본 연구에서 사용한 반주름말 추출물은 해양수산부 산하 공공기관인 국립해양생물자원관에서 분양받았다(자원번호 MABIK NP30190010). 분양기관에서 제공한 정보에 따르면, 추출물 제조를 위해 채집한 반주름말을 3회 수세하여 동결건조시킨 다음, 분쇄기를 이용하여 분말 상태의 건조 시료를 확보하였다. 이후 건조 시료 50 g에 70% 에탄올 500 mL를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 초음파 추출한 후(40 kHz), 추출물을 여과지(Whatman, Folded filters, diameter 320 mm, Buckinghamshire, UK)로 여과하였으며 추출 과정을 4회 반복하였다. 획득한 추출물을 진공 회전 농축기(Rotavapor R-300 System Professional; BÜCHI Labortechnik AG, Switzerland)를 이용하여 농축한 다음, 드라이 오븐에서 건조시킴으로써 최종적으로 추출물을 확보하였다. 분양받은 반주름말 추출물은 dimetylsulfoxide (DMSO; Junsei Chemical, Japan)에 용해하여 100 mg/mL 농도로 제조한 후 희석하여 실험에 사용하였다.

시료의 ABTS⁺ 라디칼 소거능은 Bak 등과 Cho 등(Bak et al., 2025; Cho et al., 2012)의 방법을 참고하여 측정하였다. 먼저, ABTS⁺ 라디칼 생성을 유도하기 위해 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammoniumsalt (ABTS) single solution (Invitrogen, Waltham, USA)과 5 mM potassium persulfate (Samchun Chemical, Korea)를 2:1 비율로 혼합하여 암실에서 16시간 동안 방치하였다. 이후 혼합 용액의 흡광도를 microplate reader (LTek, Korea)를 이용하여 734 nm에서 측정함으로써 ABTS⁺ 라디칼 생성을 확인한 다음, 반주름말 추출물(25-400 μg/mL) 10 μL에 ABTS⁺ 용액 50 μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰으며 반응물의 흡광도를 734 nm에서 측정하였다. 반주름말 추출물은 반응 부피 내 희석 배수를 고려하여 제조하였으며 대조군과 양성대조군은 추출물 대신 각각 증류수와 ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA)를 첨가하였다. 각 시료의 ABTS⁺ 라디칼 소거능은 대조군에 대한 비율로 나타내었다.

시료의 DPPH 라디칼 소거능은 Pyeon 등(Pyeon et al., 2017)의 방법을 일부 수정하여 측정하였다. 이를 위해 메탄올을 이용하여 0.1 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH; Sigma-Aldrich) 용액을 제조하였으며, 반주름말 추출물(25-400 μg/mL) 100 μL와 0.1 mM DPPH 용액 50 μL를 혼합하여 10 min간 반응시켰다. 이후 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며 DPPH 라디칼 소거능은 대조군에 대한 비율로 나타내었다. 반주름말 추출물은 반응 부피 내 희석 배수를 고려하여 제조하였으며 대조군과 양성대조군은 추출물 대신 각각 증류수와 ascorbic acid (Sigma-Aldrich)를 사용하였다.

반주름말 추출물 내 포함된 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 각각 Folin-Ciocalteu method와 aluminium chloride (AlCl₃) colormetric method를 이용하여 측정하였다. 총 폴리페놀 함량 측정을 위해 반주름말 추출물(1000 μg/mL) 100 μL와 Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich) 50 μL를 혼합하여 5 min간 유지한 다음, 7.5% Na₂CO₃ (Sigma-Aldrich) 80 μL를 첨가하였으며 20 min 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물 내 포함된 총 폴리페놀의 함량은 gallic acid (Sigma-Aldrich)의 표준검량곡선을 이용하여 mg Gallic acid equivalent (GAE)/g으로 환산하여 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정을 위해 반주름말 추출물(1000 μg/mL) 30 μL, 증류수 30 μL 및 10% AlCl₃ 10 μL를 혼합하여 실온에서 6 min 동안 반응시킨 다음, 5% NaNO2 10 μL를 첨가하여 실온에서 11 min간 반응시켰다. 이후 혼합물에 1 M NaOH 100 μL를 추가한 후 510 nm에서의 흡광도를 측정하였으며 quercetin (Cayman, Ann Arbor, USA)을 이용하여 표준검량곡선을 작성하였다. 추출물 내 포함된 총 플라보노이드 함량은 mg Quercetin equivalent (QE)/g으로 환산하여 나타내었다.

실험에 사용한 B16F10 세포는 한국세포주은행으로부터 분양받았으며, 10% fetal bovine serum (GenDEPOT, USA)과 100 U/mL penicillin-streptomycin (Gibco, USA)이 포함된 RPMI-1640(GenDEPOT) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포 생존율 평가를 위해 B16F10 세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 반주름말 추출물(25-200 μg/mL)을 처리하여 추가로 배양하였다. 48시간 후, 5 mg/mL thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich)가 포함된 배지로 교체하여 3시간 동안 배양한 다음, 생성된 결정을 DMSO로 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포에 추출물 처리 시 DMSO가 세포 생존율 및 생리적 반응에 미치는 잠재적 영향을 배제하기 위해 배양액 내 DMSO 농도가 0.2%를 초과하지 않도록 설정하였으며, 대조군을 포함한 모든 실험군에 0.2% DMSO가 동일하게 포함되도록 하였다.

B16F10 세포 내 멜라닌 생성을 자극하기 위해 200 nM α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH; Sigma-Aldrich)을 배지에 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 반주름말 추출물(50, 100, 200 μg/mL) 또는 arbutin (200 μg/mL, Sigma-Aldrich)은 α-MSH와 동시에 처리하였으며 모든 군에는 0.2% DMSO가 포함되도록 하였다. 이후 배지를 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)으로 세포를 세척한 후 10% DMSO가 포함된 1 N NaOH를 추가하였으며, heating block (Daihan Scientific, Korea)을 이용하여 80℃에서 1시간 동안 세포 내 멜라닌을 용해하였다. 용해된 멜라닌의 흡광도를 405 nm에서 측정하였으며 멜라닌 함량은 세포 내 단백질 양을 Pierce^TM Bradford Plus Protein Assay Reagent (Thermo Scientific, USA)로 정량한 후 나누어 보정하였다.

B16F10 세포 내 tyrosinase 활성은 Moon 등(Moon et al., 2022)의 방법을 일부 수정하여 측정하였다. 멜라닌 함량 측정 방법에 서술 한 바와 동일한 방법으로 B16F10 세포에 시료를 처치하여 48시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고 세포를 용해시키기 위해 1% Triton X-100 (VWR Chemicals, USA)과 protease inhibitor cocktail (50 μM Phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μM pepstatin A, 20 μM leupeptin, 100 μM benzamidine, 50 μM bestatin, GenDEPOT)을 포함하는 PBS를 추가하였다. 이후 원심분리하여 상층액을 회수하였으며 상층액 20 μL와 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (2 mg/mL L-DOPA; Tokyo Chemical Industry, Japan) 80 μL를 혼합하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 생성물의 흡광도를 490 nm에서 측정하였으며 각 샘플의 세포 내 tyrosinase 활성은 멜라닌 함량 측정과 동일한 방법으로 계산하여 나타내었다.

반주름말 추출물의 tyrosinase 저해 활성은 Ishihara 등(Ishihara et al., 1991)을 참고하여 수행하였다. 간략하게는, Mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich)를 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5)를 이용하여 1500 U/mL로 제조한 다음 0.1 M phosphate buffer 110 μL, 반주름말 추출물(50, 100, 200 μg/mL) 10 μL과 mushroom tyrosinase 용액 20 μL를 혼합하였다. 이후 1.5 mM tyrosine (Tokyo Chemical Industry) 20 μL를 추가하여 37℃에서 10 min 동안 반응시킨 다음 microplate reader (LTek)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 반주름말 추출물은 반응 부피 내 희석 배수를 고려하여 농도를 제조하였으며 대조군으로는 증류수를, 양성대조군으로는 arbutin (Sigma-Aldrich)을 사용하여 각 시료의 mushroom tyrosinase 저해율을 대조군에 대한 비율로 나타내었다.

반주름말 추출물에 의한 B16F10 세포 내 단백질 변화를 비교하기 위해 Western blot을 수행하였다. B16F10 세포에 200 nM α-MSH와 반주름말 추출물(100, 200 μg/mL)을 48시간 동안 처치한 후 세포로부터 단백질을 추출하였다. 이를 위해 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 protease inhibitor cocktail (GenDEPOT) 이 포함된 RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM sodium fluoride, 1 mM EDTA, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 0.5% sodium deoxycholate, 1% triton X-100)를 첨가하여 세포를 용해하였다. 이후 원심분리를 통해 상층액을 회수한 다음 Pierce^TM Bradford Plus Protein Assay Reagent (Thermo Scientific)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 동량의 단백질을 8% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 통해 분리한 후 PVDF membrane (Merck Millipore, Burlington, USA)으로 전이시킨 다음, blocking buffer (5% skim milk in Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20; TBST)와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 tyrosinase (1:500, Santa Cruz, Dallas, USA), tyrosinase-related protein 1 (TRP-1, 1:500, Santa Cruz), tyrosinase-related protein 2 (TRP-2, 1:500, Santa Cruz) 또는 β–actin (1:1000, Santa Cruz) 1차 항체를 추가하여 4℃에서 overnight으로 반응시켰다. 이후 membrane을 TBST로 3회 세척한 다음 Peroxidase AffiniPure^® Goat Anti-Mouse IgG (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, USA) 2차 항체를 추가하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, West-Q Pico ECL Solution (GenDEPOT)을 이용하여 단백질 밴드를 X-ray film 에 노출시켰다. 현상된 단백질 밴드의 감도는 ImageJ (Version 1.53e, National Institutes of Health, USA)를 이용하여 정량 분석하였으며 β–actin의 결과값으로 나누어 나타내었다.

B16F10 세포에 200 nM α-MSH와 반주름말 추출물(100, 200 μg/mL)을 처치하여 24 또는 48시간 동안 배양한 후 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa, Tokyo, Japan)를 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 미량분 광광도계(MicroDigital, Korea)를 이용하여 정량한 후 PrimeScript^TM RT Master Mix (TaKaRa)와 혼합하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA와 forward 및 reverse primer, TB Green^® Premix Ex Taq^TM II (TaKaRa)를 혼합한 후 95℃에서 5 s, 60℃에서 30 s, 72℃에서 30 s 조건으로 40회 반복하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 각 유전자의 발현은 Thermal Cycler Dice^® Real time System III (TaKaRa) 소프트웨어를 이용하 여 β-actin mRNA 발현에 대한 상대정량으로 비교하였으며 실험에 사용한 primer 서열은 Table 1에 나타내었다.

모든 데이터는 평균±표준오차(standard error of the mean, SEM)로 나타내었으며 GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, USA)을 이용하여 통계 분석하였다. 모든 실험에 대한 유의성은 One-way analysis of variance (ANOVA)로 확인하였으며 Bonferroni’s Multiple Comparison Test로 사후 검정을 수행하여 p<0.05 이하인 경우 통계적 유의성을 나타내었다.

활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 체내 호흡 과정에서 자연스럽게 생성되는 물질로, 대표적으로 superoxide radical (O₂^·-), hydroxyl radical (^·OH) 등의 자유 라디칼이 있다. 이들은 정상적 생리상태에서 체내 항산화 시스템에 의해 소거되어 적정 수준이 유지되지만, 과도한 생성은 산화적 스트레스를 유발하여 노화의 주요 원인으로 작용한다(Nakai & Tsuruta, 2021). 뿐만 아니라, 멜라닌 생성 과정에서 tyrosinase의 작용에 의해 hydroxyl radical이 발생됨에 따라, 과도한 멜라닌 생성이 피부의 산화적 스트레스 유발과 관련이 있음이 보고되고 있다(Tada et al., 2014). 이에, 라디칼 소거능은 소재의 항산화 및 항노화 효능을 평가하기 위한 기초 생리활성평가 지표로 활용되고 있다(Kim et al., 2019; Kim et al., 2025; Lee et al., 2026; Shin & Kang, 2021). 본 연구에서 ABTS와 DPPH 측정법을 활용하여 반 주름말 추출물의 라디칼 소거능을 평가한 결과, 반주름말 추출물(25-400 μg/mL)은 농도에 따라 ABTS⁺ 라디칼을 약 29.22-98.96% 소거하였으며 DPPH 라디칼을 약 12.24-76.75% 소거하였다(Figure 1). 반주름말 추출물의 라디칼 소거활성은 DPPH 라디칼보다 ABTS⁺ 라디칼에 대해 더욱 크게 나타났는데, 이는 두 가지 라디칼의 특징에 따 른 차이로 볼 수 있다. ABTS는 수용성 및 유기 용매 모두에 용해되어 시료 내 포함된 다양한 친수성 및 소수성 물질의 활성 측정에 용이한 반면, DPPH는 에탄올, 메탄올과 같은 유기 용매에 용해되어 시료 내 포함된 지용성 물질의 활성 측정에 유용하다(Shalaby & Shanab, 2013). 이러한 결과를 종합하면, 반주름말 추출물은 라디칼 소거 활성을 나타내는 수용성 및 지용성 물질 모두를 포함하고 있어 산화적 스트레스 억제에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다. 추가적으로, 동일한 추출물을 70% 에탄올에 용해하여 라디칼 소거능을 측정한 선행 연구(Shin & Kang, 2021)와 비교해보면, 본 연구에서 반주름말 추출물을 DMSO에 용해하였을 때 낮은 농도에서도 항산화 활성이 더욱 높게 나타났다. 이러한 용매에 따른 항산화 활성의 차이는 추출물 내 용출된 활성 성분의 차이에 따른 것으로 추정되며, 향후 반주름말 추출물 내 구체적인 성분 프로파일링 및 지표 성분 규명, 최적의 추출 조건 확립을 위한 후속 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.

폴리페놀은 자연계에 널리 존재하는 물질로, 자외선으로부터 피부를 보호함으로써 피부 노화와 질환을 억제하는 것으로 알려져 있다(Nichols & Katiyar, 2010). 그 중에서도 quercetin, kaempferol, naringenin과 같은 플라보노이드류는 항산화, 항염증, 미백 등의 효능이 보고되어 피부 노화 방지를 위한 소재로 주목받고 있다(Lee & Park, 2022). 이에, 반주름말 추출물 내 포함된 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 각각 32.45±0.52 mg GAE/g과 27.92±1.93 mg QE/g으로 나타났다(Table 2). 반주름말의 성분을 분석한 선행 연구들에 따르면, 해당 추출물은 폴리페놀을 기본 구조로 갖는 phloroglucinols (Wisespongpand & Kuniyoshi, 2003)와 phenolic lipids (Gerwick & Fenical, 1982)를 함유하고 있는 것으로 보고되었다. 폴리페놀은 자유 라디칼에 전자를 공여함으로써 반응성을 감소시키는 특성을 가짐에 따라(Bolaños-Cardet et al., 2026), Figure 1에서 제시한 반주름말 추출물의 라디칼 소거능은 추출물 내 포함된 폴리페놀 화합물의 활성에 기인한 것으로 판단된다. 다만, 현재까지 반주름말에 함유된 플라보노이드류의 구체적인 단일 성분에 대해 명확하게 보고된 바가 없어 이를 규명하기 위한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

반주름말 추출물의 세포 내 활성을 평가하기에 앞서, B16F10 세포 생존율에 미치는 영향을 평가하였다. B16F10 세포에 반주름말 추출물(25-200 μg/mL)을 처리하여 48시간 동안 배양한 후 MTT시약을 첨가하여 반응시켰다. MTT시약은 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 dehydrogenase에 의해 formazan으로 환원됨에 따라, 시료의 세포 독성을 평가하기 위해 주로 사용된다(Huet et al., 1992). 실험 결과, 농도별 반주름말 추출물에 의해 세포 내 formazan의 생성이 대조군 대비 10.54-18.69% 증가하였다(Figure 2). 이는 반주름말 추출물이 B16F10 세포 내 미토콘드리아의 생성 또는 활성을 증가시켰음을 의미하며 해당 농도에서 세포 독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 미백 활성 평가를 위한 반주름말 추출물의 농도를 50-200 μg/mL로 설정하였다.

α-MSH는 B16F10 세포의 melanocortin 1 수용체(MC1R)에 결합하여 세포 내 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성을 촉진시킴에 따라, 시료의 미백 효능을 평가하기 위한 세포 모델에 널리 사용되고 있다(Bahraman et al., 2021; Jang et al., 2010; Kim et al., 2020; Kim & Park, 2025; Moon et al., 2022). 이에 본 연구에서는 B16F10 세포에 200 nM α-MSH와 반주름말 추출물(50, 100, 200 μg/mL)을 48시간 동안 처리한 후 세포 내 멜라닌 함량과 tyrosinase 활성을 측정하였다. 실험 결과, 반주름말 추출물은 α-MSH 단독 처리군 대비 세포 내 멜라닌 함량을 농도 의존적으로 감소시켰으며 각각 약 9.23%, 14.34%, 26.51%의 억제율을 나타내었다(Figure 3A). 멜라닌의 생성은 멜라닌생성세포 내 멜라노좀에서 tyrosinase 가 아미노산인 tyrosine을 L-DOPA로 전환시키면서 시작되며, 이후 L-DOPA가 dopaquinone으로 산화된 후 단계적 화학반응을 거쳐 최종적으로 멜라닌이 합성된다(D’Mello et al., 2016). 따라서, tyrosinase 활성 저해는 시료의 멜라닌 생성 억제 효능을 평가하기 위한 핵심 지표로 활용되고 있다(Zolghadri et al., 2023). 반주름말 추출물의 세포 내 tyrosinase 활성 억제능을 확인하기 위해 세포 용해액에 기질인 L-DOPA를 첨가하여 반응시킨 결과, 해당 추출물은 α-MSH 단독 처리군 대비 tyrosinase 활성을 약 6.76%, 11.58%, 20.15% 억제하였다(Figure 3B). 추가적으로, mushroom tyrosinase 를 이용한 cell-free 저해활성시험에서도 반주름말 추출물(50, 100, 200 μg/mL)은 tyrosinase 활성을 각각 17.37%, 39.41%, 55.08% 억 제하였으며, 이를 통해 해당 추출물이 효소와 기질간의 반응을 직접적으로 저해함을 확인하였다(Figure 3C).

기존 갈조류의 미백 활성에 관한 선행 연구들을 살펴보면, 고리매, 미역쇠, 왜모자반, 감태, 톳 추출물(100 μg/mL) 및 아롱부챗말 추출물(0.01-0.5%)이 멜라닌 생성을 감소시키는 것으로 보고된 바 있다 (Jeon et al., 2013; Kim et al., 2020). 실험 방법의 차이로 인해 절대적인 수치를 직접적으로 비교하기는 어려우나, 본 연구에서 나타난 반주름말 추출물의 효능은 기존에 보고된 다른 갈조류들의 효능과 비교하였을 때 새로운 미백 기능성 소재로서 충분한 경쟁력을 가지고 있는 것으로 판단된다. 갈조류에 포함된 성분의 미백 활성과 관련하여, α-MSH로 자극된 B16F10 세포에서 fucosterol의 tyrosinase 활성 억 제 효능(Kim et al., 2020)과 fucoxanthin의 tyrosinase 저해 활성 및 멜라닌 생성 억제 효능이 보고된 바 있다(Shimoda et al., 2010). 또한, phlorotannin계 화합물인 dieckol과 eckol은 tyrosinase와 기질 간의 반응을 저해하며 B16F10 세포 내 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다(Heo et al., 2009). 따라서 본 연구에서 확인된 반주름말 추출물의 미백 활성은 추출물에 포함된 다양한 생리활성 성분의 작용에 의해 기인한 것으로 사료되며, 특히 갈조류에 존재하는 fucosterol, fucoxanthin 및 phlorotannins 등이 이러한 활성에 기여했을 가능성을 고려할 수 있다. 다만, 반주름말 추출물의 미백 활성 및 작용기전을 보다 명확하게 규명하기 위해서는 추출물 내 활성 성분의 분리 및 동정과 각 성분에 대한 효능 평가가 선행될 필요가 있다. 나아가, tyrosinase 활성 저해뿐만 아니라 cyclic adenosine monophosphate (cAMP)–protein kinase A (PKA)–cAMP response element-binding protein (CREB)–microphthalmia-associated transcription factor(MITF) 경로를 비롯한 멜라닌 생성 관련 신호전달경로에 미치는 영향 을 규명하는 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Tyrosinase와 tyrosinase-related proteins (TRPs)는 멜라닌 생성에 관여하는 주요 효소로, 미백 및 색소침착 개선을 위한 연구의 핵심 표적으로 활용되고 있다(D’Mello et al., 2016; Jang et al., 2010; Kim et al., 2020; Park et al., 2024). 반주름말 추출물의 멜라닌 생성 저해 기전을 규명하기 위해, 앞선 Figure 3의 결과에서 α-MSH 단독 처리군 대비 통계적으로 유의미한 멜라닌 감소 효능을 나타낸 100 및 200 μg/mL 농도를 유효 농도로 설정하여 후속 실험을 수행하였다. B16F10 세포에 200 nM α-MSH와 반주름말 추출물(100, 200 μg/mL)을 48시간 동안 처리한 후 세포 내 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 단백질의 양을 평가하였다. 그 결과, 반주름말 추출물 처리에 의해 tyrosinase 단백질이 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Figure 4A). Tyrosinase는 rate-limiting enzyme으로서, 멜라닌 생성 과정에서 전체 반응 속도를 결정하는 핵심 인자임을 고려할 때(Bae-Harboe & Park, 2012), 반주름말 추출물은 앞서 확인한 tyrosinase의 활성뿐만 아니라 단백질의 양도 감소시킴으로써 멜라닌 생성의 핵심 단계를 억제하는 것으로 판단된다.

반면, 반주름말 추출물 처리에 의해 TRP-1과 TRP-2 단백질의 양은 α-MSH 단독 처리군과 유사한 수준으로 나타나 해당 단백질들의 감소에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다(Figure 4B, 4C). 일반적으로 TRP-1은 tyrosinase의 활성화 및 안정화, 멜라노좀의 합성, 그리고 eumelanin과 pheomelanin의 비율을 조절함으로써 멜라닌 생성에 관여하지만 동시에 과산화효소(peroxidase)로 작용하여 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다(Videira et al., 2013). TRP-2는 tyrosinase와 유사한 작용을 나타내지만 멜라닌 생성 세포의 증식과 분화, 생존에도 관여한다(Nishioka et al., 1999; Videira et al., 2013). 최근의 연구에 따르면, α-MSH는 NADPH oxidase 1/4 (NOX1/4)를 활성화하여 B16F10 세포 내 ROS 생성을 촉진시키는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2026). 이와 관련하여 TRPs의 역할을 고려해 볼 때, α-MSH 자극에 대한 B16F10 세포 내 TRP-1과 TRP-2의 증가는 멜라닌 생성과 관련이 있기도 하지만, 산화적 스트레스에 대응하기 위한 세포의 방어작용으로도 해석할 수 있다. 이러한 문헌적 고찰에 비추어 볼 때, 반주름말 추출물에 의해 TRP-1이 감소하지 않은 결과는 세포를 보호하기 위한 작용으로 추측할 수 있다. 또한, 앞서 제시한 Figure 2의 B16F10 세포 생존율 결과에서 농도별 반주름말 추출물 처리에 의해 세포 생존율이 증가한 현상은 TRP-2 활성과 관련이 있을 것으로 사료된다. 이러한 결과를 종합하면, 반주름말 추출물이 α-MSH 자극에 대해 TRP-1과 TRP-2 단백질 수준은 유지하면서 tyrosinase 단백질만 선택적으로 억제한 것은, 해당 추출물이 미백 활성을 나타냄과 동시에 세포를 보호하는 작용을 가짐을 시사한다. 다만, 본 연구에서는 해당 세포 모델에서 반주름말 추출물 처리에 의한 peroxidase나 NOX1/4 등의 활성 여부는 확인하지 않은 한계가 존재한다. 따라서 반주름말 추출물의 이러한 이중적 작용을 명확하게 입증하기 위해서는, 세포 내 산화 환원 항상성 조절과 세포 생존에 미치는 구체적인 영향 및 기전을 규명하는 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.

반주름말 추출물이 α-MSH로 자극된 B16F10 세포에서 tyrosinase 단백질만 선택적으로 감소시키는 것을 확인함에 따라, 전사 단계에서의 변화를 확인하기 위해 앞선 Figure 4에서 확인한 동일한 농도에 대해 qRT-PCR을 수행하였다. B16F10 세포에 200 nM α-MSH와 반주름말 추출물(100, 200 μg/mL)을 24 또는 48시간 동안 처리한 후 mRNA 발현을 평가한 결과, 반주름말 추출물의 처리 시간과 농도에 따라 tyrosinase mRNA 발현이 유의하게 억제되었다(Figure 5A). 반면, TRP-1 과 TRP-2 mRNA 발현은 단백질 분석 결과와 동일하게 반주름말 추출물에 의해 감소되지 않는 것으로 나타났다(Figure 5B, 5C). 추가적으로, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 유전자 발현을 총괄하는 전사 인자인 MITF의 mRNA 발현의 변화를 확인하였다. 그 결과, α-MSH의 처리 시간이 증가할수록 MITF mRNA 발현이 증가하였으나, 반주름말 추출물에 의해 감소되지 않고 α-MSH 단독 처리군과 유사한 수준으로 유지되었다(Figure 5D). 반주름말 추출물에 의해 MITF mRNA 발현이 억제되지 않았음에도 불구하고 tyrosinase의 mRNA 발현이 특이적으로 감소한 결과를 다음과 같은 가능성으로 해석해 볼 수 있다.

첫번째로는 반주름말 추출물이 MITF와 tyrosinase 프로모터 간의 특이적 결합을 억제했을 가능성이다. MITF는 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 프로모터에 공통으로 존재하는 M-box에 결합하여 각 유전자의 전사를 유도한다(D’Mello et al., 2016; Pierrat et al., 2019). 흥미롭게도, tyrosinase 프로모터에는 M-box 외에도 전사 개시점과 가까운 initiator E-box와 tyrosinase distal element (TDE)를 추가적으로 포함하고 있으며, 해당 부위에도 MITF가 결합하여 전사 활성을 더욱 증폭시키는 것으로 알려져 있다(Steingrímsson et al., 2004). 이에 따라, 반주름말 추출물은 MITF가 공통의 M-box 이외에 다른 부위에 결합하는 것을 저해하여 tyrosinase mRNA 발현만 선택적으로 억제하였을 가능성을 고려해 볼 수 있다. 두번째 가능성으로는, 반주름말 추출물에 의한 MITF의 공동 전사 인자(co-transcription factor)의 발현 또는 활성 억제이다. MITF가 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 전사를 유도하기 위해서는 lymphoid enhancer-binding factor (LEF1), Paired box 3 (PAX3), Sry-related HMG box 10 (SOX10) 등과 같은 공동 전사 인자의 역할이 필요하다(Wan et al., 2011). 특히, tyrosinase 전사에서 LEF-1의 중요성이 보고됨에 따라(Wang et al., 2015) 반주름말 추출물이 MITF에 대한 직접적인 영향보다는 공동 전사 인자의 활성에 영향을 미쳤을 가능성을 고려해 볼 수 있다. 다만, 본 연구에서는 MITF의 mRNA 발현만 비교했을 뿐 단백질 수준에서의 활성은 확인하지 않았으므로 이러한 가능성들을 입증하기 위해서는 반주름말 추출물에 의한 MITF 및 이를 조절하는 상위 신호전달기전(cAMP/PKA/CREB 등)의 활성과 해당 유전자들의 전사 과정에 미치는 영향에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다. 종합하면, 반주름말 추출물은 α-MSH로 자극된 B16F10 세포에서 tyrosinase mRNA와 단백질 발현을 선택적으로 억제함으로써 멜라닌 생성 저해 작용을 나타내었다.