인간 피부 섬유아세포에서 메밀꿀의 항산화 효과 및 광노화 개선 효과에 관한 연구
Potential Antioxidant and Antiphotoaging Effects of Fagopyrum esculentum Honey on Human Dermal Fibroblasts
荞麦蜂蜜对人皮肤成纤维细胞的潜在抗氧化和抗光老化作用
Article information
Abstract
목적
본 연구는 메밀꿀(F. esculentum honey)이 인간 피부 섬유아세포(HDFs) 내의 콜라겐 및 콜라겐분해효소 발현 여부를 통해 자외선(UV) 조사에서도 손상된 인간 피부 섬유아세포에 대한 항산화 효과를 입증함으로 메밀꿀이 피부 노화와 관련하여 기능성 화장품소재으로 활용 가능성을 확인하고자 한다.
방법
메밀꿀의 항산화 효능을 확인하기 위해 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량, F. esculentum honey의 DPPH radical 소거능을 이용하여 분석하였다. HDFs를 메밀꿀 처리에 따른 세포 생존율과 HDFs 대상으로 정량적 qRT-PCR분석을 통해 콜라겐과 콜라겐 분해효소의 발현량을 분석하였고, UV에 의한 세포 내 활성산소종(ROS) 정량 분석을 통해 메밀꿀의 효능을 분석하였다. 또한 UV에 의해 손상된 세포 복구력과 MMP 억제 및 콜라겐 생성을 유도하는 mRNA의 발현 양상을 통해 메밀꿀의 효능을 분석하였다.
결과
메밀꿀의 항산화능을 확인하기 위해 메밀꿀의 농도별 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거능을 측정한 결과 농도 의존적으로 증가하였다. 이에 세포 독성 평가를 HDFs에 진행한 결과, 세포 생존율이 90% 이상 관찰되었다. 실시간 중합효소연쇄반응 실험에서 콜라겐 생성 유전자인 COL1A1, COL3A1 mRNA의 발현은 증가되였고, MMP1과 MMP3 mRNA 발현은 감소하였다. 또한, 메밀꿀은 자외선에 의한 세포독성으로부터 세포를 보호하고, 자외선 조사에 의해 생성되는 활성산소를 감소시켰다. 자외선 조사에 의해 감소된 콜라겐 타입 COL1A1과 COL3A1의 발현은 메밀꿀 처리 시 농도 의존적으로 증가하였고, 자외선 조사에 의해 증가된 MMP1과 MMP3의 발현은 메밀꿀 처리 시 농도 의존적으로 감소함으로 메밀꿀 처리 시 항산화 효과가 있음을 확인되었다.
결론
본 연구 결과를 통해 메밀꿀이 페놀과 플라보노이드 농도가 풍부한 천연 항산화제이며, 자외선에 의한 피부 세포 손상 보호 효능을 확인하여 기능성 화장품 소재로써 이용 가능성을 제시하였다.
Trans Abstract
Purpose
The present study investigated the potential use of Fagopyrum esculentum (F. esculentum) honey as a functional skin cosmetic by examining its antioxidant and antiaging effects on human dermal fibroblasts (HDFs).
Methods
Total polyphenol content, total flavonoid content, and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of F. esculentum honey were analyzed. HDF cell viability was examined after treatment with F. esculentum honey and expression of genes encoding collagen and matrix metalloproteinases (MMPs) was measured by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis.
Results
Analysis of antioxidant activity showed that total polyphenol content, total flavonoid content, and DPPH radical scavenging activity of F. esculentum honey increased in a dose-dependent manner. qRT-PCR analysis revealed an increase in mRNA expression of the collagen-producing genes, collagen type I alpha 1 chain (COL1A1) and collagen type III alpha 1 chain (COL3A1), whereas MMP1 and MMP3 expression decreased in HDFs treated with F. esculentum honey. Furthermore, F. esculentum honey protected HDFs from ultraviolet (UV) irradiation-induced cytotoxicity and reduced reactive oxygen species production. Expression of COL1A1 and COL3A1, which was reduced by UV irradiation, was restored in a dose-dependent manner, whereas expression of MMP1 and MMP3, which was increased by UV irradiation, was reduced in a dose-dependent manner in HDFs pretreated with F. esculentum honey.
Conclusion
These findings indicate that F. esculentum honey is a natural antioxidant that is enriched in phenols and flavonoids and has the potential to act as an antiaging cosmetic ingredient due to its protective effects on UV irradiation-damaged skin cells.
Trans Abstract
目的
通过荞麦(F. esculentum )蜂蜜对人体皮肤成纤维细胞(HDF)中胶原蛋白和胶原酶的表达,证明了即使在紫外线 (UV)照射下,也对受损的人体皮肤成纤维细胞具有抗氧化作用。探讨其用作与皮肤老化有关的功能性化妆品材料的可行性。
方法
分析荞麦蜜的总多酚含量、总黄酮含量和DPPH自由基清除活性。在用荞麦蜂蜜处理后检查 HDF细胞活力,并通过定量实时聚合酶链反应 (qRT-PCR)分析测量编码胶原蛋白和基质金属蛋白酶(MMP)的基因的表达。
结果
抗氧化活性分析表明,荞麦蜂蜜的总多酚含量、总黄酮含量和DPPH自由基清除活性呈剂量依赖性增加。 qRT-PCR 分析显示胶原蛋白产生基因 COL1A1和 COL3A1的mRNA表达增加,而在用荞麦蜂蜜处理的 HDF中MMP1 和 MMP3 表达降低。此外,荞麦蜂蜜保护 HDF免受紫外线 (UV) 辐射诱导的细胞毒性并减少活性氧的产生。经紫外线照射降低的 COL1A1和COL3A1的表达以剂量依赖性方式恢复,而经紫外线照射增加的MMP1和MMP3的表达在用荞麦蜂蜜预处理的HDF中以剂量依赖性方式降低。
结论
这些发现表明荞麦蜂蜜是一种富含酚类和类黄酮的天然抗氧化剂,由于其对紫外线照射损伤的皮肤细胞具有保护作用,因此具有作为抗衰老化妆品成分的潜力。
Introduction
피부는 세포와 그 사이를 채우는 기질로 이루어져 우리 몸을 보호하는 장벽기능이다(Kligman, 2002; Celleno & Tamburi, 2009). 피부의 extracellular matrix (ECM)은 가장 큰 구성 요소 중 하나이며 콜라겐, 엘라스틴 및 프리테오글리칸과 같은 거대 분자로 구성된 네트워크로 조직들이 유지하기 위해 세포와 상호 작용한다(Ruggiero et al., 2005; Hideaki et al., 2006). 피부 표면의 pH는 노화가 진행됨에 따라 증가하여 감염에 대한 취약성을 증가시키고(Farage et al., 2008), 피부 기능 및 구조적 안정성도 상실되면서 환경으로부터의 노화의 징후를 더한다(Farage et al., 2013).
피부 노화는 생물학적 현상으로 내인적(intrinsic), 외인적(extrinsic) 두가지의 요인으로 진행된다(Trojahn et al., 2015; Im et al., 2019). 내인성 노화는 연령에 따른 피부 주름, 색소침착, 탄력 등 생리학적 요인에 의해 나타나고(Makrantonaki & Zouboulis, 2011; Trojahn et al., 2015; Im et al., 2019), 외인성 노화는 UV 노출, 대기오염 등 외부 환경이 요인이 되어 형태학적인 변화가 표피와 진피에 나타나는 것을 말한다(Makrantonaki & Zouboulis, 2007; Krutmann, 2011; Tsatsou et al., 2012; Lim et al., 2017; Im et al., 2019). 피부 노화의 경우 외인적 과정 중 ultraviolet (UV) 노출로 인해 영향을 많이 받게 되는데, 이 때 피부 세포의 손상은 콜라겐 섬유 구조의 문제를 초래하고, 진피 내의 콜라겐이 손실되어 합성이 중단된다(Schwartz et al., 1993; El-Domyati et al., 2002; Quan et al., 2002). 진피 세포의 손상과 동시에 나타나는 과정을 광노화(photoaging)라 한다(Pandel et al., 2013; Kammeyer & Luiten, 2015; Berkey et al., 2019). 이러한 요인들로 피부 노화가 연결되어 주름으로 나타나게 되는 동시에 콜라겐 양이 감소되고, matrix metalloproteinase (MMP)가 상승하는 하는 것으로 나타났다(Fisher et al., 1997; Varani et al., 2006; Kim et al., 2016; Ryu et al., 2019).
피부 노화 과정에서 중요한 단백질인 콜라겐은 인간의 노화에 중요한 역할을 하는데 탄력과 관련 있으며(Asserin et al., 2015; Kim et al., 2016), 진피에서 콜라겐 Ⅰ 타입이 80%이상 가장 많이 발견되며, 다음 콜라겐 Ⅲ 타입이 10% 이상의 비율로 구성되어 있다(Meigel et al., 1977; Epstein & Munderloh, 1978; Uitto et al., 1980; Baumann et al., 2006; Waller & Maibach, 2006; Johns & Athanasiou et al., 2007). 콜라겐 유도제인 transforming growth factor-β (TGF-β)는 콜라겐 생성을 증가시키는 콜라겐 분비 자극제라 할 수 있다(Lijnen & Petrov, 2002; Lin et al., 2017). UV에 의한 TGF-β 감소는 피부 손상, 콜라겐 섬유 구조의 문제를 초래하고, 진피 내의 콜라겐 손실이 나타나는 것으로 나타났다(Schwartz et al., 1993; El-Domyati et al., 2002; Quan et al., 2002). 광노화의 경우 콜라겐 합성이 감소되며, MMP가 상승하는 것으로 나타났다(Fisher et al., 1997; Varani et al., 2006; Tsatsou et al., 2012).
단백질 분해 효소인 MMP는 ECM의 다양한 단백질 성분을 변성 및 분해하며, 피부 노화로 진행시킨다(Brennan et al., 2003; Kessenbrock et al., 2010; Pittayapruek et al., 2016; Kim et al., 2018). TGF-β는 MMP 유전자 발현을 방지하고, MMP의 mRNA 및 단백질 수준을 저해할 만큼 조절시킨다(Yuan & Varga, 2001; Gomes et al., 2012). 기질 특이성 및 도메인 구성에 따라 MMP는 collagenases, gelatinases, stromelysins, matrilysins, membrane-type으로 구분되며, 이 중 collagenase에 속하는 MMP1이 콜라겐 Ⅰ, Ⅲ 타입을 분해하고(Brennan et al., 2003; Vincenti et al., 1996), stromelysins에 속하는 MMP3는 다양한 ECM 분자와 콜라겐들을 분해한다(Hideaki et al., 2006; Philips et al., 2011). interstitial collagenase인 MMP1과 stromelysin 1인 MMP3는 분자 질량이 유사하여 종종 동일한 세포에서 분비된다(Lim, 2001; Hideaki et al., 2006; Pittayapruek et al., 2016). MMP1은 콜라겐 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 타입을 분해하고(Vincenti et al., 1996), MMP3는 다양한 ECM 분자를 분해하도록 유도한다(Hideaki et al., 2006). MMP1, MMP3의 발현 증가로 피부 노화를 촉진시키기 때문에 발현 감소를 유도하는 것이 중요하다(Quan et al., 2009; Kim et al., 2016; Kim et al., 2020; Lan et al., 2020).
국내 벌꿀 생산이 증가되면서 품질관리 및 인지도가 높아지고 있다(Jung & Chon, 2016). 국내 밀원별 벌꿀 중 메밀꿀(Fagopyrum esculentum honey, F. esculentum honey)이 항균 및 항산화 활성에 대한 상관관계가 높은 것으로 확인되며(Cheldof et al., 2003; Kim et al., 2010; Deng et al., 2018), 항염효과(van den Berg et al., 2008), 피부 상처 치유 촉진(Ranzato et al., 2013), DNA 손상의 보호 효과(Zhou et al., 2012) 등 선행 연구들이 알려져 있다. F. esculentum honey는 매년 가을마다 밀원인 메밀꽃(Buckwheat flower)에서 채밀된 꿀로 적갈색 및 암갈색을 띄고, 마디풀과의 학명은 Fagopyrum esculentum (F. esculentum)이다. 항산화 물질인 rutin (Kalinova et al., 2006; Cheng et al., 2015), ferulic acid (Cheng et al., 2017), chlorogenic acid (Deng et al., 2018), hesperetin (Cheng et al., 2015) 등이 있는 것으로 알려져 있으나, F. esculentum honey가 인간 피부 섬유아세포(HDFs)에 대한 항산화 효과 및 UV에 의한 피부 세포 손상 보호 효능과 관련하여 아직 보고되지 않았다. 본 연구에서 F. esculentum honey가 항산화 효과 및 UV로 인한 피부 세포 보호 효능을 평가하여 향후 기능성 화장품 소재의 활용 가능성을 실험적으로 확인하고자 하였다.
Methods
1. 시약 및 재료
본 연구에 사용된 시료는 농업법인㈜마미팜(방서원꿀)에서 2018년도 강원도 평창군 봉평면 흥정리에서 채밀한 100% F. esculentum honey로 항산화 및 노화 억제 효능을 분석하기 위해 사용되었다. 시료들은 DW에 용해하여 -20℃에 보관하였다. 양성 대조군은 transforming growth factor-beta (TGF-β; Sigma-Aldrich, USA) 5 ng/mL 로 -80℃에 보관하였다.
2. 항산화 측정
1) 총 폴리페놀 함량
Folin-Denis (Folin & Denis, 1912; Singleton & Rossi, 1965; Singleton et al., 1999; Dewanto et al., 2002) 방법을 응용하였으며, 총 폴리페놀 함량을 확인하기 위해 2N Folin-Ciocalteau's phenol reagent (Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 페놀 화합물에 의해 환원될 경우 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리로 표준물질은 caffeic acid (Sigma-Aldrich)이며, 농도별로 희석하여 검량 곡선을 작성하였다. F. esculentum honey는 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500 mg/mL의 농도에 2N Folin-Ciocalteau's phenol reagent를 분주하여 5 min 동안 반응시키고, 1% Na2CO3 (Fluka, UK) 분주하여 암실에서 1 h 동안 반응시켜 iMark microplate reader (#1681130; Bio-Red, USA)를 이용하여 750 nm의 파장에서 흡광도를 측정한 뒤 결과 값을 결정하였다.
2) 총 플라보노이드 함량
Zhishen과 Dewanto의 방법(Zhishen et al., 1999; Dewanto et al., 2002)을 응용하여 F. esculentum honey를 이용해 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 표준물질은 quercetin (Sigma-Aldrich)을 농도별로 희석하여 검량 곡선을 작성하고, F. esculentum honey를 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500 mg/mL 의 농도에서 DW로 희석한 후 분주하였다. 각 시료에 5% Na2CO2 분주하여 5 min 동안 반응시키고, 10% AlCl3 (Daejung, Korea)분주하여 6 min 동안 반응시킨 다음 1M NaOH3 (DUKSAN, Korea) 분주한 후 DW를 넣어 피펫팅한 후, iMark microplate reader (#1681130; Bio-Red, USA)를 이용하여 415 nm의 파장에서 흡광도를 측정한 뒤 결과 값을 결정하였다.
3) DPPH radical 소거 활성
F. esculentum honey의 산화방지 활성을 측정하기 위해 2,2-dipheny-1-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma-Aldrich)를 사용한 Blois (1958)의 방법을 응용하였다. DPPH에 대한 전자공여능을 이용하여 F. esculentum honey의 환원으로 항산화 효과를 확인하기 위해 양성 대조군인 Quercetin을 사용하여 비교하였다. 다음 F. esculentum honey를 0, 1, 5, 10, 20, 50 mg/mL의 농도에서 DPPH radical 소거 활성을 확인하기 위해 0.2 mM의 DPPH 용액을 각 F. esculentum honey와 quercetin에 혼합하여 희석한 후, 암실에서 30 min 동안 반응시켰다. iMark microplate reader (#1681130; Bio-Red)를 이용하여 517 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고, DPPH radical 소거 활성은 다음 식에 의해 계산하였다.
DPPH radical 소거 활성(%)=100-(시료첨가군의 O.D.at 517 nm)/(시료무첨가군의 O.D.at 517nm)×100
3. 세포 배양
Human Dermal Fibroblasts (HDFs)는 Lonza (Switzerland)사에서 구입하였으며, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Biowest)에 10% FBS가 포함된 배지를 사용하였으며, 세포는 세포배양기를 이용해 37℃, 5% CO2 상태에서 배양 및 유지하였다.
4. 세포 생존율 측정
1) 피부세포를 이용한 생존율 측정
F. esculentum honey의 세포 독성은 water-soluble tetrazolium salt (WST-1) assay를 통해 측정하였다. HDFs는 96-well plate에 3×103 cells/mL 씩 분주하여 세포배양기에 24 h 배양 후, F. esculentum honey 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL 농도에 처리하여 24 h 동안 세포배양기에 배양하였다. 배양된 세포에 EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit reagent (DoGenBio, Korea)를 10 μL 처리하여 30 min 세포배양기에서 배양시킨 후, iMark microplate reader (Bio-Red, USA)를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고, reference 흡광도는 650 nm의 파장에서 결과 값을 결정하였다.
2) UV 조사한 세포 생존율 측정
F. esculentum honey의 세포 독성은 WST-1 assay를 통해 측정하였다. HDFs는 96-well plate에 각 well당 1×105 cells씩 분주하여 배양하고, 배양된 상태를 확인하여 F. esculentum honey 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL 농도에 맞춰 pre-treatment하여 4 h 동안 다시 배양하였다. 이후 UV를 조사하고, 농도별 post-treatment 하여 overnight한 세포에 EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit reagent를 10 μL, 30 min 처리하여 배양시킨 후, iMark microplate reader (Bio-Red)를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고, Reference 흡광도는 650 nm의 파장에서 결과 값을 결정하였다.
5. UV 조사
Ultraviolet A (UVA)의 경우 Vilber BIO-LINK BLX Crosslinker (BLX-254; Vilber Lourmat, France)를 사용하였으며, 10 J/cm2에서 조사하였다. Ultraviolet B (UVB)의 경우 Ultraviolet Illuminator (UV1000; BoTeck, Korea)를 사용하였고, 20 mJ/cm2에서 UV 처리하여 진행하였다.
6. 세포 내 ROS 정량 분석
2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA; Sigma-Aldrich)는 세포 내로 들어가면 Cellular Esterase에 의해 DCF-H (2',7’ -dihydrochlorofluorescein)로 전환되고, reactive oxygen species (ROS)가 생성되는 곳에서 산화반응에 의해 DCF (dichlorofluorescin)로 전환하여 형광을 발하는 값을 측정하였다. HDFs는 96-well plate에 분주하여 세포배양기에 18 h 배양 후, F. esculentum honey 0, 20, 50, 100 μg/mL 농도로 pre-treat하여 6 h 세포배양기에 배양하였고, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS; Biowest)를 넣어 UV 조사한 후 post-treat하여 1 h 세포배양기에 배양하였다. 10 μM DCF-DA를 분주하고, 1 h 세포배양기에서 반응시킨 후 PBS를 넣어 Fluorescence Microplate Reader (SpectraMax Gemini XPS/EM; Molecular Devices LLC, USA)를 excitation는 481 nm, emission은 538 nm로 설정하여 결과 값을 결정하였다.
7. RNA Preparation 및 cDNA synthesis
배양을 통해 얻은 세포에 RiboExTM Total RNA Isolation Solution (GeneAll Biotechnology, Korea)을 넣어 scraper로 용해시키고, tube에 옮긴 후 chloroform (Sigma-Aldrich)을 넣어 원심 분리 (12000 rpm, 4℃)한다. 분리된 상층액에는 RNA가 있어 따로 tube에 옮겨 2-propanol (Sigma-Aldrich)을 넣어 RNA가 침전되도록 원심 분리한다. Ethanol (Sigma-Aldrich) 75%를 이용하여 남아있는 침전물에 넣어 세척 후 제거하고, Nuclease-free water (Thermo Fisher Scientific, USA)로 용해하여 MaestroNano Micro-Volume Spectrophotometer (MN-913; V-BioScience, Malaysia)를 이용하여 순도와 농도를 측정하도록 하였다.
cDNA는 PCR tube에 RNA, dNTP mixture (Takara, Korea), Oligo dT (Bionics, Korea), DW를 65℃, 5 min 설정한 Thermal cycler에 반응시킨 후 5×first strand buffer (Invitrogen, USA), 0.1M DTT (Invitrogen), M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen) 넣어 37℃ 50 min, 70℃ 15 min 설정한 thermal cycler을 이용하여 반응시켰다.
8. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)
F. esculentum honey를 treatment한 HDFs 내에 유전자 발현 분석을 하고자 qRT-PCR을 이용하였다. 합성된 cDNA의 경우 해당 primer와 SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific)를 혼합하여 StepOnePlus Real-Time PCR System (4379216; Thermo Fisher Scientific)으로 qRT-PCR을 진행하였다. Melting curve로 PCR의 유효성 검증을 하였고, normalize 하기 위해 GAPDH를 사용하였다. 먼저 holding stage는 95℃, 15 min denaturation하고, 다음 PCR stage에서 3개의 과정을 거치는데 denaturation (95℃, 30 s), annealing (60℃, 30 s), extension (75℃, 30 s) 순으로 45 cycles 반복하여 형광도 측정하도록 반응 조건을 설정하였다. mRNA의 발현량을 Ct값을 이용해 2-△△CT 방법으로 분석하였고, 실험에 사용된 유전자 primer 정보는 Table 1과 같다.
9. 통계분석 방법
본 연구는 동일하고 독립적인 조건하에 3회 이상의 반복 실험을 실시하여 평균±표준편차(means±standard deviation)로 결과 값을 나타냈다. 각 실험에 관하여 Student's t-test방법을 이용하여 0.05 (*p<0.05) 이하일 경우 통계적으로 유의하다고 검정하였다.
Results
1. 항산화능
1) 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 평가
F. esculentum honey의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis (Folin & Denis, 1912; Singleton & Rossi, 1965; Dewanto et al., 2002) 방법을 응용하여 측정하였다. 그 결과, F. esculentum honey가 1 mg/mL에서 1.68±0.21 μg CAE (caffeic acid equivalent)/mL), 5 mg/mL에서 2.19±0.18 μg CAE/mL, 10 mg/mL에서 3.03±0.20 μg CAE/mL, 20 mg/mL에서 4.54±0.07 μg CAE/mL, 50 mg/mL 에서 9.39±0.14 μg CAE/mL, 100 mg/mL에서 16.76±0.52 μg CAE/mL, 250 mg /mL에서 35.22±0.74 μg CAE/mL, 500 mg/mL 농도에서 60.71±1.04 μg CAE/mL로 농도 의존적으로 증가하였고(Figure 1A), 총 플라보노이드 함량도 마찬가지로 F. esculentum honey가 1 mg/mL에서 1.43±0.29 μg QE (quercerin equivalent)/mL, 5 mg/mL에서 1.74±0.19 μg QE /mL, 10 mg/mL에서 2.41±0.15 μg QE /mL, 20 mg/mL에서 3.37±0.05 μg QE/mL, 50 mg/mL에서 6.15±0.28 μg QE/mL, 100 mg/mL에서 11.67±1.62 μg QE/mL, 250 mg/mL에서 26.18±0.92 μg QE/mL, 500 mg/mL 농도에서 46.73±0.77 μg QE/mL로 농도 의존적으로 증가하는 것으로 확인할 수 있었다(Figure 1B).
2) DPPH radical 소거 활성 평가
F. esculentum honey의 DPPH radical 소거 활성은 Blois (1958) 방법을 응용하여 측정하였다. 그 결과, F. esculentum honey 1 mg/mL에서 9.29%, 5 mg/mL에서 22.42%, 10 mg/mL에서 39.97%, 20 mg/mL에서 51.03%, 50 mg/mL에서 61.65%로 농도 의존적으로 증가하였고, 대조물질인 quercetin을 사용하여 농도별로 비교한 결과, F. esculentum honey의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 소거 활성도 증가하는 것으로 확인하였다(Figure 1C). 본 연구 결과에서 F. esculentum honey의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 분석을 통해 농도 의존적으로 증가하였고, F. esculentum honey는 항산화력이 있는 것으로 나타났으며, DPPH radical 소거 활성의 경우도 F. esculentum honey의 농도에 따라 증가시키는 경향이 보였다. 따라서 F. esculentum honey가 노화 방지에 중요한 작용 가능성을 확인하였다.
2. F. esculentum honey의 세포독성(cytotoxicity) 평가
F. esculentum honey에 대한 HDFs 내 콜라겐 및 MMP 발현 여부를 확인하기 전, HDFs에 해당 시료를 처리하여 세포 독성과 독성 유발 농도를 확인하였다. HDFs를 대상으로 0-100 μg/mL 농도의 F. esculentum honey를 24 h 처리한 후, WST-1 assay를 통해 cell viability 분석 및 세포독성을 확인하였다. Figure 2와 같이 HDFs에 F. esculentum honey를 처리한 결과, 100 μg/mL이하의 처리 농도에서 독성이 나타나지 않았다(Figure 2). 본 실험 결과로 추후 처리 농도를 0, 20, 50 μg/mL으로 하여 추가적인 실험을 진행하였다.
3. F. esculentum honey의 세포 항노화 평가
F. esculentum honey의 피부 세포 항노화에 대한 가능성을 평가하기 위해, 콜라겐 합성을 하는 HDFs에 F. esculentum honey를 50 μg/mL이하의 농도로 24 h 처리 후, Table 1의 primer를 사용하여 qRT-PCR 분석법을 통해 콜라겐 유전자인 COL1A1, COL3A1의 발현 여부를 분석하였고, Figure 3와 같이 F. esculentum honey를 처리하였을 때 콜라겐 유전자 발현이 증가됨을 확인하였다. COL1A1 mRNA의 발현은 대조군 대비 20 μg/mL에서 81.52±3.55%, 50 μg/mL에서 114.35±2.10% 증가하였고(Figure 3A), COL3A1 mRNA의 발현은 대조군 대비 20 μg/mL에서 144.67±11.98%, 50 μg/mL에서 149.76±9.79% 현저하게 증가하였다(Figure 3B). 이와 같이 콜라겐 유전자에서 통계학적으로 유의한 증가로 나타났으며, 추가적으로 F. esculentum honey를 처리에 따라 콜라겐 단백질을 분해할 수 있는 효소인 MMP1, MMP3의 발현 여부를 분석하였고, F. esculentum honey를 처리하였을 때 MMP 유전자 발현이 감소됨을 확인하였다. MMP1 mRNA의 발현은 대조군 대비 20 μg/mL에서 74.20±0.63%, 50 μg/mL에서 85.21±1.15% 감소하였고(Figure 3C), MMP3 mRNA의 발현은 대조군 대비 20 μg/mL에서 41.54±2.00%, 50 μg/mL에서 60.97±3.82% 현저하게 감소하였다(Figure 3D). 따라서, 본 결과를 바탕으로 F. esculentum honey는 HDFs 내 콜라겐 발현을 증가시키고, MMP 발현을 감소시켜 피부 항노화 소재로써 가능성을 제시하였다.
4. F. esculentum honey의 UV에 의한 세포 생존율 평가
F. esculentum honey에 대한 HDFs 내 콜라겐 및 MMP 발현 여부를 확인한 후, UV에 의한 F. esculentum honey의 세포 생존율과 독성 유발 농도를 확인하기 위해 HDFs 대상으로 F. esculentum honey를 0, 20, 50, 100 μg/mL 농도로 4 h pre-treat 후, UV 조사하여 post-treat overnight한 다음 WST-1 assay를 통해 cell viability 분석 및 세포독성을 확인하였다. Figure 4와 같이, UVA를 HDFs에 조사하여 F. esculentum honey를 처리한 결과, 음성 대조군 대비 100 μg/mL은 15.72% 증가하였고(Figure 4A), UVB도 HDFs에 조사하여 F. esculentum honey를 처리한 결과, 음성 대조군 대비 100 μg/mL에서 17.28% 증가하였다(Figure 4B). 본 실험 결과, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 다음 실험 처리 농도를 0, 20, 50, 100 μg/mL으로 하여 진행하였다.
5. F. esculentum honey의 세포 내 ROS 정량 분석 평가
피부 노화를 촉진시키는 UV가 세포 대사 과정 중에 발생하는 ROS를 활성 시키므로 F. esculentum honey를 통해 세포 내 ROS 활성 억제에 미치는 영향을 확인하였다(Figure 5). HDFs에 F. esculentum honey를 0, 20, 50, 100 μg/mL 농도별로 측정하였고, 농도 의존적인 ROS 감소 효과가 확인되었다. 본 실험 결과, UVA 10 J/cm2에서 음성 대조군 대비 20 μg/mL농도는 22.33±1.05%, 50 μg/mL 농도는 40.26±13.01%, 100 μg/mL 농도는 56.66±10.99%의 ROS 감소 효과를 확인하였으며(Figure 5A), UVB 20 mJ/cm2의 경우 음성 대조군 대비 20 μg/mL 농도는 23.01±1.54%, 50 μg/mL 농도는 38.42±7.74%, 100 μg/mL 농도는 57.90±3.37%의 ROS 감소 효과를 확인하였다(Figure 5B). F. esculentum honey가 ROS 감소하는 효과가 있을 것으로 사료되므로 본 실험 결과로 추후 처리 농도를 0, 20, 50 μg/mL으로 하여 추가적인 실험을 진행하였다.
6. F. esculentum honey의 UVA에 의한 콜라겐 발현 감소 억제력 평가
UV가 콜라겐 합성을 억제하고, MMP 효소를 증가시키며 피부 노화를 촉진하는 원인 물질 중 하나로 F. esculentum honey가 피부 노화에 미치는 영향을 확인하기 위해 HDFs에 UV를 조사하여 F. esculentum honey를 0, 20, 50 μg/mL 농도별로 측정하였다(Figure 6). 본 실험에서는 HDFs 내 UVA 10 J/cm2을 조사하여 콜라겐 발현 감소를 유도한 후, F. esculentum honey를 처리하여 UVA에 의한 콜라겐 감소 억제능이 존재하는지 평가하였다. HDFs에 0, 20, 50 μg/mL의 F. esculentum honey를 6 h pre-treat한 후, UVA 10 J/cm2을 세포에 조사하였으며, 이 후 다시 F. esculentum honey를 24 h posttreat하여 COL1A1 및 COL3A1, MMP1 및 MMP3 mRNA의 발현량을 qRT-PCR법을 이용하여 분석하였다. 분석 결과, UVA 10 J/cm2 조사는 세포 내 COL1A1 mRNA의 발현을 67.47±1.69% 감소시켰으나, 음성 대조군 대비 50 μg/mL 농도에서 15.88±2.36% 증가 효과를 확인하였고(Figure 6A), COL3A1 mRNA의 발현을 82.63±2.56% 감소시켰으나, 음성 대조군 대비 50 μg/mL 농도에서 10.25±0.78% 증가 효과를 확인하였다(Figure 6B). MMP1 mRNA의 발현을 99.40±14.27% 증가시켰으나, 음성 대조군 대비 50 μg/mL 농도에서 45.78±10.75% 감소 효과를 확인하였고(Figure 6C), MMP3 mRNA의 발현을 147.46±4.55% 증가시켰으나, 음성 대조군 대비 50 μg/mL 농도에서 146.809±6.15% 감소 효과를 확인하였다(Figure 6D).
7. F. esculentum honey의 UVB에 의한 콜라겐 발현 감소 억제력 평가
F. esculentum honey가 UVA에서 콜라겐 증가 및 MMP 감소하는 효과를 확인한 결과, UVB에서도 긍정적인 가능성을 보고자 본 실험에서는 HDFs 내 UVB 20 mJ/cm2을 조사하여 콜라겐 발현 감소를 유도한 후, F. esculentum honey를 처리하여 UVB에도 콜라겐 감소 억제능이 존재하는지 평가하였다. HDFs에 0, 20, 50 μg/mL 의 F. esculentum honey를 6 h pre-treat한 후, UVB 20 mJ/cm2을 세포에 조사하였으며, 이 후 다시 F. esculentum honey를 24 h posttreat하여 COL1A1 및 COL3A1, MMP1 및 MMP3 mRNA의 발현량을 qRT-PCR법을 이용하여 분석하였다(Figure 7). 그 결과, UVB 20 mJ/cm2 조사는 세포 내 COL1A1 mRNA의 발현을 77.29±2.11% 감소시켰으나, 음성 대조군 대비 50 μg/mL 농도에서 30.98±3.47% 증가 효과를 확인하였고(Figure 7A), COL3A1 mRNA의 발현을 68.19±2.24% 감소시켰으나, 음성 대조군 대비 50 μg/mL 농도에서 12.96±5.25% 증가 효과를 확인하였다(Figure 7B). MMP1 mRNA의 발현을 72.66±10.38% 증가시켰으나, 음성 대조군 대비 50 μg/mL 농도에서 35.12±14.67% 감소 효과를 확인하였고(Figure 7C), MMP3 mRNA의 발현을 54.38±15.11% 증가시켰으나, 음성 대조군 대비 50 μg/mL 농도에서 41.08±3.17% 감소 효과를 확인하였다(Figure 7D). 따라서, 연구 결과를 통해 F. esculentum honey는 UV에 의한 피부 세포 내 콜라겐 발현량 감소를 억제하는 효능이 있음을 밝혔다.
Discussion
국내 벌꿀 시장에 수요와 공급이 늘면서 생산이 증가되고, 동시에 품질관리 및 인지도가 높아지고 있다(Jung & Chon, 2016). 국내 밀원별 벌꿀 중 메밀꿀(F. esculentum honey)이 향균 및 항산화 활성이 높은 것으로 나타났고(Cheldof et al., 2003; Kim et al., 2010; Deng et al., 2018), 항염효과(van den Berg et al., 2008), 피부 상처 치유 촉진(Ranzato et al., 2013), DNA 손상의 보호 효과(Zhou et al., 2012) 등 선행 연구들이 알려져 있으며, F. esculentum honey에는 chlorogenic acid (Deng et al., 2018), ferulic acid (Cheng et al., 2017), p-coumaric acid (Zhou et al., 2012; Cheng et al., 2015; Salonen et al., 2017), rutin (Kalinova et al., 2006; Cheng et al., 2015), hesperetin (Cheng et al., 2015) 등 항산화 물질들이 알려져 있다.
본 연구에서는 F. esculentum honey가 피부 세포인 HDFs에서 항산화, 세포 손상에 대한 복구력 및 효능 검증을 통해 산업 소재 자원 가치의 가능성을 확인하고자 하였다. 먼저, F. esculentum honey의 항산화능을 보고자 총 폴리페놀 함량의 경우 Folin-Denis (Folin & Denis, 1912; Singleton & Rossi, 1965) 방법, 총 플라보노이드 함량의 경우 Zhishen과 Dewanto의 방법(Zhishen et al., 1999; Dewanto et al., 2002), 산화방지 활성을 측정하기 위해 DPPH를 사용한 Blois의 방법(Blois, 1958)들을 응용하였고, 항산화 관련한 선행연구들도 참고하였다(Lee et al., 2009; Jo et al., 2014; Sung et al., 2019). 그 결과 F. esculentum honey의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 분석을 통해 농도 의존적으로 증가하였고, DPPH radical 소거 활성의 경우도 F. esculentum honey의 농도에 따라 증가시키는 경향이 보였다. 이것은 밀원별 벌꿀 중 항산화 및 항균활성과 관련한 선행 연구(Al-Mamary et al., 2002; Kim et al., 2010)에서도 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량, 항균활성에서 7개의 벌꿀 중 F. esculentum honey가 가장 높게 나타남에 따라 F. esculentum honey는 항산화력이 있는 것으로 확인하였다. 이후 F. esculentum honey의 세포생존율을 확인하기 위해 HDFs에 F. esculentum honey를 0-100 μg/mL농도로 처리한 후, WST1 assay를 통해 cell viability 분석 및 세포독성을 확인한 결과 모두 100 μg/mL이하의 처리 농도에서 독성이 나타나지 않았다. 선행 연구 중 꿀 추출물이 특정 사이토카인 및 MMP9의 발현을 상향 조절하여 인간 각질형성세포에서도 활성화하는 것이 보고되었기에 HDFs 대상으로 F. esculentum honey 처리한 정량적 qRT-PCR분석을 통해 콜라겐 및 콜라겐 분해효소의 발현양상을 확인하고자 하였다(Majtan et al., 2010). 그 결과 콜라겐 생성 유전자인 COL1A1, COL3A1 mRNA의 발현이 증가되었고, MMP1과 MMP3 mRNA 발현은 감소함으로 F. esculentum honey 처리 시 항산화 효과가 있음을 나타났기에 HDFs에서 F. esculentum honey의 광노화 기전도 규명하고자 한다. 파장이 긴 UVA의 경우 진피까지 침투하여 피부 노화에 따른 장기적 피부 손상과 단백질 산화 및 MMP 발현하는 것으로 알려졌고, 파장이 짧지만 강한 에너지를 가지고 있는 UVB의 경우 광생물학적 영향으로 화상 및 HDFs까지 손상을 일으킨다(Carrard et al., 2002; Cavinato & Jansen-Dürr, 2017). UV에 의한 F. esculentum honey의 HDFs 세포 생존율과 독성 유발 농도를 확인한 결과 음성 대조군 대비 농도 의존적으로 증가하였고, 피부 노화를 촉진시키는 UV가 세포 대사 과정 중에 발생하는 ROS를 활성시키므로 DCF-DA assay를 통해 세포 내 ROS 활성 억제에 미치는 영향을 확인한 결과 농도 의존적으로 ROS가 감소되었다. 이 또한 선행 연구에서도 여러 종류의 꿀이 ROS 활성을 낮추고, 항산화 효소를 증가하여 산화적 손상으로부터 예방한다고 입증되었기 때문이다(Mohammed et al., 2013; Cheng et al., 2015; Almasaudi et al., 2016). F. esculentum honey의 UVA에 의한 콜라겐 발현 감소 억제력 평가를 통해 콜라겐 발현량을 qRT-PCR을 이용하여 분석한 결과 음성 대조군 대비 COL1A1, COL3A1 mRNA의 발현이 증가되었고, MMP1과 MMP3 mRNA 발현은 감소하였다. F. esculentum honey의 UVB에 의한 콜라겐 발현 감소 억제력 평가는 qRT-PCR을 이용하여 분석한 결과로 음성 대조군 대비 COL1A1, COL3A1 mRNA의 발현이 증가되었고, MMP1과 MMP3 mRNA 발현은 감소하였다. 선행연구에서도 꿀 추출물은 각질세포에서 UVB로 인한 DNA 손상 및 산화적 스트레스에 인한 유도 물질을 감소시키며, MMP의 발현 수준을 조절함으로써 피부 세포의 손상을 보호한다는 연구 결과와 비슷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었습니다(Ahmad et al., 2012; Karapetsas et al., 2020). 따라서 본 연구는 F. esculentum honey의 항산화 및 광노화 효능을 확인하여 노화 방지 화장품 성분으로서 이용 가능성을 제시하였으며, 피부 세포에 항산화 물질을 공급함으로써 UV에 의한 손상을 보호하여 노화를 방지할 수 있다고 판단되었다.
Conclusion
본 논문에서는 F. esculentum honey가 HDFs 내 콜라겐 유전자 발현되고, UV에 의해 손상된 피부 세포의 경우 세포 손상 보호 및 항산화 효과를 확인하였다. F. esculentum honey의 항산화력을 확인하기 위해 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거 활성을 분석하였고, 그 결과 메밀꿀의 항산화력은 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거 활성에서 농도 의존적으로 증가되어 항산화 효능이 있음을 확인되었다. 피부 세포인 HaCaT cells, B16F10 cells, HDFs 3가지 세포 대상으로 독성 평가한 결과 100 μg/mL 이하의 처리 농도에서 독성이 나타나지 않았고, qRT-PCR을 통해 HDFs 내 콜라겐 유전자 발현 증가 및 MMP 발현 감소하는 효능이 존재함을 밝혔다. 이후 모든 실험에서는 UV (UVA, UVB)를 조사하여 진행하였고, UV에 의한 F. esculentum honey의 세포독성을 본 결과 UVA, UVB 모두 음성 대조군 대비 농도 의존적으로 증가하여 독성이 없다고 판단하였다. F. esculentum honey가 UV에 의한 세포 내 ROS 정량 분석을 통해 음성 대조군 대비 농도 의존적으로 감소하는 효과를 보였고, F. esculentum honey가 UV로 인한 손상된 HDFs의 콜라겐 유전자 발현 평가의 경우 음성 대조군 대비 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 콜라겐 분해효소 유전자 발현 평가에서는 음성 대조군 대비 농도 의존적으로 감소하는 효과를 보였다. 따라서 본 연구 결과를 통해 F. esculentum honey는 항산화와 관련한 소재로써 활용의 가능성을 제시하였다.
Notes
Author's contribution
HBK designed experimental investigations, and investigated the potential use of Fagopyrum esculentum honey as a functional skin cosmetic by examining its antioxidant and antiaging effects on human dermal fibroblasts (HDFs). SB and SA oversaw the project, and assisted with experimental design. HBK wrote the manuscript with assistance from SB and SA.
Author details
Hye Bin Kim (Ph.D.), Department of Cosmetics Engineering, Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Sungkwan An (Professor), Department of Cosmetics Engineering, Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Seunghee Bae (Professor), Department of Cosmetics Engineering, Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea.