Introduction
피부장벽은 인체의 최외곽에서 외부 자극, 병원체, 화학적 유해 인자로부터 신체를 보호하고 체내 수분 손실을 억제하는 핵심 방어 체계이다(Matsui & Amagai, 2015; Proksch et al., 2008). 그러나 자외선, 대기오염, 세정제, 건조한 환경, 노화 등 다양한 내·외부 요인에 의해 피부장벽 기능이 저하되면 transepidermal water loss (TEWL)가 증가하고, 이는 피부 건조, 민감성 증가, 나아가 염증성 피부 질환으로 이어질 수 있다(Krutmann et al., 2017; Passeron et al., 2020; Salsberg et al., 2019). 대표적인 피부장벽 관련 만성 염증성 질환인 atopic dermatitis (AD)는 전 세계적으로 약 2.6%의 유병률을 보이며 약 2억 405만 명이 영향을 받는 것으로 보고된다(Tian et al., 2023). 또한 AD에서는 각질형성세포 분화 이상, 피부장벽 지질 조성 변화 및 항균 방어 기능 저하가 함께 나타날 수 있어 피부장벽 회복을 위한 접근이 중요한 것으로 보고되어 있다(Goleva et al., 2019). 이처럼 피부장벽 기능 저하는 단순한 피부 건조를 넘어 만성적인 피부 불편감과 질환 부담으로 이어질 수 있으므로 피부장벽을 구성하는 세포 및 지질 구조를 조절할 수 있는 기능성 소재의 개발과 효능 검증이 중요하다(Kahraman et al., 2019). 이러한 피부장벽 관련 소재의 효능을 평가하기 위해서는 각질층의 구조적 성숙과 세포간 지질 형성을 함께 고려할 필요가 있으며, 특히 각질층의 구조적 성숙은 표피 각질형성세포의 분화 과정과 밀접하게 관련되어 있다.
각질형성세포 분화는 표피의 기저층에서 증식한 keratinocyte 가 상부층으로 이동하면서 점진적으로 성숙하고, 최종적으로 각질층을 형성하는 과정이다. 표피는 지속적으로 재생되는 조직으로 기저층의 미분화 각질형성세포가 증식한 뒤 유극층, 과립층을 거쳐 각 질층으로 이동하면서 형태적·기능적 변화를 겪는다(Candi et al., 2005; Matsui & Amagai, 2015; Proksch et al., 2008). 이 과정에서 각질형성세포는 세포골격 재구성, cornified envelope 형성 및 세포간 지질 배열을 동반하는 terminal differentiation을 거치며 최종적으로 피부장벽을 구성하는 corneocyte로 전환된다(Candi et al., 2005; Madison, 2003; Matsui & Amagai, 2015). 성숙한 각질층은 protein-enriched corneocyte와 lipid-enriched intercellular domain이 결합된 구조를 형성하여 외부 물질의 침투와 수분 손실을 제한하는 피부장벽 기능을 수행한다(Bouwstra et al., 2023; Proksch et al., 2008; van Smeden et al., 2014). 따라서 각질형성 세포 분화는 피부장벽의 구조적 완성도를 결정하는 핵심 과정이며 이후 피부장벽 관련 지질대사 조절을 함께 이해하는 데 중요한 생물학적 기반이 된다.
지질대사 조절은 각질층 내 세포간 지질 형성과 밀접하게 관련되어 있으며 피부장벽의 수분 손실 억제와 외부 자극 방어 기능을 결정하는 중요한 과정이다. 각질층의 세포간 지질은 주로 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리지방산으로 구성되며, 이들 지질은 각 질세포 사이에서 lamellar lipid structure를 형성하여 TEWL을 억제하고 외부 물질의 침투를 제한한다(Berdyshev, 2024; Madison, 2003; van Smeden et al., 2014). 특히 각질형성세포의 terminal differentiation 과정에서는 단백질성 구조 형성과 함께 지질 합성 및 세포 외 지질 배열이 동반되며, 이러한 과정은 성숙한 각질층의 구조적·기능적 완성에 기여한다(Bouwstra et al., 2023; Matsui & Amagai, 2015; Proksch et al., 2008). 세라마이드는 각질층 세포간 지질의 주요 구성 성분으로 피부장벽 항상성 유지에 중요한 역할을 하며 세라마이드 함량 및 조성 변화는 AD, 건조 피부, 건선 등 다양한 피부장벽 관련 질환과 연관되는 것으로 보고되어 있다(Kahraman et al., 2019; Uchida & Park, 2021). 또한 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리지방산의 균형은 피부장벽 지질 구조의 안정성과 관련되며, 최근에는 phytosphingosine 계열의 ceramide NP 및 ceramide AP와 sphingosine 계열의 ceramide EOS 등 피부장벽 구성 세라마이드의 피부장벽 보완 가능성도 제시되고 있다(Rawlings et al., 2024). 따라서 각질형성세포 분화와 지질대사 조절은 서로 독립적인 현상이 아니라 각질층의 구조적 성숙과 세포간 지질층 형성을 통해 피부장벽 기능을 함께 유지하는 과정으로 이해될 수 있다.
피부장벽 기능은 각질층의 구조적 안정성과 지질층 형성뿐만 아니라 수분 보유 환경 및 산화 스트레스 조절과도 관련된다. 피부가 적절한 수분 상태를 유지하기 위해서는 각질층이 수분 손실을 제한하는 동시에 표피세포 수준에서 수분 이동과 보습 관련 성분의 생성 및 분비가 균형 있게 조절되어야 한다. 이러한 수분 보유 환경이 저하되면 피부 건조와 장벽 불안정성이 심화될 수 있으므로 보습 관련 기능의 조절 여부는 피부장벽 소재의 효능을 평가하는 중요한 요소로 고려될 수 있다(Bollag et al., 2020; Chylińska & Maciejczyk, 2025; Kim et al., 2022). 한편 reactive oxygen species (ROS)의 과도한 축적은 세포 내 지질, 단백질 및 deoxyribonucleic acid (DNA)의 손상을 유도하여 피부 노화와 피부장벽 기능 저하에 관여할 수 있으며 자외선, 대기오염 및 생활환경 요인과 같은 exposome은 산화 스트레스와 염증 반응을 통해 피부장벽 손상을 가속화할 수 있다(Krutmann et al., 2017; Parrado et al., 2019; Passeron et al., 2020; Xu et al., 2017). 이에 따라 피부장벽 관련 기능성 소재를 평가하기 위해서는 각질형성세포 분화와 지질대사 조절뿐만 아니라 보습 관련 기능과 항산화 보호 효과를 복합적으로 확인할 필요가 있다.
피부장벽 관련 소재에 관한 선행연구들을 살펴보면, 각질층 형성 및 피부장벽 기능에서 각질형성세포 분화의 중요성을 제시한 연구(Candi et al., 2005; Jang & Lee, 2016; Matsui & Amagai, 2015), 표피 분화와 지질 조성이 피부장벽 기능 유지에 미치는 영향을 분석한 연구(Berdyshev, 2024; Bouwstra et al., 2023; Proksch et al., 2008; van Smeden et al., 2014), 세라마이드 및 세포간 지질 조성을 기반으로 피부장벽 회복 가능성을 검토한 연구(Kahraman et al., 2019; Rawlings et al., 2024; Uchida & Park, 2021), 보습 인자 및 hyaluronic acid 생성 조절을 통한 피부 수분 환경 개선 연구(Bollag et al., 2020; Chylińska & Maciejczyk, 2025; Im et al., 2024; Kim et al., 2022), 그리고 산화 스트레스 완화와 피부세포 보호 효과에 관한 연구(Guo et al., 2020; Kim et al., 2023; Kim & Park, 2025; Xu et al., 2017) 등이 있다. 이와 같이 피부장벽 항상성은 각질형성 세포의 분화와 각질층 형성뿐만 아니라 세포간 지질의 조성 및 배열, 수분 보유 환경 및 산화 스트레스 조절 등 다양한 과정이 유기적으로 연계되어 유지된다(Ko et al., 2025). 따라서 피부장벽 소재의 기능을 단일 작용에 국한하여 평가하기보다 서로 다른 특성을 갖는 성분을 복합적으로 활용하여 피부장벽에 미치는 영향을 다각적으로 평가할 필요가 있다. 이러한 관점에서 세라마이드는 각질층 세포간 지질의 주요 구성 성분으로서 피부장벽의 구조적 안정성과 수분 손실 억제에 중요한 역할을 하며(Kahraman et al., 2019; Uchida & Park, 2021), 쌀겨 오일은 γ-oryzanol, tocopherol 및 phytosterol과 같은 생리활성 성분을 함유하고 있어 항산화 특성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Liu et al., 2020; Patel & Naik, 2004). 또한 효모 유래 peptide 또는 yeast protein hydrolysate에서는 항산화 활성 및 산화 스트레스에 대한 세포 보호 효과가 보고된 바 있다(Guo et al., 2020; Tao et al., 2023). 이처럼 세라마이드, 쌀겨 오일 및 가수분해 효모 단백질은 피부장벽 유지와 관련하여 각각 다른 기능적 특성을 나타내지만 이들 성분을 하나의 복합 조성으로 적용하여 각질형성세포 분화, 지질대사, 보습 및 산화 스트레스 조절을 통합적으로 평가한 연구는 제한적이다.
따라서 본 연구에서는 ceramide NP, ceramide AP, ceramide EOS, Oryza sativa (rice) bran oil 및 hydrolyzed yeast protein을 포함하는 CeraDeepTM을 이용하여 HaCaT 세포에서 각질형성세포 분화, 지질대사 조절, 보습 관련 기능 및 산화 스트레스 완화 효과를 분석하였다. 또한 이러한 세포 수준의 평가를 통해 CeraDeepTM이 피부 장벽 개선, 보습 및 항산화 기능을 갖는 화장품 소재로 활용될 가능성을 확인하고자 하였다.
Methods
1. 시료 준비
본 연구에 사용된 CeraDeepTM은 ㈜파워플레이어(Korea)에서 제공받아 사용하였다. CeraDeepTM은 ceramide NP, ceramide AP, ceramide EOS 및 Oryza sativa (rice) bran oil을 포함하는 Phase A와 water 및 hydrolyzed yeast protein을 포함하는 Phase B로 구성되었다. 제조 공정에서 Phase A는 각 성분을 혼합 및 가열한 뒤 1차 microfluidization 과정을 거쳤으며, Phase B는 별도로 혼합 및 가열 한 후 2차 microfluidization 과정을 통해 균질화되었다. 이후 제조된 시료는 1 μm 및 0.45 μm filtration 과정을 거쳐 여과되었으며, 세포 실험에 적용하기 전 각 실험 조건에 맞게 배지에 희석하여 사용하였다. 본 연구에서는 CeraDeepTM의 피부장벽, 보습 및 항산화 관련 효능을 평가하기 위해 0.15%, 0.31% 및 0.62% 농도로 처리하였으며, 대조군에는 CeraDeepTM의 최고 처리 농도인 0.62% 처리 시 포함되는 water와 동량의 water를 첨가하여 vehicle에 의한 영향을 보정하였다.
2. 세포 배양
연구에 사용된 인간 각질형성세포(HaCaT)는 German Cancer Research Center (Germany)로부터 분양받았으며, 세포의 배양을 위해 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS; SR10010A; Bandio, USA) 및 1% penicillin/streptomycin (15140-122; Gibco, USA)이 함유된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; LM001-05; Welgene, Korea)을 배양에 이용하였다. 세포는 세포배양기를 이용하여 37℃, 5% CO2 상태에서 배양 및 유지하였다.
3. Water-soluble tetrazolium salt (WST-1) cell viability assay
CeraDeepTM 처리에 따른 HaCaT 세포의 생존율을 평가하고자 WST-1 assay를 수행하였다. HaCaT 세포는 96-well plate에 3×103 cells/well의 농도가 되도록 접종한 뒤 24 h 동안 배양하였다. 이후 CeraDeepTM (0-0.62%)을 처리하여 48 h 동안 추가 배양하였다. 배양된 세포는 배양액을 제거한 뒤 Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS; LB001-02; Welgene, Korea)을 이용하여 1회 세척하였으며, EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit reagent (EZ-3000; DoGenBio, Korea) 혼합액을 각 well에 100 µL씩 처리하여 세포배양기에서 30 min 동안 반응시켰다. 이후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정한 뒤 결과 값을 분석하였다.
4. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)
CeraDeepTM을 처리한 HaCaT 세포 내의 유전자 발현 분석을 하고자 qRT-PCR을 수행하였다. HaCaT 세포는 60 mm dish당 3.5 ×105 cells 농도가 되도록 접종한 뒤 24 h 동안 배양하였다. 이후 CeraDeepTM (0-0.62%)을 처리하여 16 h 동안 추가 반응시켰다. Total RNA는 RiboEX reagent (301001; GeneAll Biotechnology, Korea)를 통해 추출하였고 cDNA는 1 µg의 total RNA와 10 mM dNTPs, oligo dT primers, 5X First-Strand Buffer, 0.1 M DTT, 그리고 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT, 28025-013; Invitrogen, USA)를 이용하여 합성하였다. qRT-PCR은 QuantReady K9600 Real-Time Fluorescent Quantitative PCR System (LifeReal, China)을 통해 수행되었고, 시약으로는 5x HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus (08-24-0000; Solis BioDyne, Estonia)를 사용하였다. 분석된 모든 유전자의 발현량은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 통해 정량되었다. PCR amplification은 40 cycles로 수행하였으며, holding stage는 95℃에서 10 min 동안 수행하였다. 이후 denaturation 95℃, 30 s; annealing 60℃, 30 s; extension 72℃, 30 s 조건으로 반복 수행하였다. mRNA의 발현량은 Ct 값을 이용해 분석하였으며, 분석에 사용된 특정 유전자의 primer 서열의 경우 Table 1과 같다.
5. Western blot analysis
CeraDeepTM을 처리한 HaCaT 세포 내의 단백질 발현 변화를 분석하고자 Western blot을 수행하였다. HaCaT 세포는 60 mm dish당 3.0×105 cells 농도가 되도록 접종한 뒤에 24 h 동안 배양하였다. 이후 CeraDeepTM을 0%, 0.15%, 0.31% 및 0.62%의 농도로 처리하여 24 h 동안 추가 반응시켰다. 세포는 radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer로 용해한 뒤에, 최대 15 μg의 단백질 용해물을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) gel을 통해 80 V로 2 h 동안 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 이후 단백질이 분리된 gel은 electro-blotter를 이용하여 100 V 로 최대 1 h 동안 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane에 옮겼다. PVDF membrane은 4% skim milk solution에 1 h 동안 교반 하였으며, Tris-buffered saline with Tween 20 (TBS-T) buffer를 통해 3회 washing 하였다. Membrane은 1차 항체를 사용하여 4℃에서 overnight 반응시켰고, 다시 TBS-T buffer로 3회 washing 한뒤 2차 항체로 goat anti-rabbit IgG-HRP (7074S; Cell Signaling Technology, USA)와 goat anti-mouse IgG-HRP (7076S; Cell Signaling Technology, USA)를 각각 1:1000으로 희석하여 상온에서 2 h 동안 반응시켰다. TBS-T buffer로 3회 washing 후 enhanced chemiluminescence (ECL) kit (34580; Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 필름에 감광시키는 방법을 통해 단백질의 발현을 조사하였다. Western blot 분석에 사용된 1차 항체는 다음과 같다. β-actin (1:1000; Santa Cruz, USA), keratin 1 (K1; 1:1000; Abcam, UK), keratin 10 (K10; 1:1000; Abcam), involucrin (IVL; 1:500; Abcam), 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR; 1:500; Abcam), serine palmitoyltransferase long chain base subunit 2 (SPTLC2; 1:1000; Abcam), peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARα; 1:500; Santa Cruz), aquaporin 3 (AQP3; 1:1000; Abcam), hyaluronan synthase 2 (HAS2; 1:100; Santa Cruz).
6. Oil Red O staining assay
CeraDeepTM을 처리한 HaCaT 세포 내의 지질 축적 변화를 분석하고자 Oil Red O staining을 수행하였다. HaCaT 세포는 12-well plate에 5.0×104 cells/well의 농도가 되도록 접종한 뒤에 24 h 동안 배양하였다. 이후 CeraDeepTM을 농도별로 처리하여 48 h 동안 추가 반응시켰으며, 양성대조군으로는 100 μM linoleic acid (L1012; Sigma-Aldrich, USA)를 동일한 조건으로 처리하였다. 처리 후 세포는 DPBS로 washing 하였고, 4% formaldehyde로 상온에서 고정하였다. 고정된 세포는 증류수로 washing 한 뒤 Oil Red O solution (O1391; Sigma-Aldrich)을 처리하여 상온에서 염색하였다. 염색 후 남아있는 Oil Red O solution은 증류수로 제거하였으며, 세포 내 지질 축적 정도는 현미경으로 관찰하였다. 정량 분석을 위해 염색된 Oil Red O는 isopropanol로 용출하였고, 용출액은 96-well plate로 옮긴 뒤 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 세포 내 지질 축적량은 대조군 대비 상대값으로 분석하였다.
7. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
CeraDeepTM을 처리한 HaCaT 세포의 배양 상등액 내 hyaluronic acid 분비량 변화를 분석하고자 ELISA를 수행하였다. HaCaT 세포는 60 mm dish에 5×105 cells 농도가 되도록 접종한 뒤 24 h 동안 배양하였다. 이후 배지를 serum-free DMEM으로 교체한 뒤 CeraDeepTM을 농도별로 처리하여 24 h 동안 추가 반응시켰다. 처리 후 배양 배지를 수거하였으며, 12,000 rpm, 4℃, 5 min의 조건으로 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상등액 내 HA 함량은 HA/Hyaluronic Acid ELISA kit (UNFI0033; Assay Genie, Ireland)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분석하였다.
8. Intracellular reactive oxygen species (ROS) assay
CeraDeepTM을 처리한 HaCaT 세포 내의 ROS 변화를 분석하고자 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (H2DCFDA) staining을 수행하였다. HaCaT 세포는 96-well plate에 5×103 cells/well의 농도가 되도록 접종한 뒤에 24 h 동안 배양하였다. 이후 CeraDeepTM을 0%, 0.15%, 0.31% 및 0.62%의 농도로 6 h 동안 사전 처리하였으며, 양성대조군으로는 5 mM N-acetyl-L-cysteine (NAC; A7250; Sigma-Aldrich)을 6 h 동안 처리하였다. 처리 후 세포는 DPBS 로 washing 하였고, DPBS에 희석한 10 µM H2DCFDA (D6883; Sigma-Aldrich)를 처리하여 20 min 동안 암실에서 상온 반응시켰다. 이후 대조군을 제외한 모든 처리군에 DPBS로 희석한 500 μM hydrogen peroxide (H2O2; 4104-4405; Daejung Chemicals, Korea)를 처리한 뒤, 20 min 동안 암실에서 상온 반응시켰다. 형광값은 Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA)를 이용하여 excitation 485 nm 및 emission 520 nm 조건에서 측정하였다.
9. ABTS radical scavenging assay
CeraDeepTM의 항산화 활성을 확인하기 위해 ABTS radical scavenging assay를 수행하였다. ABTS radical cation은 7 mM 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS; HY-15902; MedChemExpress, USA) 용액과 potassium persulfate (1050910250; Supelco, USA)를 최종 농도 2.45 mM이 되도록 혼합하여 제조하였다. 혼합액은 암실에서 overnight 동안 상온 반응시켰으며, 반응 후 734 nm에서 흡광도가 0.70±0.02가 되도록 희석하여 사용하였다. 이후 농도별 CeraDeepTM 희석액과 ABTS 용액을 96-well plate에 넣고 혼합한 뒤, 암실에서 10 min 동안 상온 반응시켰다. 양성대조군으로는 L-ascorbic acid (A5960; Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 흡광도는 microplate reader를 이용하여 734 nm에서 측정하였으며, ABTS radical 소거 활성은 대조군 대비 상대 값으로 분석하였다.
Results and Discussion
1. CeraDeepTM의 세포 생존율 평가
1) 처리 농도에 따른 세포 생존율 분석
CeraDeepTM의 피부장벽, 보습 및 항산화 관련 효능을 평가하기에 앞서, HaCaT 세포에서 CeraDeepTM의 처리 농도에 따른 세포 생존율을 확인하였다. CeraDeepTM을 0-0.62% 농도로 48 h 동안 처리한 후 WST-1 assay를 수행하였다. 분석 결과, CeraDeepTM 0.15%, 0.31% 및 0.62% 처리군의 세포 생존율은 각각 102.25%, 103.72% 및 107.76%로 나타났으며, 0.62% 처리군에서 대조군 대비 유의적인 증가가 확인되었다(Figure 1). 이러한 결과를 바탕으로 이후 실험에서는 CeraDeepTM을 최대 0.62% 농도로 처리하여 효능 평가를 진행하였다.
2. CeraDeepTM의 각질형성세포 분화 촉진 효과
1) 분화 관련 유전자 및 단백질 발현 분석
각질형성세포 분화는 표피의 구조적 성숙과 각질층 형성에 필수적인 과정이며, 피부장벽 기능 유지와 밀접하게 관련되어 있다(Candi et al., 2005; Matsui & Amagai, 2015). K1과 K10은 suprabasal layer에서 발현되는 대표적인 각질형성세포 분화 marker로 알려져 있으며, IVL은 cornified envelope 형성에 관여하여 각질층의 구조적 안정성 및 피부장벽 형성에 중요한 역할을 한다(Schweizer et al., 2006). 이에 본 연구에서는 CeraDeepTM이 각질형성세포 분화 관련 유전자 및 단백질 발현을 조절하는지 확인하기 위해 HaCaT 세포에 CeraDeepTM을 농도별로 처리한 뒤 qRT-PCR 및 Western blot 분석을 수행하였다(Figure 2). qRT-PCR 분석 결과, CeraDeepTM 처리군에서는 대조군과 비교하여 KRT1, KRT10 및 IVL의 mRNA 발 현량이 전반적으로 증가하였다(Figure 2a). CeraDeepTM 0.62% 처리군에서 KRT1, KRT10 및 IVL의 mRNA 발현량은 각각 178.94%, 121.19%, 137.61%로 나타나 대조군 대비 유의적으로 증가하였다. Western blot 분석에서도 CeraDeepTM 처리에 따라 K1, K10 및 IVL 단백질 발현이 증가하는 경향을 보였다(Figure 2b). 특히 CeraDeepTM 0.31% 및 0.62% 처리군에서 K1, K10 및 IVL의 단백질 band intensity가 전반적으로 증가하였으며, IVL 단백질은 처리 농도 증가에 따라 발현이 강화되는 양상이 관찰되었다.
Micallef et al. (2009)은 extracellular calcium 농도의 증가가 각질형성세포 분화를 유도하며, HaCaT 세포에서도 K1, K10 및 IVL과 같은 분화 marker의 발현 변화를 유도함을 보고하였다. 또한 Lehen’kyi et al. (2011)은 calcium 유입 증가에 따라 human keratinocyte에서 K1, K10 및 IVL의 발현이 증가하면서 분화가 촉진됨을 보고하였다. 본 연구에서는 대조군과 CeraDeepTM 처리군을 동일한 DMEM 배양 조건에서 유지하였으며, CeraDeepTM 처리에 따라 분화 관련 유전자 및 단백질의 발현이 증가하였다. 이러한 결과는 기존의 각질형성세포 분화 연구에서 보고된 주요 marker의 발현 양상과 부합하며, CeraDeepTM이 HaCaT 세포의 각질형성세포 분화 조절에 관여할 가능성을 시사한다.
3. CeraDeepTM의 피부장벽 관련 지질대사 조절 효과
1) 지질대사 관련 유전자 및 단백질 발현 분석
각질층의 세포간 지질은 주로 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리 지방산으로 구성되며, 이들 지질은 수분 손실을 억제하고 외부 물질의 침투를 제한함으로써 피부장벽 기능 유지에 중요한 역할을 한다(Berdyshev, 2024; Madison, 2003; Tang et al., 2025; van Smeden et al., 2014). 세라마이드 및 콜레스테롤을 포함한 지질 조성의 변화는 피부장벽 기능 저하와 관련되는 것으로 보고되어 있으며, 각질형성세포의 분화 과정에서도 지질 합성 및 세포간 지질층 형성이 함께 조절된다(Kahraman et al., 2019; Proksch et al., 2008; Uchida & Park, 2021). 본 연구에서 확인한 HMGCR은 콜레스테롤 생합성 경로의 주요 조절 인자이며, SPTLC2는 세라마이드 생합성 초기 단계에 관여하는 serine palmitoyltransferase complex의 구성 인자이다. 또한 PPARA는 지질대사 조절과 관련된 유전자로, 그 단백질 산물인 PPARα는 각질형성세포의 지질 합성 및 피부장벽 기능 조절과 관련된 핵수용체로 알려져 있다(Almoughrabie et al., 2023). 이에 본 연구에서는 CeraDeepTM이 피부장벽 관련 지질대사 인자의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 HaCaT 세포에 CeraDeepTM을 농도별로 처리한 뒤 qRT-PCR 및 Western blot 분석을 수행하였다 (Figure 3a-b). qRT-PCR 분석 결과, CeraDeepTM 처리군에서는 대조군과 비교하여 HMGCR, SPTLC2 및 PPARA의 mRNA 발현량이 전반적으로 증가하였다(Figure 3a). CeraDeepTM 0.62% 처리군에서 HMGCR, SPTLC2 및 PPARA 의 mRNA 발현량은 각각 120.95%, 133.66%, 148.57%로 나타나 대조군 대비 유의적으로 증가하였다. Western blot 분석에서도 CeraDeepTM 처리에 따라 HMGCR, SPTLC2 및 PPARα 단백질 발현이 증가하는 경향을 보였다(Figure 3b). 특히 CeraDeepTM 0.31% 및 0.62% 처리군에서 HMGCR, SPTLC2 및 PPARα의 단백질 band intensity가 대조군 대비 증가하는 양상이 관찰되었다.
Lee et al. (2006)은 PPARα 활성화에 따라 표피 ceramide 함량이 증가하고 피부장벽 회복이 촉진되는 것으로 보고하였다. Majewski et al. (2021) 역시 PPARα를 활성화하는 물질을 처리한 human skin model에서 ceramide와 피부장벽 관련 단백질의 증가 및 barrier repair 촉진을 확인하였다. 본 연구에서도 CeraDeepTM 처리에 따라 PPARA mRNA 및 PPARα 단백질 발현이 증가하였으며, 이와 함께 세라마이드 및 콜레스테롤 생합성과 관련된 HMGCR 및 SPTLC2의 mRNA와 단백질 발현이 증가하였다. 이러한 발현 양상은 기존 연구에서 보고된 PPARα 활성화에 따른 지질대사 변화와 유사하며, CeraDeepTM에 의한 피부장벽 관련 지질대사 조절에 PPARα가 관여할 가능성을 나타낸다.
한편 Takeda et al. (2021)은 HaCaT 세포에 β-sitosterol 3-O-D-glucoside를 처리하였을 때 ceramide 생합성과 관련된 CERS3 및 GCS mRNA 발현이 각각 약 1.19-1.55배 및 1.20배 증가하였으며, 단백질 수준에서도 각각 1.78배 및 1.28-1.32배의 증가가 확인되었다. 또한 Tanno et al. (2000)은 human keratinocyte 에 nicotinamide를 처리하였을 때 SPT의 mRNA 발현 및 효소 활성이 증가하였으며, 이와 함께 ceramide 및 cholesterol 생합성이 각각 4.1-5.5배 및 1.5배 증가함을 확인하였다. 본 연구에서도 CeraDeepTM 처리에 따라 HMGCR 및 SPTLC2의 mRNA와 단백질 발현이 증가하였으며, 이러한 변화는 기존 keratinocyte 연구에서 보고된 지질 생합성 관련 인자의 증가 양상과 부합한다. 이를 통해 CeraDeepTM이 각질형성세포의 세라마이드 및 콜레스테롤 생합성과 관련된 지질대사 조절에 관여할 수 있음을 보여준다.
2) 세포 내 지질 축적 분석
각질형성세포의 지질대사 변화는 세포 내 지질 축적 양상으로도 확인될 수 있으며, 이러한 변화는 피부장벽 관련 lipid metabolic phenotype을 평가하는 지표로 활용될 수 있다(Almoughrabie et al., 2023; Madison, 2003; van Smeden et al., 2014). 이에 본 연구에서는 CeraDeepTM 처리에 따라 HaCaT 세포 내 지질 축적 양상이 변화하는지 확인하기 위해 Oil Red O staining을 수행하였다(Figure 3c-d). 그 결과, CeraDeepTM 처리군에서는 대조군과 비교하여 Oil Red O-positive intracellular lipid signal이 증가하는 경향을 보였다(Figure 3c). 정량 분석 결과, CeraDeepTM 0.15%, 0.31% 및 0.62% 처리군에서 세포 내 지질 축적량은 각각 112.50%, 120.59%, 158.82%로 증가하였으며, 특히 0.31% 및 0.62% 처리군에서 유의적인 증가가 확인되었다(Figure 3d). 또한 양성대조군으로 사용한 100 μM linoleic acid 처리군에서는 지질 축적량이 203.68%로 증가하여, 본 실험 조건에서 세포 내 지질 축적 변화가 적절하게 관찰되었음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 CeraDeepTM이 HaCaT 세포 내 지질 축적을 증가시키며, 세포 수준에서 lipid metabolic phenotype 조절가능성을 나타냄을 확인하였다.
Hong et al. (2010)은 HaCaT 세포에서 LXRα ligand인 TO901317 처리에 의해 Oil Red O-positive lipid droplet의 축적이 증가하였으며, 이와 함께 지질대사 관련 유전자 및 단백질의 발현이 증가함을 보고하였다. 이는 HaCaT 세포에서 지질대사 관련 인자의 발현 변화가 실제 세포 내 지질 축적 증가와 함께 나타날 수 있음을 보여준다. 본 연구에서도 CeraDeepTM 처리에 따라 세포 내 지질 축적이 증가하였으며, 이는 앞서 확인된 지질대사 관련 인자의 발현 증가와 함께 나타났다. 이러한 결과는 CeraDeepTM 처리에 따른 지질대사 관련 인자의 발현 변화가 세포 내 지질 축적 증가와 연관될 가능성을 보여주며, CeraDeepTM이 HaCaT 세포의 지질대사 조절에 관여할 수 있음을 나타낸다.
4. CeraDeepTM의 보습 관련 인자 조절 효과
1) 보습 관련 유전자 및 단백질 발현 분석
피부의 보습 상태는 각질층의 수분 보유 능력, 표피세포 내 수분 이동 및 hyaluronic acid 생성과 같은 다양한 요인에 의해 조절된다. AQP3는 표피 각질형성세포에서 발현되는 수분 및 glycerol transport channel로, 세포 내 수분 이동과 피부 수분 항상성 유지에 관여하는 주요 인자로 알려져 있다(Bollag et al., 2020; Hara-Chikuma & Verkman, 2008). 또한 HAS2는 hyaluronic acid 생합성에 관여하는 효소로, hyaluronic acid 생성 조절을 통해 표피 내 수분 보유 환경과 피부 보습 상태에 영향을 줄 수 있다(Chylińska & Maciejczyk, 2025; Kim et al., 2022). 이에 본 연구에서는 CeraDeepTM이 보습 관련 유전자 및 단백질 발현을 조절하는지 확인하기 위해 HaCaT 세포에 CeraDeepTM을 농도별로 처리한 뒤 qRT-PCR 및 Western blot 분석을 수행하였다(Figure 4a-b). qRT-PCR 분석 결과, CeraDeepTM 처리군에서는 대조군과 비교하여 AQP3 및 HAS2 의 mRNA 발현량이 증가하는 양상을 보였다(Figure 4a). CeraDeepTM 0.62% 처리군에서 AQP3 및 HAS2 의 mRNA 발현량은 각각 181.94%, 118.13%로 나타나 대조군 대비 유의적으로 증가하였다. Western blot 분석에서도 CeraDeepTM 처리에 따라 AQP3 및 HAS2 단백질 발현이 증가하는 경향을 보였다(Figure 4b). 특히 CeraDeepTM 0.31% 및 0.62% 처리군에서 AQP3 단백질의 band intensity가 뚜렷하게 증가하였으며, HAS2 단백질 또한 CeraDeepTM 처리에 의해 발현이 증가하는 양상이 관찰되었다.
Wang et al. (2023)은 HaCaT 세포에서 AQP3 및 HAS2의 발현 증가가 EGFR-mediated STAT3 및 MAPK signaling의 활성화와 함께 나타남을 보고하였다. 또한 Choi et al. (2019)에서도 HaCaT 세포에서 AQP3 및 HAS2를 포함한 보습 관련 인자의 발현 증가와 함께 MAPK signaling의 활성화가 확인되어, MAPK pathway가 각질형성 세포의 보습 관련 인자 조절에 관여할 수 있음이 제시되었다. 이러한 선행연구를 고려할 때, 본 연구에서 CeraDeepTM 처리에 의해 나타난 AQP3 및 HAS2의 발현 증가에도 STAT3 및 MAPK signaling과 관련된 조절 기전이 관여할 가능성이 있으며, 이를 통해 CeraDeepTM이 각질형성세포의 보습 관련 기능 조절에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
2) Hyaluronic acid 생성 분석
Hyaluronic acid는 다량의 수분을 보유할 수 있는 glycosaminoglycan의 일종으로, 피부 조직 내 수분 유지, 탄력성 및 skin firmness 조절에 중요한 역할을 한다(Chylińska & Maciejczyk, 2025; Kim et al., 2022). 또한 hyaluronic acid는 HAS에 의해 생성되는 천연 보습 인자로, 표피 내 hyaluronic acid 수준의 증가는 피부 수분 보유 환경 조성과 관련될 수 있다(Bollag et al., 2020; Kim et al., 2022). 본 연구에서는 CeraDeepTM 처리에 의해 HaCaT 세포에서 hyaluronic acid 분비량이 변화하는지 확인하기 위해 배양 상등액을 이용하여 ELISA를 수행하였다(Figure 4c). 그 결과, CeraDeepTM 처리군에서는 대조군과 비교하여 hyaluronic acid 분비량이 증가하는 경향을 보였으며, CeraDeepTM 0.15%, 0.31% 및 0.62% 처리군에서 각각 101.21%, 108.31%, 112.43%로 나타났다. 특히 CeraDeepTM 0.31% 및 0.62% 처리군에서는 hyaluronic acid 분비량이 대조군 대비 유의적으로 증가하였다(Figure 4c). 이러한 결과를 통해 CeraDeepTM이 HaCaT 세포에서 hyaluronic acid 분비를 증가시키며, 세포 수준에서 보습 관련 수분 보유 환경 조성에 관여할 가능성을 확인하였다.
Marunaka et al. (2021)은 HaCaT 세포에서 MgCl2 처리에 의해 HAS2 및 HAS3의 발현과 hyaluronic acid 생성이 증가하였으며, 이러한 변화가 GSK3 및 CREB 활성화를 통한 HAS2 및 HAS3의 transcriptional regulation과 관련됨을 보고하였다. 또한 Lim et al. (2015)은 human keratinocyte에서 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol 처리에 의해 HAS2 발현과 hyaluronic acid 생성이 증가하였으며, ERK 및 Akt 억제 시 HAS2 발현 증가가 억제되고 Src 억제 시 HAS2 발현과 hyaluronic acid 생성이 모두 감소함을 확인하였다. 이러한 선행연구는 각질형성세포에서 HAS2의 발현 조절이 hyaluronic acid 생성 변화와 밀접하게 연관되어 있음을 보여준다. 본 연구에서도 CeraDeepTM 처리에 따라 HAS2의 mRNA 및 단백질 발현이 증가하였으며, 이에 동반하여 배양 상등액의 hyaluronic acid 분비량이 증가하였다. 따라서 CeraDeepTM 처리에 따른 hyaluronic acid 분비 증가는 HAS2 발현 증가와 연관되어 나타났을 가능성이 있으며, CeraDeepTM이 각질형성세포의 hyaluronic acid 생성 조절을 통해 보습 관련 기능에 관여할 수 있음을 나타낸다.
5. CeraDeepTM의 산화 스트레스 보호 효과
1) 세포 내 ROS 생성 억제 효과 분석
산화 스트레스는 피부세포 내 ROS의 과도한 축적에 의해 유도되며, 이는 지질, 단백질 및 DNA 손상을 통해 피부 노화, 염증 반응 및 피부장벽 기능 저하에 관여하는 것으로 알려져 있다(Guo et al., 2020; Parrado et al., 2019; Xu et al., 2017). H2O2는 세포 내 ROS 생성을 증가시켜 산화적 손상을 유도하는 자극원으로 사용되며, HaCaT 세포에서 산화 스트레스 보호 효과를 평가하기 위한 모델로 활용될 수 있다(Guo et al., 2020). 이에 본 연구에서는 CeraDeepTM 이 산화 스트레스 조건에서 HaCaT 세포 내 ROS 생성을 조절하는지 확인하기 위해 H2O2로 산화 스트레스를 유도한 뒤 H2DCFDA staining을 수행하였다(Figure 5a-b). 분석 결과, H2O2 (500 μM) 단독 처리군에서는 대조군과 비교하여 DCF fluorescence intensity가 뚜렷하게 증가하였으며, 이는 H2O2 처리에 의해 세포 내 ROS 생성이 증가했음을 보여준다(Figure 5a). 정량 분석 결과, H2O2 단독 처리군의 ROS level은 146.40%로 증가하였으나, CeraDeepTM 0.15%, 0.31% 및 0.62% 처리군에서는 각각 123.92%, 120.39%, 110.54%로 감소하였다(Figure 5b). 특히 CeraDeepTM 0.62% 처리군에서 ROS level이 가장 크게 감소하여, CeraDeepTM이 산화 스트레스 조건에서 세포 내 ROS 생성을 농도 의존적으로 완화하는 경향을 보였다. 또한 양성대조군으로 사용한 5 mM NAC 처리군에서는 ROS level이 121.04%로 감소하였다. 이러한 결과는 CeraDeepTM이 H2O2로 유도된 산화 스트레스 조건에서 HaCaT 세포 내 ROS 생성을 완화하여, 세포 수준에서 항산화 보호 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다.
Kim et al. (2023)은 HaCaT 세포에 500 μM H2O2를 처리하여 증가한 세포 내 ROS가 baicalein 처리에 의해 감소하였으며, 이와 함께 Nrf2/NQO-1/HO-1 signaling을 통한 항산화 반응이 활성화됨을 보고하였다. 또한 Dong et al. (2021)에서도 H2O2로 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포에서 ROS 생성 감소와 함께 Nrf2 및 downstream antioxidant proteins인 HO-1과 NQO1의 발현 증가가 확인되어, Nrf2-mediated antioxidant response가 H2O2에 의해 유도되는 세포 내 ROS 조절에 관여할 수 있음이 제시되었다. 본 연구에서는 CeraDeepTM 처리 농도가 증가함에 따라 H2O2에 의해 증가한 세포 내 ROS가 감소하였으며, 0.62% 처리군에서는 양성대조군인 NAC 처리군보다 낮은 ROS level이 확인되었다. 이러한 선행연구와 본 연구의 결과를 고려할 때, CeraDeepTM에 의한 ROS 감소에도 세포 내 항산화 방어체계와 관련된 조절 기전이 관여할 가능성이 있으며, 이를 통해 H2O2로 유도된 산화 스트레스로부터 각질형성세포를 보호하는 데 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
2) ABTS radical 소거능 분석
항산화 활성은 산화 스트레스로부터 세포 및 조직을 보호하는 기능과 관련되며, 피부장벽 관련 소재의 산화 스트레스 완화 가능성을 평가하는 중요한 지표로 활용될 수 있다(Guo et al., 2020; Re et al., 1999; Xu et al., 2017). 본 연구에서는 CeraDeepTM 원료 자체의 radical scavenging capacity를 확인하기 위해 ABTS radical 소거능을 평가하였다(Figure 5c). 분석 결과, CeraDeepTM 처리군에서는 농도 증가에 따라 ABTS radical 소거능이 증가하는 경향을 보였다. 정량 분석 결과, CeraDeepTM 0.15%, 0.31%, 0.62% 및 1.25% 처리군에서 ABTS radical 소거능은 각각 1.40%, 1.61%, 2.56%, 2.98%로 나타났으며, 모든 처리 농도에서 대조군 대비 유의적인 증가가 확인되었다. 또한 양성대조군으로 사용한 5 μg/mL L-ascorbic acid 처리군에서는 ABTS radical 소거능이 3.80%로 나타났다.
Colombo et al. (2024)은 rice bran에 phenolic acids, flavonoids, γ-oryzanol 및 vitamin E와 같은 항산화 성분이 존재하며, 이들 성분이 radical scavenging activity에 기여할 수 있음을 보고하였다. 또한 Saji et al. (2020)은 rice bran의 phenolic compound 함량과 radical scavenging activity가 연관되어 있으며, rice bran에 함유된 항산화 성분이 ABTS radical 소거 활성에 기여할 수 있음을 확인하였다. 이러한 선행연구를 고려할 때, 본 연구에서 CeraDeepTM의 농도 증가에 따라 ABTS radical 소거능이 증가한 결과는 CeraDeepTM에 포함된 rice bran oil 유래 항산화 성분의 radical scavenging activity가 일부 기여했을 가능성을 나타낸다. 이는 CeraDeepTM이 원료 수준에서 직접적인 radical 소거 활성을 나타내어 산화 스트레스 완화에 기여할 수 있음을 보여준다.
Conclusion
본 연구는 ceramide NP, ceramide AP, ceramide EOS, Oryza sativa (rice) bran oil 및 hydrolyzed yeast protein을 포함하는 CeraDeepTM의 피부장벽, 보습 및 항산화 관련 생리활성을 HaCaT 세포 기반 in vitro 모델에서 확인하고, 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 평가하고자 하였다.
연구 결과, CeraDeepTM은 HaCaT 세포에서 각질형성세포 분화 관련 유전자 및 단백질 발현을 증가시켜 각질층 형성과 관련된 분화 phenotype 조절 가능성을 보였다. 또한 피부장벽 관련 지질대사 인자의 발현을 증가시키고, Oil Red O staining을 통해 세포 내 지질 축적을 증가시키는 양상을 보여 각질형성세포 내 지질대사 조절에 관여할 수 있음을 확인하였다. 보습 관련 인자의 발현과 hyaluronic acid 분비량 또한 증가하여 세포 수준에서 수분 보유 환경 조성과 관련된 보습 기능 조절 가능성을 나타냈다. 더불어 CeraDeepTM은 H2O2 로 유도된 산화 스트레스 조건에서 세포 내 ROS 생성을 감소시켰고, ABTS radical 소거 활성을 보여 항산화 보호 소재로서의 가능성을 확인하였다.
이상의 결과를 종합하면, CeraDeepTM은 특정 단일 효능에만 작용하는 소재라기보다 피부장벽 유지에 필요한 각질형성세포의 구조적 성숙, 지질 환경 조성, 수분 보유 및 산화 스트레스 완화에 복합적으로 관여할 수 있는 소재로 판단된다. 본 연구에서 확인된 각질형성세포 분화 및 피부장벽 관련 지질대사의 증가는 각각 각질층의 구조적 성숙과 세포간 지질 환경 형성에 관여하는 과정으로, CeraDeepTM이 이러한 과정을 통해 피부의 permeability barrier function 유지 및 수분 손실 억제에 기여할 가능성을 나타낸다. 또한 세라마이드 복합체, 식물 유래 오일 및 단백질 유래 성분을 함께 포함하는 조성물의 세포 수준 생리활성을 확인했다는 점에서, 피부장벽 개선 및 보습·항산화 기능을 고려한 다기능성 화장품 소재 개발에 활용될 수 있는 기초자료를 제시하였다는 의의가 있다. 그러나 본 연구는 불멸화 인간각질형성세포주인 HaCaT을 이용한 in vitro 평가에 기반하였으며, normal human epidermal keratinocytes 및 실제 인체 표피와 비교하여 각질형성세포의 분화 양상, 각질층 형성 및 라멜라 지질 구조를 재현하는 데 차이가 있으므로, 본 연구에서 확인된 유전자 및 단백질 발현과 세포 내 지질 축적의 변화가 실제 피부의 물리적 장벽 기능 강화로 직접 이어진다고 해석하는 데에는 한계가 있다. 이에 후속 연구에서는 reconstructed human epidermis와 같은 3D skin model 또는 ex vivo skin model을 활용하여 각질층 및 라멜라 지질 구조의 형성과 함께 TEER, TEWL 등의 permeability barrier function을 평가하고, CeraDeepTM의 피부 적용 가능성과 피부장벽 개선 효과를 보다 구체적으로 검증하는 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다. 향후 본 연구 결과가 피부장벽 강화, 보습 및 항산화 기능을 갖춘 다기능성 화장품 소재 개발에 기초자료로 활용되어, 기능성 화장품 산업의 소재 다양화와 제품 경쟁력 향상에 기여할 수 있기를 기대한다.
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