 염증 반응의 중요한 매개체로서 감염 및 손상에 대한 생체 방어에 기여하고, interleukin-6 ( IL-6)는 염증 반응을 조절하여 면역 항상성 유지에 도움을 준다( Shin et al., 2023). Tumor necrosis factor-α ( TNF-α)는 종양세포의 괴사뿐만 아니라 염증 반응을 조절해 생체 내 항상성을 유지하며, 염증성 사이토카인의 과잉 발현은 자가면역질환, 조직 손상, 암 등의 원인이 될 수 있다( Jang & Hwangbo, 2023; Shin et al., 2023). 따라서 cytokines 억제는 염증을 억제시키는 항염활성 물질이라 할 수 있다( Chiou et al., 2001; Jung et al., 2012). 낙엽성 목본인 덩굴식물의 오미자과(Schisandraceae)의 열매인 오미자( Schizandra chinensis)는 생약 및 식품원료 등에 사용되었다( Lee et al., 2022a). 오미자의 주요 약리학적 효능으로는 항산화( Jung et al., 2025), 항염( Lee et al., 2022a), 미백( Lee & Kim, 2023), 항관절염 효과( Kim et al., 2022), 혈당뇨( Ko et al., 2004), 간 보호( Liu et al., 2024) 등이 보고되었다. 백합과(Lilaceae) 덩굴성 관목인 청미래덩굴의 뿌리인 토복령( Smilax china)은 한국, 중국, 일본과 인도차이나 등에 널리 분포하는 식물이다( Lee et al., 2016). 토복령의 주요 약리학적 효능으로는 항여드름( Park & Kwon, 2017), 항건선( Vijayalakshmi et al., 2012), 미백( Lee et al., 2016), 항염효과( Lee, 2009), 골반의 항염 효과( Song et al., 2017), 피부장벽( Jo & Choi, 2024) 등이 보고되었다. 오미자와 토복령 각각의 생리활성 연구는 진행되었지만 오미자-토복령 복합추출물에 대한 생리활성 연구는 진행되어 있지 않다. 본 연구에서는 오미자, 토복령은 모두 항균 및 항염 효능이 있어 단독으로 사용하기 보다 혼합 사용할 경우 오미자-토복령 복합추출물의 항염증 상승효과를 확인하여 기능성 소재로서의 가능성을 알아보고자 하였다.
Methods
1. 시료 추출
본 연구에서 사용된 오미자(Schisandra chinensis)는 경상남도 거창군 거창보해산 오미자에서 구매하였으며, 토복령(Smilax china)은 경상남도 산청군 산청한방약초시장에서 구매하였다. 오미자-토복령 복합추출물(Schisandra chinensis-Smilax china compliex extract, SSCE)는 오미자 파우더 54 g과 토복령 파우더 126 g을 50% 에탄올 1800 mL을 용매로 상온에서 2일간 정치하여 각각의 비율로 추출하였으며, 각각의 복합추출물은 여과지(Whatman No.2, GE Healthcare, UK)를 사용하여 여과하고, 감압 하에서 Rotary Evaporator (DAIHAN Scientific, Korea)로 농축한 후 용매를 제거한 후 실험에 사용 전까지 냉동 보관하였다.
2. 세포 배양
RAW 264.7 대식세포는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 세포 배양에 사용된 Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM; HyClone, Cytiva, USA)배지는 10% Fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, USA)와 1% penicillin/streptomycin (Gibco BRL)을 첨가하여 사용하였다. RAW 264.7 세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
3. 세포 생존율 측정
MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. RAW 264.7 세포를 96-well plate에 1×104 cells/well로 분주하여 24 h 배양 후 시료를 농도별(25-400 μg/mL)로 처리하여 24 h 배양하였다. 세포 생존율을 확인하기 위해서 well 당 MTT (Sigma-Aldrich, USA) (5 mg/mL)를 10 μL 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 4 h 배양하였다. 상등액을 제거하고 생성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) 150 μL 처리하여 30 min 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. Nitric oxide (NO) 생성 억제능 측정
RAW 264.7 세포를 24-well plate에 2.5×105 cells/well로 분주하여 24 h 배양 후 시료를 농도별(25-200 μg/mL)로 처리하고 1 h 배양 후 LPS (Sigma-Aldrich) 1 μg/mL를 처리하여 24 h 배양하였다. 세포 배양액과 Griess reagent (promega, USA)을 동량 첨가하여 10 min 반응 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 생성 억제능은 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선을 작성하여 측정하였다.
5. Western Blot
RAW 264.7 세포를 100 mm culture dish에 1×106 cells로 분주하여 24 h 배양 후, 시료를 농도별(25-200 µg/mL)로 처리하여 1 h 배양 후 LPS 1 µg/mL를 처리하고 24 h 배양하였다. 배양 후 PBS 용액으로 세척하고, RIPA buffer (Cell signaling, USA) 100 µL를 처리하여 세포를 용해하였다. 4℃에서 10,000 xg 10 min 원심분리하여 상층액을 얻은 후 BCA protein assay kit (iNtron Biotechnology, Inc., Korea)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 12% polyacrylamide SDS gel을 사용하여 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF; Sigma-Aldrich) membrane으로 transfer하였다. PVDF membrane을 3% skim milk 또는 3% bovine serum albumin (BSA) 용액으로 blocking하였다. 1차 항체인 iNOS (1:1000; Cell Signaling Technology, USA)를 blocking buffer에 희석하여 4℃에서 overnight 하였다. PBS-T (0.05% Tween 20 in PBS) 용액으로 세척 후 2차 항체를 처리하여 실온에서 1 h 반응시킨 후 PBS-T 용액으로 세척하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL; Thermo Scientific, USA) 용액에 반응시킨 후, 단백질의 발현은 화학 발광 이미징 시스템(VILBER, France)을 통해 측정하였다.
6. Total RNA 분리 및 cDNA 합성
RAW 264.7 세포를 60 mm cell culture dish에 5×105 cells로 분주하여 24 h 배양 후 시료를 농도별(25-200 μg/mL)로 처리하여 1 h 배양 후 LPS 1 μg/mL를 처리하여 6 h 배양하였다. 배양액을 제거하고 diethylpyrocarbonate (DEPC) PBS로 세포를 세척한 뒤 RiboEx TM (GeneAll Biotechnology Co. Ltd, Korea) 500 μL로 세포를 lysis 하였다. 세포 용해물에 100 μL의 chloroform을 첨가한 후 4℃에서 12,000 xg 15 min 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상층액에 isopropanol 500 μL를 첨가하여 10 min 반응시킨 후 4℃에서 12,000 xg 10 min 원심분리하여 상층액을 제거하고 pellet만 남겨두었다. Pellet을 75% 에탄올로 세척 후 DEPC water로 희석하였다. Total RNA 농도는 SPECTROstar NANO (BMG Labtech, Germany)를 사용하여 측정하였다. RNA 1 μg, Oligo dT 1 μL와 random primer 0.3 μL을 72℃에서 5 min 반응시킨 뒤 AccuPower® RT PreMix (Bioneer, Korea)로 cDNA를 합성하였다.
7. Reverse transcription-PCR (RT-PCR)
염증 매개 인자의 mRNA 발현을 확인하기 위해 RT-PCR로 측정하였다. 합성된 cDNA를 Taq DNA Polymerase (Bioneer, Korea)와 primer sequences를 혼합하여 PCR을 진행하였다. 실험에 사용된 primer 염기서열은 Table 1과 같다. PCR 조건은 95℃에서 3 min 전변성 반응 후, 95℃에서 30 s, 55℃에서 30 s, 72℃에서 1 min을 한 주기로 35 주기를 반복 실행하였다.
8. 통계처리
본 실험은 3회 반복하여 mean±SD로 표기하였으며, Graphpad Prism software (version 5.00 for Windows, USA) 프로그램으로 one way ANOVA를 실시한 후 Tukey’s test 방법을 사용하여 그 결과 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
Results and Discussion
1. 세포 생존율 측정
MTT assay는 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소에 의하여 tetrazolium의 고리구조가 파괴되어 자주색의 formazan 결정으로 환원되는 원리를 이용하였다( Ukeda et al., 1997). 항염증 효능 평가를 수행하기에 앞서 SSCE의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 진행하였다. SSCE는 50-200 μg/mL에서 100% 이상의 세포 생존율을 확인하였으며, 400 μg/mL에서 70.35%의 생존율을 확인하였다( Figure 1). 이후 본 실험에서는 100% 이상의 세포 생존율 나타내는 농도에서 실험을 진행하였다.
2. NO 생성 억제 효과
LPS와 같은 자극에 의해 발현된 iNOS는 NO를 생성하며, 생성된 NO는 조직과 신경 손상을 유발하고, 유전자 변이를 유도하거나, 부종을 유발하는 등 과도한 염증반응을 일으킨다( Shim, 2018). 본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 SSCE를 처리하여 NO 생성능을 확인하였다. RAW 264.7 세포는 LPS에 의해 NO 생성이 유도되었으며, SSCE (25-200 μg/mL) 처리에 의해 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 나타내었다. NO 생성 억제는 100 μg/mL, 200 μg/mL에서 36.2%, 60.9%의 유의한 억제 활성을 나타내었다( Figure 2).
3. Western Blot을 통한 iNOS에 대한 단백질 발현억제 효과
NOS는 세 가지 isoform 중에 eNOS, nNOS는 혈관 내피세포 또는 신경세포 등에서 항상 발현되어 있어서 constitutive NOS (cNOS)라하며, iNOS는 대식세포 등에서 cytokine, LPS와 같은 내독소의 자극에 의해 발현되어 NO 생성을 촉진하여 염증성 질환을 유발한다( Yim, 2010; Cossenza et al., 2014). 본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 SSCE를 처리하여 iNOS 발현에 미치는 영향을 Western Blot을 이용하여 확인하였다. SSCE (25-200 μg/mL) 처리에 의해 농도 의존적으로 iNOS 단백질 발현이 억제되었다. iNOS 단백질 발현억제는 100 μg/mL, 200 μg/mL에서 40.1%, 69.8%의 유의한 억제 활성을 나타내었다( Figure 3).
4. 염증성 사이토카인 발현억제 효과
IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 과도한 발현은 아토피피부염, 건선 등과 같은 다양한 염증성 피부 질환을 유발할 수 있으므로, 염증성 사이토카인의 발현을 조절하는 것은 중요하다( Lee et al., 2022b; Kim & Hwang, 2020; Kim et al., 2023). 본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 SSCE를 처리하여 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인하였다. SSCE (25-200 μg/mL) 처리에 의해 농도 의존적으로 염증성 사이토카인( IL-1β, IL-6 및 TNF-α)이 억제되는 것을 확인하였다. 100 μg/mL, 200 μg/mL에서 IL-1β 발현억제는 75.3%, 75.7%의 유의한 억제 활성을 나타내었으며( Figure 4A), IL-6 발현억제는 53.1%, 64.5%의 유의한 억제 활성을 나타내었으며( Figure 4B), TNF-α 발현억제는 44.5%, 68.6%의 유의한 억제 활성을 나타내었다( Figure 4C).
Conclusion
본 연구에서는 오미자( Schisandra chinensis)와 토복령( Smilax china)을 혼합 추출하여 항염증 효과를 확인하고자 하였다. 대식세포인 RAW 264.7 세포는 LPS에 의한 자극으로 많은 양의 NO를 생성하며, 과도한 NO는 면역 반응, 세포 독성, 신경 전달, 혈관 확장 등 다양한 생물학적 과정에 관여한다( Yang et al., 2014; Jeong et al., 2012). NO는 농도에 따라 세포 기능 유지에 중요한 역할을 하기도 하지만 과다 생성 시 조직 손상 및 유전자 변이, 종양 형성 등의 부작용을 초래한다( Yang et al., 2014; Kim et al., 2022b). iNOS는 LPS나 염증성 사이토카인에 의해 발현된다. 과잉 발현된 iNOS는 NO 생성을 촉진하여 염증 반응을 증가시킨다( Kim et al., 2012; Jang & Hwangbo, 2023). 대식세포는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 합성증가를 동반하는 면역 반응에 참여하고 이를 촉진한다( Zhang & Wang, 2014). LPS로 유도된 대식세포 화성화는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 염증 매개체의 생성으로 이어질 수 있다( Rietschel et al., 1994). IL-1β는 염증 반응의 매개체로서 감염 및 손상에 대한 생체 방어에 기여하고, IL-6는 염증 반응을 조절하여 면역 항상성 유지에 도움을 주며, TNF-α는 종양세포의 괴사뿐만 아니라 염증 반응을 조절해 생체 내 항상성을 유지하며, 염증성 사이토카인의 과잉 발현은 자가면역질환, 조직 손상, 암 등의 원인이 될 수 있다( Jang & Hwangbo, 2023; Shin et al., 2023). LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 SSCE (25-200 μg/mL)를 처리하여 농도 의존적으로 NO 생성 억제, iNOS 단백질 발현억제 및 염증성 사이토카인( IL-1β, IL-6, TNF-α)의 mRNA 발현억제를 나타내었다. NO 생성은 100 μg/mL, 200 μg/mL에서 36.2%, 60.9%의 생성 억제, iNOS의 단백질 발현은 100 μg/mL, 200 μg/mL에서 40.1%, 69.8%의 억제를 나타내었다. 또한 100 μg/mL, 200 μg/mL에서 75.3%, 75.7%의 IL-1β 발현억제, 53.1%, 64.5%의 IL-6 발현억제 및 44.5%, 68.6%의 TNF-α 발현억제를 나타내었다.
Jo & Choi (2024)의 선행연구에서 토복령 50% 에탄올 추출물 200 μg/mL에서 74.38%의 NO 생성 억제 활성과 51.64%의 iNOS 단백질 발현억제 활성이 보고되었으며, Lee (2009)의 선행연구에서는 토복령 열수추출물 100 μg/mL에서 0.4±1.1%의 TNF-α 발현 억제 활성이 보고되었다. Lee et al. (2022a)의 선행연구에서 오미자 40% 에탄올 추출물 100 μg/mL에서 46.3%의 NO 생성 억제 활성이 보고되었으며, Jang & Park (2015)의 선행연구에서 오미자 씨앗오일 100 μg/mL에서 48.8%의 IL-1β 억제 활성, 31.6%의 iNOS 단백질 발현억제 활성이 보고되었다. SSCE는 기존의 선행연구된 오미자 추출물와 토복령 추출물보다 NO 생성 억제 활성이 다소 낮게 나타내었으나, iNOS 단백질 발현억제 활성과 염증성 사이토카인의 발현억제 활성을 보다 효과적으로 나타내었다. 따라서 염증 반응의 근본적인 원인인 iNOS 단백질 발현과 염증성 사이토카인의 발현을 효과적으로 억제한다는 것은 SSCE가 함염증 효과가 있음을 시사한다. 이와 같은 결과들로부터 오미자-토복령 에탄올 복합추출물이 염증매개인자를 조절하여 항염증 효과를 나타내는 것으로 확인되었으며, 염증 관련 질환 치료를 위한 기능성 소재 및 제품 개발에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
Figure 1.
Effects of Schisandra chinensis-Smilax china ethanol extracts on cell viability of RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were treated with SSCE (25–800 μg/mL) for 24 h. Cell viability was determined using an MTT assay. The untreated control (con) response is expressed as 100 %. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. *p<0.05, ***p<0.001 compared with the untreated control (con). SSCE, Schisandra chinensis-Smilax china ethanol extract.
Figure 2.
Effects of Schisandra chinensis-Smilax china ethanol extracts NO production in LPS-induced RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were incubated with various concentrations of SSCE (25-200 μg/mL) for 1 h, followed by LPS (1 μg/mL) for 24 h. Then the levels of NO production in the conditioned media were determined. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. #p<0.05 compared with the untreated control (con); ***p<0.001 compared with LPS. SSCE, Schisandra chinensis-Smilax china ethanol extract.
Figure 3.
Effects of Schisandra chinensis-Smilax china ethanol extracts on iNOS protein expression levels in LPS-induced RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were incubated with various concentrations of SSCE (25-200 μg/mL) for 1 h, followed by LPS (1 μg/mL) for 24 h. The protein expression levels of iNOS were determined by Western Blot. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. #p<0.05 compared with the untreated control (con); **p<0.01, ***p<0.001 compared with LPS. SSCE, Schisandra chinensis-Smilax china ethanol extract.
Figure 4.
Effects of Schisandra chinensis-Smilax china ethanol extracts on mRNA expression of proinflammatory cytokines in LPS-induced RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were incubated with various concentrations of SSCE (25-200 μg/mL) for 1 h, followed by lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL) for 6 h. Then the mRNA levels of (A) interleukin-1β (IL- 1β), (B) interleukin-6 (IL-6), and (C) tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by RT-PCR analysis. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. #p<0.05 compared with the untreated control (con); *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with LPS. SSCE, Schisandra chinensis-Smilax china ethanol extract.
Table 1.
Sequence of target gene-specific primers used in the RT-PCR
|
Target gene |
|
Primer sequence |
|
IL-1β
|
forward |
5’-AGACAGCTCAATCTCCAGGG-3’ |
|
reverse |
5’-GGCAAGGAGGAAAACACAGG-3’ |
|
IL-6
|
forward |
5’-CGCTATGAAGTTCCTCTCTGC-3’ |
|
reverse |
5’-GTTGTCACCAGCATCAGTCC-3’ |
|
TNF-α
|
forward |
5’-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3’ |
|
reverse |
5’-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3’ |
|
GAPDH
|
forward |
5’-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’ |
|
reverse |
5’-ATCGAAGGTGGAAGAGTGGG-3’ |
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