비파나무 잎 효소추출물의 항산화 및 콜라겐 생성능 증대 효과
Antioxidant and Pro-collagen Synthesis Activities of the Eriobotrya japonica Leaf Extract Using Enzyme
枇杷叶酶提取物的抗氧化和胶原合成活性
Article information
Abstract
목적
본 연구는 제주 비파나무 잎을 이용하여 효소추출물의 항산화 활성 및 진피섬유아세포 내 콜라겐 생성 증대 효과를 확인하는 목적으로 진행되었다.
방법
제주 비파나무 잎을 이용해 펩신 효소추출물을 제조 후 구성아미노산 분석을 진행하였다. 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 라디칼 소거능 활성을 확인하였다. 진피섬유아세포 내 pro-collagen type 1 생성 활성을 통해 주름개선 효능을 검증하였다.
결과
구성아미노산 분석 결과, 비파나무 잎 효소추출물에서 16종의 아미노산이 분석되었다. DPPH 라디칼 소거능은 약 100 µg/mL에서 90.17±0.09%의 소거 활성을 나타내었으며, ABTS 라디칼 소거 활성도 농도의존적으로 활성이 증가한 것을 확인하였다. 피부 주름개선 효능을 확인하고자 elastase 저해 활성을 확인한 결과, 최대 500 µg/mL에서 41.15±1.96%의 저해능을 확인하였으며, pro-collagen type-1 생성능도 농도 의존적으로 유의하게 증가한 것을 확인하였다.
결론
제주 비파나무 잎 효소추출물의 항산화 및 콜라겐 생성 효능을 확인하여 기능성 화장품 소재로 가능성을 확인하였다.
Trans Abstract
Purpose
We conducted a study that examined the physicochemical properties of Eriobotrya japonica leaf enzyme-assisted extract (EJLE) from Jeju Island.
Methods
EJLE was prepared using the pepsin enzyme. The antioxidant and antiaging effects of EJLE were investigated to determine its utility as a functional material.
Results
In the analysis of total amino acids, 16 kinds of components were isolated from EJLE. The DPPH and ABTS radical scavenging activities of EJLE were found to be 97.19±0.24% and 96.91±0.02% respectively in 500 μg/mL. Inhibition activities of elastase by EJLE were confirmed. In fibroblasts, EJLE at 500 μg/mL demonstrated a procollagen synthesis activity of approximately 52%.
Conclusion
Our results confirmed that EJLE induced antioxidants in cosmetic materials and increased procollagen synthesis on the skin.
Trans Abstract
目的
确认自济州岛的枇杷叶酶辅助提取物的抗氧化活性以及增加真皮成纤维细胞胶原蛋白产生的效果。
方法
使用济州枇杷叶制备胃蛋白酶提取物后，进行氨基酸分析 。为了确认提取物的抗氧化效果，确认了自由基清除活性。通过真皮成纤维细胞中1型前胶原蛋白的产生活性验证了抗皱效果。
结果
氨基酸分析结果显示，枇杷叶酶提取物中检出16种氨基酸。DPPH自由基清除活性在约100 μg/mL时显示出90.17±0.09％的清除活性，并且确认ABTS自由基清除活性以浓度依赖性方式增加。确认弹性蛋白酶抑制活性以确认皮肤皱纹改善效果，结果在500 μg/mL时，确认了41.15±1.96%的抑制，并且确认了产生1型前胶原蛋白的能力呈浓度依赖性显着增加。
结论
济州枇杷叶酶提取物的抗氧化和胶原蛋白生成作用得到证实，证实了其作为功能性化妆品材料的潜力。
Introduction
사람의 피부는 인체의 최외각층에 존재하여 외부환경에 대한 자극에 대해 보호하기 위해 낮은 투과성과 물리적인 장벽 기능을 통해 보호하고 기능을 유지한다. 피부 노화과정은 후성적, 유전적, 환경적 요인들의 상호 작용에 의해 발생되며 이런 과정은 외인성(extrinsic) 및 내인성(intrinsic) 요인으로 인해 영향을 받는다(Farage et al., 2008). 이중 환경적 요인으로 자외선 노출로 인한 피부노화가 중요한 원인으로 작용한다. 특히 피부노화에 과도하게 형성된 활성산소에 의해 피부의 콜라겐(collagen)을 분해하고 pro-collagen의 합성을 저해하여 피부 내 섬유 조직의 활성을 저해시킨다. 과도한 활성산소는 mitogen-activated protein kinase (MAPK)를 활성화하여 nuclear factor-κB (NF-κB)전사인자를 유도하고 transforming growth factor-β (TGF-β)신호전달에 의해 matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현을 증가시켜 노화를 촉진시킨다(Rittié & Fisher, 2002).
비파나무(Eriobotrya japonica)는 장미과(Rosaceae)의 상록 소교목으로 중국이 원산지이며 한국, 중국 등에서 주로 재배되고 있다(Yun et al., 2022). 비파나무의 열매는 과육이 연하고 당도가 높아 식용으로 이용되며, 잎은 엽차 등으로 이용되는 것으로 알려졌다(Park, 2012). 비파나무는 flavonoids, sesquiterpene glycosides, phenylpropanoids 등의 화합물을 함유하고 있다고 보고되었다(Wu et al., 2018; Zhu et al., 2022). 특히 페놀화합물인 클로로겐산(chlorogenic acid) 및 네오클로로겐산(neochlorogenic acid)등은 항염증, 항당뇨, 항암 효과 등의 생리활성을 가지고 있다고 보고되었다(Cory et al., 2018). 국내 자생 비파나무 열매에 무수 에탄올을 이용한 추출물은 산화방지 및 미백 효과를 확인하였으며, 잎을 건조 후 환류 추출을 통해 항균효과를 확인하였다(Lee & Kim, 2009; Yun et al., 2022).
천연물 연구에 중요한 조건은 재료의 처리 조건 및 추출방법 등에 따라 유효성분 함량 및 생리활성의 변화가 다르게 나타난다(Altemimi et al., 2017; Choi, 2022). 천연물 추출방법은 전통적인 방법인 가수분해, 용매 및 침용 추출 뿐만 아니라 효소, 마이크로웨이브, 초임계, 초음파 추출법 등의 다양한 시도가 이루어지고 있다(Thiyagarasaiyar et al., 2020). 그 중에 효소의 사용은 산업적인 측면에서 특이적이고 효율적으로 사용할 수 있기에 새로운 추출법으로 사용되고 있다. 천연물에 존재하는 대사산물을 얻기 위한 효소적 가수분해를 이용하여 추출 시 다양한 생리활성에 관여한다는 연구결과가 보고되었다(Jang, 2017). 특히 비파나무는 지역특화 작목으로 알려져 있어 추출방법의 다변화를 통해 화장품 소재로써 기능을 부여하기 위한 적합한 소재로 확인된다.
본 연구에서는 제주 지역의 비파나무 잎을 이용하여 효소추출물을 제조하고 피부주름 개선 효능을 확인하고자 한다. 또한, 효소추출물의 성분 변화를 확인하여 비파나무 잎 추출물을 기능성 화장품 소재로 활용하는데 기초자료로 제공하고자 한다.
Methods
1. 비파나무 잎 효소추출물 제조
비파나무 잎 효소추출물을 제조하기 위해 비파나무 잎은 제주시에 있는 비파 재배 농가인 청밈이 농원에서 가지치기에서 나온 비파나무 잎을 수거하여 사용하였다. 비파나무 잎 효소추출물 제조는 원물과 함께 원물 대비 20배의 증류수를 넣고 citric acid (대정화금, Korea)를 이용하여 pH 3.0-4.0으로 산처리를 진행 후 1:3000 비율로 pepsin을 넣고 50℃에서 18 h 동안 추출 후 121℃에서 15 min 동안 멸균공정을 진행하여 효소 불활성화를 진행하였다. 감압 농축(Rotary evaporator, EYELA, Japan)하여 얻어진 수득물을 농축 후 추출물의 2배의 (v/v) 95% 에탄올을 첨가하여 석출을 시킨 후 상층액을 필터지로 침전물을 제거하고 상층액 추출물을 감암 농축 및 동결 건조를 통해 파우더로 제작하였다. 이후 실험 샘플은 -20℃에 보관하여 본 실험의 시료로 사용하였다.
2. 아미노산 분석
전처리를 위하여 건조된 시료 약 100 mg에 6N HCl 10 mL를 투입 후 혼합된 시료를 110℃에서 22 h 동안 가수분해 후 55℃에서 24 h 동안 감압 건조하였고 건조된 시료를 0.02 N HCl 10 mL로 녹인 후 0.2 μm syringe filter에 여과하여 자동 아미노산 분석기인 HITACHI L-8800 (Amino Acid Analyzer, Japan)을 이용하여 분석하였다. 아미노산 분석을 위한 용매 중 elution buffer로는 PH1, PH2, PH3, PH4, PF-RG (Kanto, Japan)를 사용하였으며, 반응 시약으로는 ninhydrin reagent (Wako, Japan)를 사용하였다. 분석 컬럼은 Ion exchange column (HITACHI, Japan)를 사용하였으며 구성 아미노산의 표준물질은 amino acids mixture Standard Solution, Type H (Wako, Japan)을 사용하였다. 분석 대상 아미노산 중 proline, hydroxyproline은 440 nm에서 흡광도 (SpectraMax®, Bio-Rad, USA)를 측정하였고, 나머지 아미노산들은 570 nm에서 측정하였다.
3. DPPH radical scavenging activity assay
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다(Blois, 1958). 96 well plate에 DPPH 60 µL와 농도별 추출물을 120 µL씩 넣고 혼합한 후 15 min 간 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. ABTS+ cation radical scavenging activity assay
ABTS라디칼 소거능은 Re et al. (1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS 5 mL와 140 mM, K2S2O8 88 µL를 섞어 암실에서 14 h 반응시켰다. 이를 에탄올과 1:88 비율로 섞어 734 nm에서 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료용액 150 µL와 ABTS solution 3 mL를 혼합하여 30 s 동안 vortex후 3 min 동안 상온에서 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5. Elastase 활성 억제능 측정
Elastase 활성 억제능 측정은 Cannell 등의 방법을 변형하여 측정하였다(Cannell et al., 1988). 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20 min 동안 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정한 후 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 mL씩 시험관에 취하고, 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5 U/mL) 용액 0.5 mL을 가한 후 기질로 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (0.5 mg/mL)을 첨가하여 20 min동안 반응시켜 측정하였다.
6. 세포 생존율 측정
96 well plate에 인체섬유아세포(CCD-986sk)를 1×105 cells/well씩 분주 한 후, 24 h 동안 세포가 plate에 잘 붙도록 37℃, 5% CO2 세포 배양기에 배양하였다. 24 h 후 배양액을 버리고 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS; Thermo Fisher Scientific, USA)로 세척한 다음 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 주었다. 배양 후 well에 2.5 mg/mL 농도로 제조된 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)용액 40 µL를 첨가하여 4 h 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, USA) 150 µL를 가하여 실온에서 30 min 동안 반응시킨 뒤 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
세포생존율(%)=(시료첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100
7. Pro-collagen synthesis
Pro-collagen type-1의 콜라겐 생합성능을 측정하기 위해 인체 섬유아세포인 CCD 986sk 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well 농도로 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 접종 후 37℃, CO2 incubator에서 24 h 배양하였다. 24 h 후 배지를 제거하여 Phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척한 뒤 200 µL의 PBS를 첨가하여 UVB를 20 mJ/cm2로 1 min 동안 조사하였다. PBS를 제거하고 1%의 penicillin streptomycin과 10%의 FBS가 함유되지 않은 serum free DMEM 배지로 교체한 후 추출물을 처리하여 24 h 동안 배양하였다. 그 후 세포 배양액을 수거하여 Pro-collagen type-1 C-peptide (PIP) EIA Kit (MK101, Takara, Japen)를 사용하여 정량분석 하였다.
8. 자료분석 및 통계처리
결과는 각 실험그룹별 평균 표준편차(standard deviation, S.D.)로 표기하였고, 실험데이터는 대조군과 샘플처리 그룹 간 Student's t-test를 이용하여 처리하였다. 통계적 유의성은 p-value가 0.05 미만인 것으로 판정하였다.
Results and Discussion
1. 비파나무 잎 효소추출물의 아미노산 분석
비파나무 잎을 이용하여 효소추출을 진행하여 성분변화를 확인하고자 구성 아미노산 분석을 진행하였다. 비파나무 잎 효소추출물은 총 16종의 아미노산이 검출되었으며, 주요 아미노산은 aspartic acid, glutamic acid, arginine로 확인되었으며, 필수 아미노산 비율은 약 21.76% 정도 나타났다(Table 1). 선행연구에서 비파나무 잎의 성분 분석 결과 필수아미노산의 비율은 약 50% 정도 높게 나타났으며 이를 이용한 에탄올 추출물에서 항산화 효과를 확인하였다(Hwang et al., 2010). 단백질분해효소를 이용하여 가수분해 시 기능적 특징을 개선시킨 연구가 보고되었다(Kim et al., 2019). Jang & Yoon (2018)의 연구에서 식품에 효소를 이용한 가수분해물을 제조 시 기존보다 항염증 펩타이드 활성이 높게 나타났으며, 단백질 분해과정을 통해 펩타이드 등의 중간 산물에 의한 다양한 생리 활성에 관여하는 것을 보고하였다. 본 연구에서도 비파나무 잎을 이용한 효소추출물을 제조하여 효소에 의한 분해를 통해 아미노산 비율의 변화를 관찰하였으며 이를 통해 생리활성을 확인하고자 하였다.
Contents of amino acids of Eriobotrya japonica leaf enzyme-assisted extract
2. 비파나무 잎 효소추출물의 항산화 효능 확인
비파나무 잎 효소추출물의 항산화 효능을 확인하기 위해서 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 확인하였다. 비파나무 잎 효소추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 평가한 결과 농도 의존적으로 증가한 것으로 나타났다. 특히 100 µg/mL에서 90.17±0.09%의 활성은 양성대조군으로 사용한 vitamin C의 91.60±0.09%의 활성과 유사하였다. ABTS라디칼 소거 활성을 확인한 결과 농도 의존적으로 라디칼 소거활성이 증가하였으며, 최대 500 µg/mL에서 96.91±0.02%의 활성을 가진 것을 확인하였다(Table 2). 천연물에는 폴리페놀의 함량, DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성과의 상관관계가 있다고 보고되었다(Balasundram et al., 2006). 선행 연구를 통해 비파나무 잎을 이용한 에탄올 추출물 약 500 ppm에서 15.77 mg/mL, 열수 추출물에서 28.91 mg/g 등의 폴리페놀이 함유되어 있다고 보고되었으며, 이를 통해 항산화 활성 및 라디칼 소거능이 우수하다고 확인되었다(Hwang et al., 2010; Jeong et al., 2009). 본 연구에서 비파나무 잎 효소추출물의 우수한 라디칼 소거 활성을 통해 항산화 활성을 나타내었으며 vitamin C와 유사한 활성을 가진 것으로 확인되었다.
DPPH and ABTS radical scavenging activities of Eriobotrya japonica leaf enzyme-assisted extract
3. 비파나무 잎 효소추출물의 elastase 저해 활성 확인
비파나무 잎 효소추출물의 주름개선 효능을 확인하기 위해 elastase 저해 활성을 확인하였다. 탄력 섬유 활성에 관여하는 elastase 효소는 탄성섬유의 뒤틀림에 관여하여 활성 증가는 탄력을 감소하여 피부 주름 형성에 관여한다고 알려져 있다(Tsuji, 2001). 비파나무 잎 효소추출물의 elastase 저해 활성을 확인한 결과 최대 500 µg/mL에서 41.15±1.96%의 활성 억제를 나타내었다(Table 3). 비파나무 열매의 에탄올 추출물은 통해 항산화 및 미백 등의 활성이 보고되어 비파나무 소재가 기능성 화장품 소재로서 가능성을 확인하였다(Yun et al., 2022). 본 연구에서 비파나무 잎을 이용한 효소추출법을 통해 피부 탄력에 관여하는 elastase 저해 활성을 확인하여 주름개선 효능에 관여하는 것을 확인하였다.
Inhibition of elastase activity of Eriobotrya japonica leaf enzyme-assisted extract
4. 비파나무 잎 효소추출물의 세포 독성 결과
비파나무 잎 효소추출물의 주름개선 효능을 확인하기 위해 인체 섬유아세포인 CCD-986sk 세포의 세포독성을 측정하였다. 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 formazan 색소로 변화되는 원리로 한 실험으로 비파나무 잎 효소추출물을 농도별로 처리하여 확인하였다. 최대 500 µg/mL 처리 시 세포 생존율이 95% 이상으로 나타났다(Figure 1). 이에 본 실험에서 비파나무 잎 효소추출물은 500 µg/ mL 이하의 범위에서 세포독성이 거의 없는 것으로 사료되어 농도 범위를 고려하여 실험을 진행하였다.
Cytotoxic effects of Eriobotrya japonica leaf enzyme-assisted extracts in human fibroblasts (CCD986-sk).
CCD986-sk cells were treated with EJLE in a dose-dependent manner. Samples were measured using ELISA. ELISA: enzymelinked immunosorbent assay, EJLE, Eriobotrya japonica leaf enzyme-assisted extract.
5. 비파나무 잎 효소추출물의 pro-collagen 합성 증가 활성
UVB등의 자외선에 노출된 피부는 collagen의 활성 조절을 통해 피부를 보호한다. 이에 비파나무 잎 효소추출물의 주름개선 효능을 확인하기 위해 pro-collagen의 양을 측정하였다. 비파나무 잎 효소추출물은 농도의존적으로 pro-collagen 생성량을 증가시켰다. UVB에 의해 조사된 섬유아세포에 100, 500 µg/mL의 농도에서 대조군보다 각각 약 36%, 52%의 증가된 활성을 유의하게 확인하였다(Figure 2). 본 연구를 통해 비파나무 잎을 이용한 효소추출물은 pro-collagen 생성 및 탄력에 관여하는 elastase 저해 활성을 통해 피부 주름개선에 영향을 미치는 것으로 확인되며 추출물 내 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Effects of enzyme-assisted extracts of Eriobotrya japonica leaf on procollagen type-I synthesis in human fibroblasts (CCD986-sk).
CCD986-sk cells were treated with varied concentrations of EJLE. Vitamin C was used as a positive control. Each bar represents the mean±SD derived from three independent experiments. *p<0.0.05 indicates statistical significance. EJLE, Eriobotrya japonica leaf enzyme-assisted extract.
Conclusion
본 연구에서는 제주 지역의 비파나무 잎을 이용하여 효소추출물을 제조하고 피부주름 개선 효능을 확인하고자 하였다. 비파나무 잎 효소추출물의 구성 아미노산 분석을 통해 16종의 아미노산을 확인하였으며 약 21.76%의 필수아미노산을 함유하는 것을 확인하였다. DPPH 라디칼 소거능은 약 100 µg/mL에서 90.17±0.09%의 활성을 확인하였으며, 양성대조군으로 사용한 vitamin C의 활성과 유사하였다. 또한, ABTS 라디칼 소거 활성도 농도의존적으로 활성이 증가한 것을 확인하였다. 피부 주름개선 효능을 확인하고자 elastase 저해 활성을 확인한 결과, 최대 500 µg/mL에서 41.15±1.96%의 저해능을 나타내었다. 피부 내 콜라겐 생성에 관여하는 인자인 pro-collagen type-1 생성능도 농도 의존적으로 유의하게 증가한 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 사용된 비파나무 잎을 이용한 효소추출물이 주름개선 기능성 화장품 소재로 가능성을 확인하였다.
Acknowledgements
본 연구는 중소벤처기업부와 중소기업기술정보진흥원의 "지역 특화산업육성+(R&D, S3271181)"사업의 지원을 받아 수행된 연구결과입니다.
Notes
Author's contribution
JW Kang: Conceptualization, Methodology, Supervision, Validation, Writing- Original Draft, Funding Acquisition; SH Yuun, HM Kim, and DH Yoo: Methodology, Formal analysis, Validation; HE Cho: Conceptualization, Funding Acquisition, Validation; IC Lee: Conceptualization, Supervision, Writing-Review & Editing, Project administration. All authors read and confirmed the final version of the manuscript.
Author details
Jung Wook Kang (Assistant Professor), College of Fusion and Convergence, Seowon University, 377-3 Musimseoro, Seowon-gu, Cheongju-si, Chungchengbuk-do 28674, Korea; Seung Hun Hyun (Researcher), Durae Corporation, Jeju Bio Center, Jeju-si 63359, Korea; Hyo Min Kim (Graduate Student), College of Pharmacy, Kyungpook National University, Buk-hu, Daegu 41566, Korea; Seung Hun Hyun (Researcher), Durae Corporation, Jeju Bio Center, Jeju-si, 63359, Korea; Dan Hee Yoo (Assistant Professor), College of Fusion and Convergence, Seowon University, 377-3 Musimseoro, Seowon-gu, Cheongjusi, Chungchengbuk-do 28674, Korea; Hang Eui Cho (Director), Creative Innovation Research Center, Cosmecca Korea, Co. Ltd., 6th Floor, ABN Tower, 331 Pangyo-ro, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, Korea; In Chul Lee (Associate Professor), Department of cosmetic science and technology, Seowon University, 377-3, Mus imseo-ro, Seowon-gu, Cheongju-s i, Chungcheongbuk-do 28674, Korea.