로스팅 공정에 의해 향상된 우슬 뿌리 추출물의 항산화 및 미백 효과
Roasting-Induced Enhancement of Antioxidant and Whitening Effects in Achyranthes bidentata Root Extracts
烘烤诱导增强牛膝根提取物的抗氧化和美白效果
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Abstract
목적
본 연구는 로스팅 공정이 우슬(Achyranthes bidentata) 뿌리 추출물의 항산화 및 미백 활성에 미치는 영향을 탐구하고, 추출물의 화학적 변화를 파악하고자 하였다.
방법
우슬 뿌리를 150℃와 200℃에서 각각 10, 20, 30 min 동안 로스팅한 후 열수 추출을 수행하였다. 항산화 활성(DPPH 및 ABTS 라디칼 소거), 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, 타이로시나제 저해 활성을 평가하였으며, UV-Vis, FT-IR, HPLC-UV를 통해 화학적 변화를 분석하였다.
결과
로스팅에 의해 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 유의하게 증가하였으며, 200℃에서 30 min 처리 시 각각 13.54 mg AAE/g 및 16.18 mg AAE/g으로 최대 항산화 활성을 보였다. 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 1.35 mg GAE/g에서 4.89 mg GAE/g, 0.054 mg QE/g에서 1.276 mg QE/g으로 크게 증가하였다. 로스팅 전에는 거의 없었던 타이로시나제 저해 활성도 로스팅 후 크게 증가하였으며, 200℃에서 30 min 처리 시 가장 높은 저해 활성을 나타냈다. 상관관계 및 주성분 분석 결과, 로스팅 조건과 항산화 및 미백 활성 간에 강한 양의 상관관계가 확인되었다. 또한, UV-Vis 분광분석을 통해 폴리페놀 및 멜라노이딘과 관련된 흡광 피크가 증가하였고, FT-IR 및 HPLC-UV 분석에서 로스팅에 의해 새로운 화합물이 형성된 것을 확인하였다.
결론
본 연구의 결과는 로스팅 공정이 우슬 뿌리 추출물의 항산화 및 미백 활성을 향상시키는 데 기여함을 입증하며, 향후 우슬 뿌리와 같은 천연물 소재의 생리활성 강화를 위한 로스팅 공정의 최적화 연구에 중요한 기초자료를 제공한다.
Trans Abstract
Purpose
To explore the effects of roasting on the antioxidant and whitening activities of Achyranthes bidentata root extracts, targeting the changes in bioactive compounds.
Methods
A. bidentata roots were roasted at 150°C and 200°C for 10, 20, and 30 min, followed by hot water extraction. The antioxidant activities (DPPH and ABTS radical scavenging), total polyphenol and flavonoid contents, and tyrosinase inhibition activities were evaluated. Chemical changes were assessed using UV-Vis, FT-IR, and HPLC-UV spectroscopy.
Results
Roasting significantly enhanced the DPPH and ABTS radical scavenging activities, with the highest antioxidant activity recorded at 200°C for 30 min (13.54 and 16.18 mg AAE/g, respectively). The total polyphenol and flavonoid contents also increased markedly, from 1.35 mg GAE/g to 4.89 mg GAE/g and from 0.054 mg QE/g to 1.276 mg QE/g, respectively. Tyrosinase inhibition, initially negligible in unroasted extracts, showed a substantial increase after roasting, with the highest inhibition observed at 200°C for 30 minutes. Correlation and principal component analyses revealed strong positive relationships between the roasting conditions and bioactive compound levels. Additionally, UV-Vis spectroscopy identified increased absorption peaks related to polyphenols and melanoidin, whereas FT-IR and HPLC-UV fingerprint analyses confirmed significant chemical changes and formation of new compounds due to roasting.
Conclusion
The study results demonstrated that the roasting process contributes to enhancing the antioxidant and whitening activities of A. bidentata root extracts, providing valuable foundational data for future studies on optimizing the roasting process to strengthen the bioactivity of natural materials, such as the A. bidentata roots.
Trans Abstract
目的
以生物活性化合物的变化为目标，探讨烘焙对牛膝根提取物抗氧化和美白活性的影响。
方法
将牛膝根在150℃和200℃下，烘烤10、20和30 min，然后进行热水提取。评估抗氧化活性(DPPH和ABTS自由基清除)、总多酚和黄酮含量以及酪氨酸酶抑制活性。使用UV-Vis、FT-IR和HPLC-UV光谱评估化学变化。
结果
烘烤显着增强了DPPH和ABTS自由基清除活性，其中在200℃ 30 min时，抗氧化活性最高(分别为13.54和16.18 mg AAE/g)。总多酚和类黄酮含量也显着增加，分别从1.35 mg GAE/g增加到4.89 mg GAE/g，从0.054 mg QE/g增加到1.276 mg QE/g。酪氨酸酶抑制最初在未烘烤的提取物中可以忽略不计，但在烘烤后显示出大幅增加，在200℃ 30 min时，观察到最高抑制。相关性和主成分分析揭示了烘焙条件和生物活性化合物水平之间强烈的正相关关系。此外，UV-Vis光谱发现与多酚和类黑素相关的吸收峰增加，而FT-IR和HPLC-UV指纹分析证实了由于烘焙而发生的显着化学变化和新化合物的形成。
结论
研究结果表明，烘烤工艺有助于增强牛膝根提取物的抗氧化和美白活性，为今后优化烘烤工艺以增强牛膝根等天然材料的生物活性的研究提供了有价值的基础数据。
Introduction
생리활성을 지닌 천연물은 수 세기에 걸쳐 피부 관리를 위해 사용되었으며, 현대에 와서는 화장품 제형 및 성분으로 널리 활용되고 있다(Ribeiro et al., 2015). 천연물은 합성 화학 물질에 비해 생체 적합성이 높은 경향이 있고(Michalak, 2023; Alves et al., 2020), 항산화(Akbari et al., 2022), 항염(Rodríguez-Yoldi, 2021), 미백(Zhao et al., 2022) 등의 다양한 생리활성을 제공한다. 특히, 항산화 활성이 있는 천연 추출물은 피부의 산화 스트레스를 줄여 손상을 방지하는 동시에 화장품 제형의 산화 분해를 늦출 수 있다(Hoang et al., 2021). 최근 몇 년간 화장품 시장에서는 항산화 활성을 지닌 천연물의 수요가 증가했으며, 앞으로도 계속해서 증가할 것으로 예상된다(Fonseca et al., 2023).
우슬(Achyranthes bidentata)은 다양한 생리활성을 지닌 천연물로 중국, 인도 및 한국에서 전통적인 약재로 사용했으며, 전통 의학에서 중요한 위치를 차지한다(Li, 2015). 우슬 추출물은 다양한 생리활성을 기반으로 근골격계 질환, 생리통, 요통, 혈액 순환 개선에 사용되었으며(Chen et al., 2024), 항산화, 항염증, 항주름 효과가 있고(UM, 2021), 멜라닌 합성 억제와 콜라겐 분해효소 활성 저해 효과가 있음을 확인했다(Kim & Song, 2022). 이처럼 우슬의 생리활성 연구는 많은 주목을 받고 있으나, 대부분의 실험은 에틸 아세테이트, 부탄올, 헥산 등 유기용매로 추출하거나 분획한 물질을 대상으로 하고 있으며, 열수 추출물의 경우 다른 분획물에 비해 상대적으로 낮은 효능을 보이는 것으로 나타났다(UM, 2021; Kim & Song, 2022).
천연물을 유기용매로 추출하거나 분획한 물질은 높은 효능을 보이지만, 생산 단가가 높아 상용화에 어려움이 있다(Serna-Vázquez et al., 2021). 또한, 추출 및 정제 과정으로 발생하는 유기성 폐기물 가스는 쉽게 휘발되어 환경으로 방출되고 악취를 유발한다(Chemat et al., 2012). 비닐 아세테이트 및 부틸 아세테이트는 오존 생성에 영향을 미치고(Ma & Li, 2024), 헥산은 생산 시 화석연료를 사용하여 대기오염 물질을 배출한다(Chemat et al., 2019).
이에 비해 물을 용매로 하는 열수 추출은 경제적이고 환경친화적인 방법이다(Sadatshojaei & Wood, 2021). 열수 추출은 비용이 저렴하고 생산 시 취급이 안전하며, 처리 및 분해가 편리하다(Lajoie et al., 2022). 그러나 열수 추출은 특정 생리활성 성분의 농도가 높지 않다는 한계가 있으며(Krisanti et al., 2021), 이를 극복하기 위해 동결 건조, 대류 건조, 마이크로파 진공 건조, 효소 공정, 발효 등의 전 처리 공정이 개발되었다(Krakowska-Sieprawska et al., 2022).
전처리 공정에는 증기처리(steaming), 볶기(stir-frying), 마이크로파 공정(microwave processing), 그릴링(grilling), 로스팅(roasting)과 같은 열처리 공정도 포함된다(Mwebi & Ogendi, 2020; Olędzki & Harasym, 2024). 특히, 로스팅 공정은 90-260℃의 온도 범위에서 내용물을 고르게 가열 처리함으로써 식품 매트릭스의 구조적 변형을 촉진하고(Zhang et al., 2021), 식물의 세포벽을 파괴하여 미량 및 거대 영양소의 추출을 용이하게 한다(Sruthi et al., 2021). 호박씨(Peng et al., 2021), 땅콩(Zhang et al., 2022a), 호두(Li et al., 2023), 메밀(Ma et al., 2020), 커피콩(Bobková et al., 2020), 테프 곡물 등 다양한 천연물에서 로스팅이 미치는 긍정적인 영향이 다수의 연구를 통해 입증되었다(Ahmed et al., 2021). 로스팅 처리된 천연물은 일반적으로 총 페놀 화합물 및 총 플라보노이드가 증가하며(Zhang et al., 2022a), 일부 경우에는 카로티노이드 함량도 증가하는 것으로 나타났다(Li et al., 2023). 또한, 로스팅 과정 중 환원당과 아미노산이 반응을 일으키는 메일라드(maillard) 반응이 발생하는데, 그 결과 고분자 갈색 중합체인 멜라노이딘(melanoidin)이 형성된다(Yu et al., 2023). 멜라노이딘은 대체로 높은 항산화 및 항균 활성을 나타내며(Martinez-Gomez et al., 2020; Kukuminato et al., 2021), 장내 유익한 미생물의 성장을 촉진하여 프리바이오틱스로서의 기능을 수행하고(Pérez-Burillo et al., 2020), UVA 영역에서 광보호 기능을 제공하여 자외선 차단 소재로서의 가능성도 제시한다(Kim et al., 2020).
이러한 선행연구를 토대로 본 연구에서는, 로스팅 전처리 공정을 통해 얻은 우슬 뿌리 추출물이 기존의 우슬 뿌리 추출물보다 높은 항산화 및 미백 활성을 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였으며, 이러한 결과는 우슬의 활용 가능성을 더욱 확장시킬 수 있는 기초 데이터가 될 것으로 기대한다.
이에 본 연구에서는 우슬 뿌리의 로스팅 전처리 공정이 열수 추출물의 항산화 활성, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, tyrosinase 저해 활성에 미치는 영향을 분석하고, UV-Vis Spectrum, FT-IR Spectrum, HPLC-UV fingerprints를 통해 로스팅 과정으로 인한 화합물의 변화를 확인할 것이다. 이러한 연구는 단순히 우슬의 항산화 및 미백 효능을 밝히는 데 그치지 않고, 천연물 추출의 경제성과 효능을 동시에 극대화할 수 있는 방법을 제시함으로써, 화장품 산업에서의 응용 가능성을 열어주며, 천연물 산업의 지속 가능한 발전에 기여할 수 있을 것이다.
Methods
1. 실험 재료
본 연구에 사용한 우슬 뿌리는 농업회사법인 주식회사 두손애약초(Korea)에서 국내산 우슬 100%를 구입하여 사용하였다. 실험에 사용하기 전에 깨끗이 세척하고 desiccator (Duran Group, Germany)에서 건조한 후, blender (Shinil Industrial Co., Ltd., Korea)로 10 s간 2번 분쇄하였다. 이후, 6가지의 조건에 따라 우슬 뿌리를 로스팅하였다(Table 1). 로스팅한 샘플은 80℃에서 1:25 비율로 hot plate & magnetic stirrer (Misung scientific Co. Ltd., Korea)에서 열수 추출한 후 freeze dryer (FDUT-8680; Operon Co., Ltd., Korea)로 동결 건조하여 시료를 준비하였다.
Roasting conditions for samples
2. DPPH 라디칼 소거 활성 측정
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성은 Lee et al. (2023)의 방법을 참고하였다. DPPH 시약(Biomax, Korea)을 ethyl alcohol 99.9% (Duksan Pure Chemicals, Korea)에 0.1 mM이 되도록 혼합하여 DPPH 용액을 제조한 후, 150 μL의 DPPH 용액과 1 mg/mL로 희석한 각 시료 150 μL를 96-well plate에서 혼합하였다. 혼합물을 암실에서 30 min간 반응시킨 후 microplate reader (VersaMax; Molecular Devices, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거 활성은 ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA)의 농도별 표준곡선을 작성 후 비교하여 ascorbic acid equivalent (mg AAE/g)로 표현하였다.
3. ABTS 라디칼 소거 활성 측정
2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) 라디칼 소거 활성은 Boulebd (2020)의 방법을 참고하였다. ABTS (Aladdin, China)와 2.6 mM potassium persulfate (Samchun Pure Chemical, Korea)를 반응시켜 ABTS•+용액을 제조한 후, 혼합물을 암실에서 16 h 동안 방치하고, microplate reader를 이용하여 734 nm에서 흡광도가 1.00±0.10이 되도록 정제수로 희석하였다. 20 μL의 1 mg/mL로 희석한 각 시료와 200 μL의 ABTS•+ 희석용액을 96-well plate에서 혼합하여 실온에서 30 min간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거 활성은 ascorbic acid의 농도별 표준곡선을 작성 후 비교하여 ascorbic acid equivalent (mg AAE/g)로 표현하였다.
4. 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량(total phenolic contents, TPC)은 Lawag et al.(2023)의 논문을 참고하여 변형된 Folin-Ciocalteu 방법을 사용하였다. 각 시료를 1 mg/mL 농도로 준비한 후, 1 mL 시료를 시험관에 취하여 1 mL의 Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 이 혼합물에 1 mL의 sodium carbonate (Sigma-Aldrich) 2% 수용액을 더하여 혼합한 후, 암실에서 30 min간 방치하였다. 이후 microplate reader로 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 총 폴리페놀 함량은 gallic acid (Sigma-Aldrich)를 이용한 표준 곡선을 통해 계산하였다. 결과는 gallic acid equivalent (mg GAE/g)로 나타내었다.
5. 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량(total flavonoid contents, TFC)은 Kim et al. (2019)의 방법을 참고하여 측정하였다. 각 시료를 1 mg/mL 농도로 준비한 후, 0.2 mL의 시료를 시험관에 취하였다. 이후 sodium hydroxide (Samchun Pure Chemical, Korea) 1N 수용액 0.2 mL와 diethylene glycol (Samchun Pure Chemical) 2 mL를 첨가하였다. 시험관 내의 혼합물을 37℃에서 1 h 동안 반응시킨 후 microplate reader로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin (Sigma-Aldrich)을 사용하여 표준곡선을 작성하였으며, 각 시료의 총 플라보노이드 함량을 quercetin equivalent (mg QE/g)로 계산하였다.
6. Tyrosinase 저해 활성 측정
Tyrosinase 저해 활성은 Mahdavi et al. (2022)의 방법을 참고하여 다음과 같은 절차를 통해 측정하였다. 먼저, 각 시료를 기존 연구에서 사용된 농도 범위(Hong et al., 2014; Yang et al., 2016)을 참고하여 5 mg/mL 및 10 mg/mL 농도로 준비하였다. 시료 50 μL를 96-well plate에 첨가한 후, 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8)를 100 μL, 1000 U/mL로 희석한 mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich)를 50 μL씩 추가하였다. 30℃에서 5 min간 반응시킨 후, 100 μL의 0.1%로 희석한 l-dopa (Sigma-Aldrich)를 추가하여 반응을 시작하였으며, 30 min 후 microplate reader로 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 미백 효과가 우수하고 다양한 연구에서 표준물질로 널리 사용되는 kojic acid (Sigma-Aldrich)를 채택하였다(Lim & Bae, 2023; Kim et al., 2017). Tyrosinase 저해율은 우슬 뿌리 추출물의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
저해율 (%)=(1-(우슬 추출물 첨가구의 흡광도)/(무 첨가구의 흡광도))×100
7. 상관관계 분석
Muflihah et al. (2021)의 방법을 참고하여 생리활성(DPPH, ABTS, tyrosinase 저해활성)과 식물성 화합물 함량(TPC, TFC)간의 상관관계를 평가하였다. Pearson correlation coefficients를 계산하기 위해 GraphPad Prism ver. 8.0 (GraphPad Software, Inc., USA)의 Correlation 분석을 사용하였으며, 변수 간의 유의미한 상관관계를 식별하기 위해 heatmap으로 나타내었다.
8. 주성분 분석 및 회귀 분석
DPPH, ABTS, TPC, TFC 및 tyrosinase 저해활성 간의 다중공선성을 해결하기 위해 주성분 분석(principal component analysis, PCA)을 R Software 4.4.1 for Windows (R Foundation for Statistical Computing, Austria)를 사용하여 수행하였다. R의 FactoMineR 패키지를 사용하여 PCA를 통해 변수 간의 주요 변동성을 설명하는 주성분들을 추출하였으며, 분석 결과는 ggplot2 패키지를 사용하여 시각화하였다. 이후 추출된 주성분을 독립 변수로 하여 회귀 분석을 수행하였으며, 이를 통해 로스팅 온도와 시간이 항산화 활성에 미치는 주요 영향을 확인하였다.
9. UV-Visible Spectroscopy 측정
자외 및 가시선 분광법(UV-Visible Spectroscopy, UV-Vis)을 사용하여 각 시료의 흡광도를 측정하였다. 시료를 1 mg/mL 농도로 희석한 후, quartz cell에 담아 UV spectrophotometer (UV-2550; Shimadzu, Japan)를 사용하여 200 nm에서 600 nm사이의 파장 범위에서 1 nm 간격으로 측정을 수행하였다. 이를 통해 각 파장의 흡광도를 측정하여 그래프로 나타내었다.
10. Fourier Transform Infrared Spectroscopy 측정
푸리에 변환 적외선 분광법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy; FT-IR)을 사용하여 로스팅 처리되지 않은 우슬 뿌리 추출물(A0)과 200℃에서 30 min 로스팅 처리된 우슬 뿌리 추출물(A200C)을 분석하였다. 시료는 건조된 상태로 준비하였으며, 측정은 FT-IR 분광기(Nicolet IS50; Thermo Fisher Scientific, USA)에 장착된 integrated diamond ATR (감쇠 전반사)를 사용하여 수행하였다. 각 스펙트럼은 525 cm-1에서 4000 cm-1 범위에서 얻었다.
11. Non-Targeted HPLC-UV Fingerprints 측정
고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC) 분석을 사용하여 로스팅 처리되지 않은 우슬 뿌리 추출물(A0)과 200℃에서 30 min 로스팅 처리된 우슬 뿌리 추출물(A200C)의 화학적 성분 변화를 비교하였다. 각 시료는 20 mg/mL 농도로 희석하여 사용하였으며, 기기는 Agilent 1200 System (Agilent Technologies, USA)을 사용하였다. 분석에 사용된 column은 inspire 5 μm C18 (Dikma Technologies Inc., USA)이며, column oven의 온도는 40℃로 유지하였다. 검출기로는 diode array detector를 사용하였으며, 검출 파장은 280 nm로 결정하였다. 시료 주입량은 20 μL이었고, 유속은 1 mL/min으로 설정하였다. 이동상은 물과 acetonitrile로 구성되었으며, 처음 100:0의 비율에서 시작하여 30 min 동안 점차 50:50으로 조정되었다. 40 min 후 이동상은 원래의 100:0 비율로 복귀하였다.
12. 통계 분석
모든 실험 결과는 세 번 반복 측정하여 평균값과 표준편차로 나타내었다. 데이터의 유의성 검증은 GraphPad Prism version 8.0을 이용하여 ANOVA와 Dunnett's multiple comparisons test를 통해 수행하였다. 유의수준은 p<0.05로 설정하였다.
Results & Discussion
1. 로스팅한 우슬뿌리 추출물의 항산화 활성 개선 효과
DPPH 라디칼 소거 활성은 항산화 능력을 측정하는 대표적인 방법으로, 라디칼 소거 활성이 높을수록 항산화 능력이 강함을 의미한다. 본 연구에서는 다양한 로스팅 조건에 따른 우슬 뿌리 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. A0가 0.87±0.60 mg AAE/g으로 가장 낮은 활성을 보였으며, 로스팅 온도 및 시간 조건이 강화됨에 따라 활성이 증가하여, A200C는 가장 높은 활성인 13.54±0.36 mg AAE/g을 나타내었다(Figure 1A). 보다 포괄적인 항산화 능력을 평가하기 위해 수행한 ABTS 라디칼 소거 활성 분석에서도 비슷한 경향이 관찰되었다. A0는 6.09±0.06 mg AAE/g의 활성을 보였으며, A200C는 16.18±0.13 mg AAE/g으로 가장 높은 항산화 활성을 보였다(Figure 1B). 이는 로스팅이 우슬의 항산화 활성을 증가시키는 데 기여했음을 시사한다.
Antioxidant activity of roasted Achyranthes bidentata root extracts.
Effects of different roasting conditions on the antioxidant activity, specifically (A) DPPH and (B) ABTS radical scavenging activities, of A. bidentata root extracts. The experiment was performed in triplicate, and the results are presented as the mean±SD. ANOVA showed a significant difference (p<0.0001). As confirmed by Dunnett’s test, all roasted samples were compared to the unroasted control group (A0). Significance levels are indicated as *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.
2. 로스팅한 우슬뿌리 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 증가
폴리페놀 및 플라보노이드는 많은 수산기 그룹을 함유하고 있어, 자유 라디칼을 안정된 물질로 환원하여 라디칼 연쇄 반응을 효과적으로 막을 수 있는 대표적인 항산화 성분이다(Lv et al., 2021). 본 연구에서는 다양한 로스팅 조건에서 우슬 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 평가하였다. 총 폴리페놀 함량 분석 결과, A0에서는 평균 1.35±0.06 mg GAE/g의 폴리페놀이 검출되었으며, 로스팅 조건의 강화와 함께 폴리페놀 함량도 점진적으로 증가하여, A200C에서는 평균 4.89±0.10 mg GAE/g의 함량을 나타내었다(Figure 2A). 플라보노이드 함량 역시 유사한 경향을 보였다. A0에서는 평균 0.054±0.059 mg QE/g의 플라보노이드가 검출되었고, 로스팅 조건이 강화됨에 따라 플라보노이드 함량이 증가하여, A200C에서는 평균 1.276±0.093 mg QE/g의 함량이 관찰되었다(Figure 2B).
Phytochemical contents of roasted Achyranthes bidentata root extracts.
Changes in the (A) total polyphenol and (B) total flavonoid contents of A. bidentata root extracts under different roasting conditions. The experiment was performed in triplicate, and the results are presented as the mean±SD. ANOVA showed a significant difference (p<0.0001). As confirmed by Dunnett’s test, all roasted samples were compared to the unroasted control group (A0). Significance levels are indicated as *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.
이러한 결과는 기존 연구와 일부 유사성을 보인다. Kim et al. (2018)의 연구에서는 전처리하지 않은 우슬 추출물의 총 폴리페놀 함량이 1.17 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량이 0.80 mg QE/g으로 보고되었으며, Lee et al. (2014)의 연구에서는 우슬 열수 추출물의 총 폴리페놀 함량이 4.76 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량이 0.84 mg QE/g으로 측정되었다. 또한, Lee et al. (2013)은 용매로 에탄올을 사용한 경우 총 폴리페놀 함량이 6.79 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량이 1.71 mg QE/g으로 증가하였음을 보고하였으며, Lee et al. (2014) 연구에서는 열수 추출 후 에틸아세테이트 분획을 통해 총 폴리페놀 함량이 4.72 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량이 2.92 mg QE/g으로 증가하는 경향을 확인하였다. 이처럼 유기용매 추출 및 분획은 열수 추출물의 한계를 보완하여 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 증가시킬 수 있으나, 이러한 공정은 추가적인 비용과 시간이 소요되는 단점이 있다. 본 연구는 로스팅 공정을 통해 보다 안전하고 효율적으로 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 높이고자 하였다. 그 결과, 로스팅 과정을 통해 총 폴리페놀은 최대 3.62배, 플라보노이드는 최대 23.63배 증가하였으며, 초기 함량이 상대적으로 낮은 것을 고려함에도 이러한 증가율은 두드러지는 결과이다. 이는 로스팅 과정이 우슬 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 증가시키는 중요한 인자로 작용함을 시사한다. Hassan et al. (2021)의 연구에서도 땅콩 껍질의 로스팅이 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 증가시키고, 결과적으로 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성이 현저히 증가하였는데, 이처럼 로스팅이 항산화 활성 성분 증가에 도움을 주는 요소임을 확인할 수 있다.
3. 로스팅한 우슬뿌리 추출물의 tyrosinase 저해 활성 개선 효과
Tyrosinase는 멜라닌 생합성에서 속도 결정단계를 담당하는 효소로, tyrosinase 저해 활성이 높을수록 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백에 효과적임을 의미한다(Li et al., 2021). 본 연구에서는 다양한 로스팅 조건에서 처리된 우슬 뿌리 추출물의 tyrosinase 저해 활성을 평가하였으며, 결과는 Figure 3과 같다. A0와 150℃에서 로스팅한 우슬 뿌리 추출물(A150A, A150B, A150C)은 낮은 활성을 보였으며, 서로 간의 유의한 차이는 없었으나, A200C에서는 활성이 크게 증가하여, 5 mg/mL 농도에서는 최대 5.21배, 10 mg mL 농도에서는 최대 3.09배 증가하였다. 이러한 결과는 Antonietti et al. (2022)이 연구한 바와 같이, 로스팅된 커피와 보리에서 발견 된 멜라노이딘의 높은 tyrosinase 저해 활성과 유사하다. 해당 연구에서는 로스팅 과정에서 생성되는 멜라노이딘이 tyrosinase 억제에 기여할 수 있음을 제시하였다. 따라서, 본 연구에서도 우슬 뿌리 추출물의 tyrosinase 저해 활성 증가가 로스팅 과정 중 생성된 멜라노이딘에 의해 부분적으로 설명될 수 있을 것으로 보인다.
Tyrosinase inhibition in roasted Achyranthes bidentata root extracts.
Effect of roasting on the tyrosinase inhibition activity of A. bidentata root extracts at concentrations of (A) 5 and (B) 10 mg/mL. The experiment was performed in triplicate, and the results are presented as the mean±SD. ANOVA showed a significant difference (p<0.0001). As confirmed by Dunnett’s test, the tyrosinase inhibition activity of the roasted samples was compared with that of the unroasted control group (A0). Significance levels are indicated as **p<0.01, and ***p<0.001.
4. 로스팅한 우슬뿌리 추출물 내 생리활성 성분 간의 상관관계 분석
상관행렬 그래프를 Figure 4에 나타내었다. 각 상관계수는 값이 1에 가까울수록 강한 양의 상관관계를 의미하는데, DPPH와 ABTS, TPC, tyrosinase 저해활성 간에는 매우 강한 양의 상관관계가 나타났으며, 각각의 상관계수는 0.953, 0.982, 0.928이었다. 또한, ABTS와 TPC, tyrosinase 저해활성 간의 상관계수도 0.979와 0.960으로 변수들 사이에 밀접한 연관성이 존재함을 보여주었다. TFC도 양의 상관관계를 보였지만, 다른 변수에 비해 상관계수가 낮았으며, 이는 로스팅 처리한 우슬 뿌리 추출물의 생리활성 증가가 플라보노이드보다 폴리페놀 함량의 증가와 더 밀접하게 연관되어 있을 가능성을 시사한다.
Correlation matrix of bioactivity and phytochemical contents in roasted Achyranthes bidentata root extracts.
(A) Representative images before and after cannabidiol (CBD)-microneedle patch (MNP) treatment at baseline. (B) Representative images at 48 h after CBD-MNP treatment (full and 2-fold magnification). (C) Representative images at 96 h after CBD-MNP treatment (full and 2-fold magnification). Site 1, negative control (normal saline); site 2-4, three test samples of the 0%, 1%, and 3% CBD-MNP treatments, respectively. TM, test materials.
5. 주성분 및 회귀 분석을 통한 생리활성 기여 요인
상관관계 분석에서 나타난 것처럼, DPPH, ABTS, TPC, TFC, tyrosinase 저해활성 간의 상관관계가 매우 강하므로(r>0.9), 주성분 분석을 통해 이러한 상관관계를 반영한 주요 주성분 Dim.1을 도출하였다. 주성분 Dim.1은 DPPH, ABTS, TPC, TFC 및 tyrosinase 저해활성의 변동성을 94.3% 설명하며, 전체 변동성을 대표하는 것으로 확인되었다. Dim.1을 회귀 분석에 독립 변수로 포함시키면, 다중 공선성 문제를 피하면서 특정 로스팅 온도와 시간이 DPPH, ABTS, TPC, TFC 및 tyrosinase 저해활성에 미치는 영향을 분석할 수 있다. 회귀 분석 결과(Table 2), 로스팅 온도는 Dim.1에 유의한 영향을 미치며(p=0.0035), 이는 150℃와 200℃ 범위 내에서의 로스팅 온도가 항산화 성분 및 생리 활성에 긍정적인 영향을 미침을 시사한다. 로스팅 시간의 경우, 전체적으로는 Dim.1에 미치는 영향이 통계적으로 유의하지 않았으나, 150℃와 200℃ 각각의 온도 조건에서 나누어 분석했을 때 유의한 영향을 나타냈다(p=0.0003, p<0.0001). 이는 150℃와 200℃ 범위 내에서, 로스팅 온도가 로스팅 시간보다 DPPH, ABTS, TPC, TFC 및 tyrosinase 저해활성에 더 큰 영향을 미친다고 해석할 수 있다.
Effect of roasting temperature and time on principal component Dim.1
6. 로스팅한 우슬뿌리 추출물의 폴리페놀 및 멜라노이딘 증가
UV-Vis 스펙트럼 분석을 통해 우슬 뿌리 추출물의 로스팅 처리에 따른 화합물의 흡광 특성을 확인하였다. Figure 5는 로스팅 조건에 따른 우슬 뿌리 추출물의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것으로, 로스팅하지 않은 A0는 약 200-300 nm 부근에서 흡광도가 완만하게 증가하였다. 150℃에서 로스팅한 A150A, A150B, A150C도 A0와 크게 다르지 않은 스펙트럼을 보이며, 뚜렷한 흡광 피크는 나타나지 않았다. 더 높은 온도인 200도에서 로스팅한 A200A, A200B, A200C의 경우, 흡광도가 A0, A150A, A150B, A150C에 비해 크게 증가하였다. 특히 A200C는 가장 높은 흡광도를 나타내었으며, 280 nm 부근에서 강한 흡광 피크가 나타났다. Kaeswurm et al. (2021)에 따르면, 폴리페놀은 280 nm에서 특징적인 흡광을 나타내며, 이는 UVVis 스펙트럼 분석에서 이들 화합물의 존재를 확인하는데 유용하다고 보고하였다. 또한, Echavarría et al. (2016)은 280-325 nm 범위에서 멜라노이딘의 흡광을 관찰하였으며, 이는 본 연구에서 높은 온도로 로스팅된 우슬 뿌리 추출물에서 관찰된 흡광 피크와 유사하다. 따라서, 이러한 결과는 로스팅 과정에서 폴리페놀 및 멜라노이딘과 같은 항산화 화합물이 구조적으로 강화되었거나, Maillard 반응을 통해 생성되었음을 시사한다.
UV-Vis spectra of roasted Achyranthes bidentata root extracts.
The UV-Vis spectra of the Achyranthes bidentata root extracts show increased absorbance peaks with higher roasting temperatures and longer roasting times, particularly around 280 nm.
7. 로스팅한 우슬뿌리 추출물의 화학적 구조 변화
FT-IR 스펙트럼 분석을 통해 우슬 뿌리 추출물의 로스팅 처리에 따른 화학적 구조 변화를 평가하였다. Table 3은 로스팅하지 않은 A0의 FT-IR 스펙트럼 피크를, Table 4는 가장 높은 온도와 시간 조건으로 로스팅한 A200C의 피크를 정리한 것이다. Figure 6은 A0와 A200C의 FT-IR 스펙트럼을 비교한 것으로, 로스팅에 따른 화학적 변화를 시각적으로 확인할 수 있다. A0와 A200C의 FT-IR 스펙트럼에서는 3400-3200 cm-1에서 수산기(-OH) 스트레칭 진동을 나타내는 강한 흡수 피크가 관찰되었다. Wongsa et al. (2022)에 따르면, 이는 폴리페놀 화합물의 특성을 나타내는 영역이다. 이 부분은 로스팅 전후로 변함이 없었다. 반면, A0에서 나타난 2940-2925 cm-1와 1680-1620 cm-1 피크는 각각 지방족 화합물의 -CH2- 스트레칭 진동과 방향족 화합물의 C=C 결합을 나타내는데(Nandiyanto et al., 2019), A200C에서 -CH2-의 피크 강도가 증가하였고, 반대로 C=C 결합의 진동 피크 강도는 감소하여, 로스팅으로 인한 지방족 화합물의 구조적 변화와 방향족 화합물의 휘발 및 분해를 확인할 수 있었다. 또한, A200C에서 새롭게 나타난 1123.92 cm-1의 피크는 C-N 결합에 해당하는데, 이는 기존의 단백질 구조가 변형되어 C-N 결합의 강도가 증가했거나, maillard 반응에 의해 생성된 멜라노이딘과 같은 새로운 화합물의 형성 가능성을 시사한다(Zhang et al., 2022b). Maillard 반응은 일반적으로 180℃ 이상의 고온에서 발생하기 때문에, A200C의 로스팅 온도가 200℃라는 점을 고려하면, 이 피크는 멜라노이딘 형성으로 인한 C-N 결합일 가능성이 높다. 따라서, 이러한 변화는 로스팅 처리에 따라 우슬 뿌리 추출물의 화학적 구조가 분명하게 변화하였으며, 그 결과 새로운 화합물이 형성되었음을 나타낸다.
FT-IR profile of A0
FT-IR profile of A200C
FT-IR analysis of roasted Achyranthes bidentata root extracts (A0, A200C).
FT-IR spectra of Achyranthes bidentata root extracts before (A0) and after roasting at 200°C for 30 min (A200C). Notable shifts in transmittance at specific wavenumbers indicate chemical structural changes, with increased peaks corresponding to newly formed functional groups.
8. 로스팅한 우슬뿌리 추출물의 화합물 구성 변화
로스팅 처리되지 않은 우슬 뿌리 추출물 A0와 200℃에서 로스팅한 우슬 뿌리 추출물 A200C의 화학적 변화를 비교하기 위해 HPLC-UV fingerprints 분석을 사용하였으며, 결과를 Figure 7에 나타냈다. 이는 Núñez et al. (2020)에서 커피 샘플의 로스팅 정도를 판별하기 위해 HPLC-UV fingerprints 분석을 사용한 방법과 유사하며, 이러한 접근법은 우슬 뿌리 추출물의 로스팅 전후 화합물 변화를 비교하는 데 효과적이다. A0의 HPLC 크로마토그램에서는 여러 개의 피크가 나타났으나, 대부분의 피크는 비교적 낮은 흡광도를 보였다(Figure 7A). 이는 A0가 상대적으로 단순한 화학적 구성을 가지고 있음을 보여준다. 주요 피크는 약 4, 5.5, 9 min 부근에서 관찰되었다. 반면, A200C의 HPLC 크로마토그램에서는 A0와 비교하여 피크의 수와 높이가 모두 크게 증가한 것이 관찰되었다(Figure 7B). 5 min에서 10 min 사이에 걸쳐 매우 두드러진 피크들이 나타났으며, 이는 로스팅 과정에서 새로운 화합물들이 생성되었거나 기존 화합물들의 농도가 크게 증가했음을 의미한다. 특히, 8.6 min 부근에서 관찰된 주요 피크는 A0에서는 거의 나타나지 않았던 반면, A200C에서는 매우 높은 흡광도를 보였다. 200℃에서 로스팅된 우슬 뿌리 추출물은 로스팅되지 않은 샘플에 비해 더 복잡한 화학적 구성을 가지며, 이는 로스팅 과정 중에 새로운 화합물들이 생성되었거나 기존 화합물들의 농도가 증가했음을 보여준다. 이러한 결과는 로스팅 조건이 우슬 뿌리 추출물의 항산화 활성 및 기타 생리활성에 미치는 영향을 평가하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있으며, 추가적인 정성 및 정량 분석을 통해 주요 화합물들을 식별하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Non-targeted HPLC-UV fingerprint chromatogram of roasted Achyranthes bidentata root extracts (A0, A200C).
The chromatograms show distinct peaks corresponding to different compounds, with higher intensity and additional peaks observed in the roasted sample (A200C) (B), indicating the formation of new compounds and changes in the chemical composition due to roasting. (A), A0, no roating treatment.
Conclusion
본 연구에서는 로스팅 조건에 따른 우슬 열수 추출물의 항산화 및 미백 효과 변화를 평가하였다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과, 로스팅 조건이 강화됨에 따라 항산화 능력이 크게 증가하였으며, 200℃에서 30 min간 로스팅된 추출물이 가장 높은 항산화 활성을 보였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 또한 로스팅 처리에 따라 유의하게 증가하였으며, 이는 로스팅 과정에서 활성화된 항산화 성분이 추출되었음을 시사한다. Tyrosinase 저해 활성 분석 결과, 200℃에서 로스팅된 우슬 뿌리 추출물이 멜라닌 생성을 억제하는 데 있어 가장 높은 활성을 보였으며, 이는 로스팅 중 생성된 멜라노이딘에 기인할 가능성이 제기되었다. UV-Vis 스펙트럼 분석에서는 고온 로스팅 처리된 샘플에서 폴리페놀과 멜라노이딘으로 예상되는 범위의 흡광 피크가 증가하였고, FT-IR 분석 결과, 로스팅으로 인해 우슬 뿌리 추출물의 화학적 구조에 변화가 생겼음을 확인하였다. 마지막으로 HPLC-UV Fingerprints 분석을 통해 로스팅 전후의 화학적 구성 변화를 비교하였으며, 고온 로스팅이 새로운 화합물의 생성 및 기존 화합물의 농도 증가를 명백하게 유도했음을 알 수 있었다. 이러한 연구 결과는 우슬 뿌리 추출물의 로스팅 조건에 따른 생리활성 변화의 이해를 돕고, 우슬 뿌리 추출물의 항산화 및 미백 제품으로서의 응용 가능성을 제시한다. 그러나 특정 화합물의 정성 분석은 미비한 부분이 있어, 향후 추가적인 정성 및 정량 분석을 통해 주요 화합물의 구조를 명확히 밝히는 후속 연구가 필요하다.
Notes
Author's contribution
SHL performed the experiments, analyzed the data, and wrote the manuscript. KEK supervised the research, reviewed, and revised the manuscript.
Author details
So Hee Lee (Graduate Student), Department of Health Industry, Sookmyung Women’s University, 100 Cheongpa-ro 47-gil, Yongsan-gu, Seoul 04310, Korea; Kyung Eun Kim (Professor), Department of Health Industry, Sookmyung Women’s University, 100 Cheongpa-ro 47-gil, Yongsan-gu, Seoul 04310, Korea.