브라질린의 RAW264.7 세포에서의 항염효과
Anti-inflammatory Effect of Brazilin in RAW264.7 Cells
巴西木素 (Brazilin) 在RAW264.7细胞中的抗炎作用
Article information
Abstract
목적
본 연구는 브라질린에 의한 RAW264.7 세포의 항염 효과를 확인하기 위하여 수행되었다.
방법
브라질린이 RAW264.7세포에 항염효과를 나타내는지 확인하기 위하여, CCK-8 실험법을 통한 세포생존률 측정, 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응을 통한 싸이토카인의 유전자 발현양상, 효소결합면역흡착검사법을 통한 PGE2와 산화질소의 생성 정도를 확인하였다.
결과
RAW264.7 세포에 브라질린을 처리하여 세포독성을 확인한 결과, 1 μg/mL 이하의 농도로 처리시 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. RAW264.7 세포는 LPS 자극에 의해 세포질 내 소과립이 증가되나 브라질린을 처리하면 대조군과 유사하게 세포질 내 소과립이 감소하는 경향을 보였다. 본 연구를 통해 브라질린이 인터류킨1α (interleukin 1α, IL1α), 인터류킨1β (interleukin 1β, IL1β), 인터류킨6 (interleukin 6,IL6), tumor necrosis factor α (TNFα) 유전자의 발현을 감소시킴을 확인할 수 있었다. 또한 산화질소의 생성을 감소시키고 PGE2의 생성을 감소시킴을 통해 브라질린의 항염효과를 확인할 수 있었다.
결론
본 연구를 통해 브라질린의 항염효과를 확인하였고, 브라질린이 항염 및 아토피를 타겟으로 하는 화장품 원료로서의 가능성을 제시하였다. 브라질린이 피부미용, 화장품, 건강식품 등의 산업 등에도 응용될 수 있을 것으로 여겨지며 그 가능을 확인하기 위해 브라질린이 염증세포에 미치는 기전연구가 필요할 것으로 보인다.
Trans Abstract
Purpose
This study aimed to determine the skin anti-inflammatory effect of brazilin on RAW264.7 cells.
Methods
To determine anti-inflammatory effects of brazilin on RAW264.7 cells, we measured cell viability, gene expressions, and prostaglandin E2 (PGE2)/nitric oxide (NO) production.
Results
Cells were treated with brazilin to confirm cytotoxicity; no toxicity was observed when cells were treated at a concentration of ≤1 μg/mL. In RAW264.7 cells, the number of intracellular granule were increased after lipopolysaccharide (LPS) treatment; however, brazilin treatment decreased intracellular granules similar to that in the control group. In this research, we elucidated the anti-inflammatory effects of brazilin on the mRNA expression of interleukin 1 alpha (IL1α), interleukin 1 beta (IL1β), interleukin 6 (IL6), and tumor necrosis factor alpha (TNFα ) and PGE2/NO production. Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) showed that brazilin administration increased the mRNA levels of IL1α /IL1β /IL6 /TNFα genes, and analysis of PGE2/NO also revealed that brazilin induces anti-inflammatory effects.
Conclusion
We identified the anti-inflammatory effect of brazilin, and found that brazilin can be a potent cosmetic ingredient for anti-inflammatory agent for atopic dermatitis. Based on this result, we believe that brazilin has the potential to be used in not only cosmetics, but also medicine or healthcare food.
Trans Abstract
目的
探索巴西木素在RAW264.7细胞中的抗炎作用。
方法
为了确定巴西木素对RAW264.7细胞的抗炎作用，测量了细胞生存能力，细胞因子基因表达和前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2）和一氧化氮（nitric oxide, NO）的产生。
结果
在这项研究中，阐明了巴西木素对白细胞介素1α（interleukin 1α, IL1α），白细胞介素1β（interleukin 1β, IL1β ），白细胞介素6（interleukin 6, IL6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNFα）mRNA表达和PGE2以及NO产生的抗炎作用。实时逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR）显示，brazilin可增加IL1α、IL1β、IL6、 TNFα基因的mRNA水平，PGE2和NO检测也显示巴西木素可诱导抗炎作用。
结论
从以上结果，确定了巴西木素的抗炎作用，该结果表明巴西木素可以成为抗炎和特应性皮炎的有效化妆品成分。基于这一结果，将来进一步研究巴西木素的机制，不仅要开发化妆品，还要开发药品或保健食品。
Introduction
염증은 손상된 세포, 자극원 및 박테리아를 포함한 유해한 자극에 대한 조직 보호 면역 반응으로 알려져 있다(Albina & Reichner, 1995). 그러나 염증이 과도하게 유발되면 아테로마성동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 암 및 신경 퇴행성 장애 등과 같은 다양한 질병을 통해 세포 및 조직 손상을 유도 할 수 있다(Albina & Reichner, 1995).
면역계는 화학적, 물리적 또는 감염성 스트레스에 대한 염증 매개 반응을 일으킨다(Kim et al., 2004). 대식세포는 면역 반응 동안 여러 생물학적 과정에 중요한 역할을 하는 세포로써 염증반응에서 항원 제시, 식균 작용 및 면역 조절과 같은 세 가지 주요 기능을 담당하기 위해 다양한 싸이토카인 및 성장인자를 방출한다(Akira & Takeda, 2004; Gomez et al., 2005). 손상되거나 활성화된 대식세포는 다양한 염증 매개체를 방출함으로써 염증 반응을 조절할 수 있다(Fujiwara et al., 2005). Lipopolysaccharide (LPS)는 대식세포의 toll-like receptor (TLR)에 결합하여 세포 내 신호전달경로인 mitogenactivated protein kinase (MAPK)와 nuclear factor kappa beta (NFĸB) 신호의 활성화를 유도하고, nitric oxide (NO), PGE2와 같은 염증성 매개인자를 분비하고 interleukin 1 (IL1), interleukin 6 (IL6), tumor necrosis factor α (TNFα)와 같은 염증성 싸이토카인을 증가시킨다(Akira & Takeda, 2004; Gomez et al., 2005). 이렇게 생성된 염증 매개인자들은 주변세포의 면역기능을 활성화시키는 중요한 역할을 하기도 하지만 과량의 NO와 PGE2 등은 질병을 악화시키는 원인이 되기도 한다(Kim et al., 2004). NO는 염증의 대표적 지표물질로, 일반적인 NO는 박테리아와 같은 미생물을 죽이거나 종양을 억제하는 중요한 역할을 하지만 염증에서의 과도한 NO는 조직손상, 유전적 변이 및 신경손상을 유발한다(Gabay, 2006; Im, 2014; Lee et al., 2014; Van Triel et al., 2010). 또한 cyclooxygenase 2 (COX2)는 arachidonic acid로부터 염증 매개물질인 PGE2 생성을 유도하는 효소로서 iNOS와 함께 염증반응에 중요한 역할을 담당한다. LPS에 의한 대식세포의 활성 시 NO와 PGE2는 IL 1 및 TNFa와 같은 염증성 싸이토카인 등을 생산한다(Horwood et al., 2006; Hirohashi & Morrison, 1996). 따라서 NO의 생성이나 PGE2, 염증성 싸이토카인의 발현억제는 염증성 질환을 치료하거나 예방하는데 있어 중요한 목표가 된다.
브라질린(brazilin, (6a S-cis)-7,11b-dihydrobenz[b] indeno[1,2-d]pyran-3,6a,9,10(6H)-tetrol)은 말레이시아, 인도, 중국 남부 등의 열대 아시아에 분포하는 소목(Caesalpinia sappan L.)의 주성분으로 알려져 있다. 소목은 천연의 적색 색소를 함유하고 있는데, 염료나 산 및 알칼리 지시약 또는 식품 첨가물 등으로 사용되어 왔다(Puchtler et al., 1986). 최근의 연구결과에 따르면 월경폐색, 어혈에 의한 타박손상, 혈당저하, 고혈압, 항염작용, 항균작용, 항노화 등의 다양한 생리학적 효능을 지녔다고 보고되었다(Hwang et al., 1998; Hwang & Shim, 2018; Moon et al., 1992). 하지만 브라질린이 RAW264.7 세포에서의 염증 완화에 효과적인지에 대한 연구는 없다. 본 연구에서는 LPS에 의해 자극이 유발된 RAW264.7 세포에 브라질린을 처리하였을 때의 항염증 효과를 확인하였다. 브라질린에 의한 RAW264.7 세포 생존률, mRNA와 NO, PGE2 단백질 발현을 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 분석, real-time RT-PCR 및 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 분석법으로 각각 확인하였다.
Methods
1. 세포배양
RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Korea)을 통해 구입하여 사용하였다. Fetal bovine serum (FBS; Welgene, Korea)과 penicillin/streptomycin (Welgene)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Welgene)을 RAW264.7 대식세포 배양에 사용했다. RAW264.7 대식세포는 5% CO2, 37℃, 습도 100% 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
2. 세포 생존율 검증
세포 생존율은 CCK-8 (Dojindo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 세포를 조직 배양 접시에 접종하고 24 h 동안 안정화 시킨 후, 브라질린을 농도 별로 24 h 처리하였다. 이후 phenol-red가 들어있지 않은 DMEM에 CCK-8 시약을 1/10로 희석하여 인큐베이터에서 1 h 동안 반응시켰다. Microplate reader (BioTek, USA)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하고, 세포가 첨가되지 않은 대조군의 흡광도를 기초로 하여 세포 생존율을 계산하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 표기하였다.
3. 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)
Life technologies사의 TRIzol Reagent (USA)를 사용하여 세포의 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로부터 SuperiorScript III 역전사효소 키트(Enzynomics, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였으며, RAW264.7 대식세포 표지인자의 발현을 비교 측정하기 위하여 StepOnePlus PCR machine (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 Real-time RT-PCR을 진행하였다. 실험에 사용된 Taqman Gene expression assay (Applied Biosystems)는 Table 1에 정리하였다.
Gene name and assay ID number in real-time RT-PCR analysis
4. NO 정량
RAW264.7 대식세포를 35 mm 조직 배양 접시에 40×105 cells로 분주하고 24 h 동안 전 배양한 후, lipopolysaccharide (LPS; Sigma-Aldrich, USA) (1 μg/mL)와 브라질린을 첨가하여 24 h 동안 배양 후, 배양액을 수집하여 원심분리한 후 상등액 100 μL를 사용하여 NO의 생성량을 NO detection kit (iNtRON, Korea)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 프로토콜을 간략히 기술하면, 상등액 100 μL에 50 μL의 N1 버퍼(iNtRON, Korea)를 첨가하여 10 min간 상온에 반응시키고 N2 버퍼(iNtRON)를 50 μL 추가하여 10 min 간 반응시킨 후 520-560 nm의 파장에서 ELISA reader (EPOCH; BioTek, USA)로 흡광도를 측정하였다.
5. PGE2-효소결합면역흡착검사법
브라질린이 PGE2의 생성에 끼치는 영향을 알아보기 위하여 RAW264.7 대식세포를 24 h 동안 인큐베이터에서 전 배양한 후, 1 μg/mL의 LPS와 브라질린을 농도별로 첨가하여 6 h 동안 배양하였다. PGE2-ELISA kit (Pierce Endogens, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜을 따라RAW264.7 대식세포가 분비하는 배양액 내의 PGE2의 양을 측정하였다.
6. 통계분석
통계처리는 Student's t-test방법을 이용하여 유의 수준을 0.05 (p<0.05)로 하여 검정하였다.
Results & Discussion
1. 브라질린의 농도별 세포 생존율 분석
본 연구에서 사용된 RAW264.7 대식세포는 마우스 유래 대식세포주이며, LPS에 의해 염증반응이 활성화되어 염증성 싸이토카인을 방출하는 것으로 알려져 있다. 대식세포는 인체 전반에 분포하고 있으며 염증성 인자에 즉각적인 방어를 제공하는 면역세포이며, 후천성 면역을 유도하는 항원제시 세포로서의 역할 및 다양한 싸이토카인을 분비하는 세포이다(Lawrence et al., 2002). 브라질린의 항염증 효능을 확인하기에 앞서 연구에 사용하고자 하는 브라질린의 독성여부를 확인하기 위하여 CCK-8 assay를 수행하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않았고 브라질린은 1 mg/mL, 100, 10, 1 μg/mL, 100, 10, 1 ng/mL의 농도로 각각 처리하여 세포 생존율을 측정하였다(Figure 1). 10 μg/mL 이상의 농도에서 RAW264.7 대식세포의 생존율이 유의성 있게 감소하였고, 1 μg/mL 이하의 농도로 처리시에는 RAW 264.7 대식세포의 생존율이 대조군과 유사하여 본 실험에서는 1 μg/mL, 100, 10 ng/mL의 브라질린을 처리하여 추가실험을 진행하였다.
Cytotoxicity of brazilin in RAW264.7 cells
RAW264.7 cells (4×103 cells/well) were seeded in 96-well tissue culture plate and treated brazilin extracts for 24 h. Cell viability assay was measured by CCK-8 solution. These results are presented as the mean± standard deviation of the percentage of control optical density in triplicate. * means compared to control (*p<0.05).
2. 브라질린이 RAW264.7 세포의 형태에 미치는 영향
LPS는 대식세포를 활성화시키는 인자로 대식세포의 형태를 급격히 변화시키는 물질로 알려져 있다(Xu et al., 2015). 특별히 항염물질은 LPS에 의해 변화가 유발된 대식세포의 형태를 회복시킨다고 알려져 있다(Hong et al., 2002; Park et al., 2011). 따라서 본 연구에서 브라질린이 LPS에 의해 자극이 유도된 RAW264.7 세포의 형태를 회복시키는지 확인하기 위하여 위상차 현미경(CKX41; Olympus, Japan) (배율: X400)을 통하여 확인하였다. 대조군 세포는 일반적으로 배양접시 바닥 면에 넓게 부착되기 보다는 구형의 형태로 부착되어 있고 세포질 내 소과립의 생성이 적은 반면, LPS로 자극이 유발된 처리군은 위족과 유사한 형태를 보이며 배양접시 바닥 면에 넓게 부착되고 세포질 내 소과립이 증가되어 있는 양상을 보인다. 브라질린을 각 농도별로 24 h 처리한 실험군 중 특별히 10 ng/mL의 브라질린을 처리한 실험군에서 대조군과 유사한 형태로 회복이 됨을 확인할 수 있었다(Figure 2). 이는 브라질린이 LPS에 의한 대식세포의 형태학적 변화를 감소시킴을 설명하며, 이러한 형태학적 변화 및 회복이 대식세포의 기능에 미치는 영향에 대한 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것으로 사료된다.
Effects of brazilin on the LPS-activated morphological changes in RAW 264.7 cells.
The morphologies of RAW264.7 cells were visualized with a phase contrast microscopy (X400). The cells were treated with brazilin for 24 h. Scale bar: 20 μm. LPS, lipopolysaccharide.
3. 브라질린이 NO 생성에 미치는 영향
체내에서 NO는 세균과 종양을 제거하고 신경전달을 매개하거나 혈압을 조절하는 등 다양한 역할을 담당하는 중요한 인자로 알려져 있다(Lee et al., 2014). 그러나 높은 수준으로 생성되는 NO는 조직과 신경의 손상을 유발하고, 유전자의 변이를 유도하거나, 부종을 유발하는 등 과도한 염증반응을 일으킨다(Gabay, 2006; Im, 2014; Van Triel et al., 2010). 본 연구에서 브라질린의 NO 감소 효능을 확인한 결과, LPS에 의해 8.8 μM 농도로 생성된 NO가 10 ng/mL의 브라질린을 처리하였을 때 4.7 μM로 나타나, LPS 처리군에 비해 NO 생성이 유의성 있게 감소한 것으로 나타났다(Figure 3A).
Effects of brazilin on NO synthesis in RAW 264.7 cells
RAW264.7 cells were seeded in 35 mm culture dish, treated with brazilin for 24 h. And medium of the cell were collected and analyzed for NO detection kit (A). Real-time RT-PCR analysis of the iNOS (B). The data represent the mea±standard deviation of three independent experiments. *means compared to control, **means compared to LPS-treated condition (*,**p<0.05). NO, nitric oxide; iNOS, inducible nitric oxide synthase; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction.
LPS는 대식세포에서 iNOS라는 염증매개 인자의 생성을 촉진하여 NO의 생성을 증가시킨다(Namazi, 2004). 따라서 NO를 증가시키는 효소인 iNOS 유전자 발현을 브라질린이 감소시키는지 확인하고자 Real-time RT-PCR을 수행하였다. iNOS의 발현이 LPS 처리군에서 현저히 증가하였으나 10 ng/mL의 브라질린을 처리한 세포주에서는 LPS 처리군 대비 유의성 있게 감소하였다(Figure 3B).
4. 브라질린이 PGE2의 생성에 미치는 영향
Prostaglandin (PG)는 arachidonic acid로부터 유래한 불포화지방산으로 염증반응을 유도하는 호르몬으로 알려져 있다(Yun et al., 2008). PG의 한 종류인 PGE2는 염증반응에 깊이 관여하고, cyclooxygenase-2 (COX2) 유전자에 의하여 생성된다. COX2가 과발현할 경우에는 PGE2의 생성이 증가되어 통증, 발열 및 염증반응이 유발된다(Harris et al., 2002; Namazi, 2004). 브라질린의 항염 효능을 확인하기 위하여 브라질린의 PGE2 감소 여부를 분석한 결과, LPS 처리군에서는 PGE2의 생성이 22.2 μg/mL로 대조군에 비해 증가하였다. 그에 비해 10 ng/mL의 브라질린을 처리하였을 때에는 PGE2의 생성이 9 μg/mL로 나타나 LPS 처리군에 비해 PGE2 생성이 현저히 감소하였다(Figure 4A). COX2 유전자의 발현은 LPS 처리군에서 2.6배 증가하였으나 10 ng/mL의 브라질린을 처리한 세포주에서는 유의성 있게 감소하였다(Figure 4B).
Effects of brazilin on PGE2 synthesis in RAW 264.7 cells
RAW264.7 cells were seeded in 35 mm tissue culture dish, treated with brazilin for 24 h. And medium of the cell was collected and analyzed for PGE2-ELISA (A). Real-time RT-PCR analysis of the COX2 (B). The data represent the mean±standard deviation of three independent experiments. *means compared to control, **means compared to LPS-treated condition (*,**p<0.05). PGE2s , prostaglandin 2; COX2, cyclooxygenase 2; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay
5. 브라질린이 염증성 싸이토카인의 생성에 미치는 영향
피부에서 나타나는 만성적인 염증은 피부질환 뿐 아니라 피부의 노화를 촉진시키는 인자가 된다(Noman et al., 2009; Shon et al., 2013; Lee et al., 2014). IL1α와 IL1β는 다양한 면역반응, 염증과정 및 조혈에 관여하는 싸이토카인으로 활성화된 대식세포와 면역반응이 유도된 B 림프구 및 섬유아세포 등에서 생성되는 염증의 강력한 매개체이다(Ban et al., 2011; Lord et al., 1991). 특별히 IL1β는 염증부위에 림프구와 호중구 등의 염증세포 침윤을 상승시키는 싸이토카인으로 알려져 있다(Baek et al., 2012; Roitt et al., 2001). IL6는 B 림프구의 성장과 분화를 유도하고, 알러지를 포함한 만성적 염증성 질환을 유발한다고 알려져 있다(Gabay, 2006; Lee et al., 2014). 또한, TNFα는 염증초기에 염증 부위로 호중구를 유인하여 부종을 유발시키고, 급성 면역반응을 유도하는 인자이다(Zhang et al., 1992).
LPS는 대식세포에서 인터류킨류와 TNFα, iNOS 등의 염증 매개 인자의 생산을 촉진한다. 본 실험에서는 1 μg/mL 농도의 LPS를 처리하여 대식세포의 염증반응을 유도하였다. 본 연구에서 브라질린의 염증성 싸이토카인의 감소효과를 확인한 결과, IL1α는 LPS 처리군에 의해 9.6배 증가하였으나 10 ng/mL의 브라질린을 처리하였을 때 36% 가량 발현이 감소하였다(Figure 5A). IL1β는 10 ng/mL의 브라질린을 처리하였을 때 LPS 처리군에 비하여 23% 가량 발현이 감소하였다(Figure 5B). IL6는 1 μg/mL, 100, 10 ng/mL의 브라질린을 처리하였을 때 LPS 처리군에 비하여 각각 21%, 31%, 41% 가량 발현이 감소하였다(Figure 5C). TNFα는 브라질린 1 μg/mL, 100, 10 ng/mL의 농도에서 LPS 처리군에 비해 각각 28%, 27%, 60% 가량 발현이 감소하였다(Figure 5D).
Effects of the brazilin on the expressions of inflammatory cytokines.
Real-time RT-PCR analysis of the pro-inflammatory transcription factors such as IL1α (A), IL1β (B), IL6 (C), and TNFα (D). The graphs are shown as the mean±standard deviation of three independent experiments. *means compared to control, **means compared to LPS-treated condition (*,**p<0.05). IL1α, interleukin 1 α; IL1β, interleukin1β; IL6, interleukin 6; TNFα, tumor necrosis factor α; LPS, lipopolysaccharide; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction.
Conclusion
피부는 노화에 의하여 주름이 생성되고 두꺼워지고 염증 등의 증상이 난다. 자외선과 미세먼지, 세균 등과 같은 외부환경에 의해 피부는 활성산소종과 NO의 연쇄 반응을 통해 노화가 촉진되고 염증질환 등이 발생한다(Kim et al., 2011; Talwar et al., 1995). 또한 노화는 성체 내 존재하는 구성세포의 감소, 혹은 기능저하에 의해 정상적인 기능을 하는 조직으로의 재생 기능을 하지 못하게 된다(Jones & Rando, 2011; Kirkwood, 2005).
본 연구에서 브라질린을 RAW264.7 대식세포에 처리할 적절한 농도를 확인할 수 있었다. 1 μg/mL 이하의 농도에서는 대식세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 Figure 1에서 확인하였다. 그리고 10 ng/mL 농도의 브라질린이 LPS에 의해 자극이 유도된 대식세포의 형태변화를 대조군과 유사하게 회복시킬 수 있는 효능을 확인할 수 있었다(Figure 2). iNOS , COX2 , IL1α , IL1β , IL6와 TNFα의 유전자 발현 측정과 NO 생성량 측정, PGE2 단백질 발현 측정에서 10 ng/mL 농도의 브라질린이 유의성 있게 LPS에 의해 증가된 염증에 관여하는 인자의 발현이 회복되는 결과를 나타내었다(Figure 3-5). 이는 브라질린이 새로운 피부 염증개선 후보물질로서의 가능성을 보여준다.
본 연구에서 브라질린이 염증에 관여하는 전사인자의 발현을 억제시켰으며, NO와 PGE2 등의 생성 모두 농도 의존적으로 감소시킴을 통하여 항염증 효능을 확인하였고, 염증성 질환 및 피부노화를 개선하는 치료제 또는 기능성 화장품 원료로서 브라질린이 유용할 수 있음을 보여주는 기초적인 자료가 될 것으로 사료된다. 대식세포의 형태와 LPS와의 관계, 그리고 항염 소재가 대식세포의 형태를 회복하는 기전에 대한 기초연구가 진행되어야 할 것으로 보인다. 또한 향후 브라질린이 어떠한 기전으로 LPS에 의해 염증이 유발된 피부를 개선하는지에 대해 추가연구와 심도있는 임상연구가 필요할 것으로 보인다.
Acknowledgements
이 논문은 2019학년도 세명대학교 교내학술연구비 지원에 의 해 수행된 연구임.