해조류에서 추출한 PDRN의 항산화, 항염증 및 주름 개선 효과
Antioxidant, Anti-inflammatory, and Wrinkle-Improving Effects of PDRN Extracted from Marine Plants
海洋植物中提取的PDRN的抗氧化、抗炎、改善皱纹功效
Article information
Abstract
목적
본 연구는 해조류로부터 추출한 PDRN을 통해 항산화, 항염증 및 주름을 개선시키는 효과를 확인하고자 하였다.
방법
본사 특허 기술을 통해 해조류에서 PDRN을 추출하였다. DPPH 라디칼 소거능을 통해 시험물질의 항산화능을 확인하였고, Raw 264.7 세포에서 NO 저해 활성을 통해 항염증 효과를 확인하였다. CCD-986sk 세포에서 procollagen 생성능 분석과 3차원 배양피부모델을 통한 표피층 두께와 기저막의 콜라겐 발현을 통해 주름 개선 활성을 확인하였으며, 시험물질을 적용한 제품의 안면 4대 주름 개선 효과를 검증하였다.
결과
해조류에서 추출한 PDRN의 분자량은 5-40kDa, 순도는 1.9이며, 모든 농도에서 세포 생존율 80% 이상으로 확인되었다. DPPH 라디칼 소거능 및 NO 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하였다. Procollagen 생성능이 농도 의존적으로 증가하였으며, 3차원 배양피부모델의 표피층 두께 증가 및 기저막 콜라겐 발현이 ascorbic acid와 유사하게 나타났으며, 안면 4대 주름 인체 적용 시험을 통해 주름 개선 효과를 확인하였다.
결론
해조류 PDRN의 우수한 항산화, 항염증 및 주름 개선 효과를 입증하였으며, 기능성 화장품 소재로 활용 가능성을 시사한다.
Trans Abstract
Purpose
This study aimed to determine whether polydeoxyribonucleotide (PDRN)-containing extracts from marine plants have antioxidant, anti-inflammatory, and/or wrinkle-improving effects.
Methods
PDRN was extracted from a marine plant using a proprietary technology owned by our company. The antioxidant effect of marine plant PDRN was evaluated by quantifying 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, while its anti-inflammatory effects were assessed by quantifying NO inhibition in Raw264.7 cells. Finally, anti-wrinkle effects were evaluated through procollagen synthesis analysis in CCD-986sk cells, as well as by assessing epidermal layer thickness and collagen expression of the basement membrane through a 3D cultured skin model. In addition, the effects on the improvement of the four major facial wrinkles were verified in a human application test using a product formulated with marine plant PDRN.
Results
The molecular weight of marine plant PDRN was 5–40 kDa, with a purity of 1.9, and cell viability remained above 80% at all concentrations. DPPH radical scavenging and NO inhibitory activities increased in a concentration-dependent manner. Procollagen production increased similarly, and the increases in epidermal layer thickness and basement membrane collagen expression in the 3D cultured skin model were similar to those of ascorbic acid. Wrinkle improvement was further confirmed using a human application test on the four major facial wrinkles.
Conclusion
In this study we demonstrate that marine plant PDRN possesses strong antioxidant, anti-inflammatory, and wrinkle-improving effects, indicating that it may be suitable as a functional cosmetic ingredient.
Trans Abstract
目的
本研究旨在确定含有多聚脱氧核糖核苷酸(PDRN)的海洋植物提取物是否具有抗氧化、抗炎和/或改善皱纹的功效。
方法
采用本公司专有技术从海洋植物中提取PDRN。通过量化2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除活性来评估海洋植物PDRN的抗氧化作用，通过量化Raw264.7细胞中的NO抑制来评估其抗炎作用。最后，通过CCD-986sk 细胞中的前胶原合成分析以及通过3D培养皮肤模型评估表皮层厚度和基底膜胶原表达来评估抗皱作用。此外，使用含有海洋植物PDRN的产品在人体应用测试中验证了对四大面部皱纹的改善效果。
结果
海洋植物PDRN的分子量为5-40 kDa，纯度为1.9，在所有浓度下细胞存活率均保持在80%以上。DPPH自由基清除活性和NO抑制活性呈浓度依赖性增加。前胶原蛋白的产生也同样增加，并且在3D培养皮肤模型中，表皮层厚度和基底膜胶原蛋白表达的增加与抗坏血酸相似。通过对四大面部皱纹的人体应用测试，进一步证实了其改善皱纹的功效。
结论
本研究证明海洋植物PDRN具有强大的抗氧化、抗炎和改善皱纹的功效，表明它可能适合作为功能性化妆品成分。
Introduction
피부는 인체의 가장 외부에 위치하여 다양한 외부 자극으로부터 신체를 보호하는 중요한 역할을 수행한다(Choi et al., 2008). 피부는 자외선, 미세먼지 등 외부 환경적 요인에 지속적으로 노출되면 피부가 손상되고 생리 기능이 저하된다. 최근에는 피부 재생, 피부 손상 개선, 항산화 등의 효능을 갖는 소재 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 약리 작용을 가진 성분을 포함한 기능성 화장품의 필요성이 높아지고 있다. 기능성 화장품으로 분류되기 위해서는 피부의 기능을 유지해주는 제품, 미용적 결함을 교정해주는 제품이어야 한다(Lee & Park, 2014; Park et al., 2002; Yun et al., 2015). 대표적으로 미백 효과를 높이는 화장품 또는 주름 개선, 피부 재생 등을 유도하는 고기능성의 노화 방지 화장품이 있으며, 효능 및 안전성 기반의 화장품 성분에 대한 관심은 더욱 커질 것이다(Seo et al., 2024; Mukherjee et al., 2011; Kim et al., 2023). 특히, 대한민국은 고령사회로 진입하면서 주름 개선, 피부 미백과 같은 항산화 화장품에 대해 소비자들의 관심도 및 소비가 증가하고 있다(Kim, 2018; Ko, 2019; Park & Lee, 2023).
피부 노화를 일으키는 대표적인 요인으로는 콜라겐 합성 부족 및 피부 세포의 염증 증가 등이 있다. 콜라겐은 피부의 견고성, 결합조직의 저항력 및 결합력, 세포의 지탱, 세포 재생과 분화에 관여하며 진피층 내 콜라겐 감소는 피부 주름 형성과 밀접한 연관이 있다(Eklouh-Molinier et al., 2015; Youn et al., 2012). 또한 다양한 외부자극으로부터 신체를 방어하고자 체내에서 발생하는 활성 산소종에 의해 콜라겐의 생합성 및 분해 등 생체 구성 성분의 손상을 야기하고, 탄력 감소, 주름 형성, 염증 반응이 빈번하게 발생한다(Krutmann et al., 2021; Godley et al., 2005; van Triel et al., 2010; Lee et al., 2014; Farage et al., 2008; Rittié & Fisher, 2002).
최근 친환경 및 천연 성분에 대한 소비자의 관심이 높아지면서, 해조류는 화장품 산업에서 주목받는 원료로 부상하고 있다. 해조류는 바닷속에서 광합성을 하며 살아가는 생물로, 영양이 풍부하고, 생리 활성물질을 다량 함유하고 있어 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 산업에서 주목받고 있다. 특히 해조류는 재생 가능한 자원으로서 환경적 지속가능성을 확보할 수 있어 산업적 연구가 더욱 확대될 필요가 있는 핵심 자원으로 볼 수 있다.
Polydeoxyribonucleotide (PDRN)은 조직 재생 물질로 알려져 있으며, 다양한 세포 및 조직의 자가 재생을 촉진하는 DNA이다. 분자량 50-1,500 kDa 수준의 중합체로 adenosine A2A receptor를 활성화하여 세포 성장, 피부 재생 촉진뿐만 아니라 항염증, 골생성, 항노화, 콜라겐 합성 등 여러 활성을 가진다(Kim et al., 2021; Yang et al., 2021; Kim et al., 2010). 주로 연어, 무지개송어, 철갑상어 등 같은 어류의 정소에서 추출하고 있으나 어류의 대량 폐사, 회기 주기에 국한된 추출 시기 및 동물조직 유래 바이러스 오염 가능성 등의 문제가 제기되고 있다.
이에 따라 최근에는 브로콜리, 쑥갓, 인삼, 병풀, 알로에 등 다양한 식물에서 뿐만 아니라 김, 청각 등 해조류 및 클로렐라 등의 미세조류에서도 PDRN 추출 기술이 개발되고 있다(Song et al., 2022; Kim et al., 2023). 이는 안정적인 원료 확보와 함께 친환경적이라는 점에서 주목받고 있으며, 지속 가능한 바이오 원료 개발에 있어 중요한 대안으로 부상하고 있다.
본 연구는 대한민국 등록특허 제 10-2249241호 ‘신혈관생성 및 세포재생 효과를 갖는 해조류 유래 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 추출방법’(Han & Lee, 2021), 대한민국 등록특허 제10-2584027 ‘신혈관생성 및 세포재생 효과를 갖는 해조류 유래 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드’(Han & Lee, 2023)를 기반으로 흔히 사용되고 있는 동물(어류) PDRN을 대체하여 대표적 해조류인 김에서 PDRN을 순수하게 분리하였다.
본 연구를 통해서는 해조류(홍조류)에서 추출한 PDRN의 세포 독성, 항산화능, 콜라겐 생합성능, 항염증 효과 분석을 수행하였으며 인공피부 분석 및 안면 4대 주름 인체적용시험을 통해 피부 주름 개선에 도움을 주는 기능성 화장품 소재로 활용 가능성을 연구하고자 하였다.
Methods
1. 해조류 PDRN 추출
해조류(김) PDRN 추출은 대한민국 등록특허 제 10-2249241호 ‘신혈관생성 및 세포재생 효과를 갖는 해조류 유래 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 추출방법’(Han & Lee, 2021), 대한민국 등록특허 제10-2584027 ‘신혈관생성 및 세포재생 효과를 갖는 해조류 유래 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드’ (Han & Lee, 2023)를 기반으로 추출하였다. 국내 전남 완도에서 수급한 해조류(김)를 건조 및 분쇄하여 사용하였다. 콩 10중량%, 율무 10중량%, 녹차 추출물 20중량%, 콩 지방산 20중량%, 토코페롤 cocamidopropyl betaine 20중량%, Olive oil carboxylate 20중량%로 이루어진 친환경 단백질 용해 혼합용액을 제조하여 해조류의 단백질을 제거 및 분해하였다.
단백질 용해 후, 혼합물은 원심 분리하여 잔류물을 제거 및 필터링 후 상온에서 1시간 건조시켰다. 건조된 결과물에 정제수 및 발효 아세트산을 첨가하여 반응 및 소니케이션 10 min간 처리하여 최종 저분자의 PDRN을 확보하였다(Figure 1).
Extraction of marine plant PDRN.
Marine plant PDRN was produced using a patented manufacturing process. The prepared raw materials underwent protein removal and degradation, followed by purification to eliminate residual substances. Subsequent washing and drying steps, together with a low-molecular-weight processing step, were performed to adjust the molecular size, yielding the final low-molecular-weight PDRN.
2. 해조류 PDRN 확인 및 분석
해조류 PDRN을 추출하고 품질검사를 하기 위하여 nanodrop (NANO-400A; Allsheng, China) 이용하여 DNA 흡광도를 측정하였다. 또한 저분자 PDRN을 확인하기 위하여 1.5% agarose gel을 이용한 전기 영동(Agaro-PowerTM System; Bioneer, Korea)을 실시하였다.
3. DPPH 라디칼 소거능 평가
DPPH 라디칼 소거능은 384well (Corning, USA)에 해조류 PDRN 및 ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA)를 10 μL씩 분주하고, 0.15 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma-Aldrich)를 40 μL씩 분주하여 빛을 차단시킨 후 30 min동안 실온에서 반응하였다. 반응이 끝난 후 microplate reader (EnVision; PerkinElmer, USA)로 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 세포 배양
본 연구에서 사용한 CCD-986sk 세포는 ATCC에서 구입하여 사용하였다, 세포 배양을 위해 10% FBS (Gibco, USA)과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL) (Sigma-Aldrich)을 첨가한 Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) 배지 (ATCC, USA)를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양을 진행하였다. 본 실험을 위해 2–3세대를 계대 배양한 후 사용하였다. 또한 Raw 264.7 세포는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양은 10% FBS (Gibco, USA)와 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL) (Sigma-Aldrich)을 첨가한 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose) 배지(Sigma-Aldrich)를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 세포를 배양하였다. 본 실험을 위해 2–3세대를 계대 배양한 후 사용하였다.
5. 세포 독성 평가
CCD-986sk 세포를 96well plate (Corning, USA)에 1×104 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 해조류 PDRN 및 TGF-β1 (Sigma-Aldrich)을 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 또한 Raw 264.7 세포는 384well plate (Corning, USA)에 7.5×103 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 해조류 PDRN 및 L-NIL (Cayman, USA)을 농도별로 1시간 전처리하고, LPS (Sigma-Aldrich)를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 후, CellTiter 96® AQueous OneSolution Cell Proliferation Assay (MTS; Promega, USA)를 10 μL씩 분주하고 1시간 반응시킨 뒤 microplate reader (EnVision, PerkinElmer, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
6. NO 저해 활성능 평가
Raw264.7 세포는 384well plate (Corning, USA)에 7.5×103 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 해조류 PDRN 및 L-NIL (Cayman, USA)을 농도별로 1시간 전처리하고, LPS (Sigma-Aldrich)를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 세포 배양액을 수거하여 Griess Reagent System (Promega, USA)을 이용하여 제조사의 권장 방법에 따라 실험을 진행하고, microplate reader (EnVision; PerkinElmer, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
7. 프로콜라겐 생성능 평가
CCD-986sk 세포를 96well plate (Corning)에 1×104 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 배양하고, 배양된 세포에 해조류 PDRN 및 TGF-β1 (Sigma-Aldrich)을 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 세포 배양액을 수거하여 Procollagen Type-I C-Peptide EIA kit (Takara, Japan)의 각 well에 첨가하고, 제조사의 권장 방법에 따라 실험을 진행하고, microplate reader (EnVision, PerkinElmer)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
8. 3차원 배양피부모델을 이용한 재생 ∙ 탄력 평가
3차원 배양피부모델(Neoderm-ED; TEGO SCIENCE, KOREA)에 해조류 PDRN 및 L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich)을 배지층으로 3.5 mL씩, 세포층 표면 위로 30 μL씩 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 제조사 권장방법에 따라 H&E staining과 immunofluorescence staining을 진행하였다.
9. 주름 개선 임상 평가
해조류 PDRN (1 ppm, 10.0%)을 적용한 마린 플랜트 PDRN 아쿠아 세럼의 안면 4대 주름 인체 적용 시험(시험기관: 글로벌의학 연구센터, 시험기간: 2020년10월 22일-2020년 11월 20일; IRB No. GMRC-20O22-EB1)은 글로벌의학연구센터 표준작업지침서 (SOP)에 따라 시험을 수행하였다. 시험대상자 선정 기준에 적합한 만 35-60세의 주름이 있는 성인 여성 22명을 대상으로 안면 4대 주름(눈가, 이마, 입가, 팔자) 개선에 대한 인체 효능 평가를 실시하였다. 시험 제품을 4주간 사용한 후, Antera 3D CS (Miravex, Ireland)를 사용하여 측정하였으며, 시험대상자 설문 평가 및 피부과 전문의에 의한 이상 반응 평가를 통해 유효성 및 안전성을 평가하였다.
10. 통계 처리
본 연구에서 진행된 세포 내 실험군 간의 분석은 GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, USA) 프로그램을 이용하여 Student’s t-test로 유의성을 확인하였다. 또한 인체 적용 시험 분석은 IBM SPSS statistics 25.0 (SPSS Inc., USA)을 이용하여 Repeated measures ANOVA 혹은 Friedman test로 유의성을 확인하였으며, 각 시점 별 차이는 Bonferroni’s method를 이용하여 검정하였다.
Results and Discussion
1. 해조류 PDRN 추출 및 확인
해조류 PDRN을 추출하여 순도와 분자량을 확인하였다. Table 1에 나타낸 바와 같이, 260/280 nm 흡광도 값이 1.9의 고순도로 확인되었으며, 아가로스 겔 전기영동(Agaro-Power System, Bioneer, Korea)을 통해 분자량은 약 5-40 kDa으로 확인되었다(Figure 2). 연어 및 기타 식물 PDRN의 분자량이 약 66 kDa (100 bp)인 것을 고려하면(Lee et al., 2023) 해조류 PDRN이 저분자화 된 것을 알 수 있다.
Measurement of molecular weight and purity of marine plant PDRN
Marine plant PDRN electrophoresis.
Purified PDRN from marine plants was confirmed by 0.8% agarose gel electrophoresis. M represents the 10-bp DNA ladder, and A represents the marine plant PDRN. The fluorescence band of A appears in the 5–40 kDa range.
2. DPPH 라디칼 소거능 평가
최근에는 피부 노화 예방과 건강한 피부를 유지하기 위해서 활성산소 생성을 억제하거나 제거하는 항산화 성분 연구가 활발히 진행중이다. 본 연구에서는 해조류 PDRN의 DPPH 라디칼 소거능을 확인하여 항산화 활성 효과가 있는지 확인하고자 하였다. 해조류 PDRN의 항산화능을 확인하기 위하여 시험물질을 농도별로 처리하였다. Table 2에 나타낸 바와 같이, 10 μg/mL 농도에서 105.51%, 50 μg/mL 농도에서 106.35%, 100 μg/mL 농도에서 106.42%로 확인되었다. 특히, 대조군으로 사용한 ascorbic acid보다 높은 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타났다. 이러한 항산화 활성은 피부세포의 노화를 억제하는 효능을 나타내므로(Rinnerthaler et al., 2015) 피부 개선 효과를 가진 기능성 원료로의 가능성을 제시할 수 있다.
DPPH radical scavenging activity of marine plant PDRN
3. 세포 독성 확인
해조류 PDRN의 세포 내 독성을 확인하기 위하여 CCD-986sk과 Raw 264.7에 시험물질을 농도별(1, 10, 50, 100 μg/mL)로 처리하였다. 그 결과, 모든 농도에서 세포 생존율 80% 이상으로 확인되었으며, 대조군으로 사용한 TGF-β1 (100 ng/ml)과 L-NIL (10 μM)도 세포 생존율 80% 이상으로 확인되었다(Figure 3). 이에 본 연구에서 해조류 PDRN은 100 μg/mL 이하 농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았으므로 안전하다고 판단되어 시험 분석에 사용하였다.
Cytotoxic effects of marine plant PDRN in CCD986-sk and Raw264.7 cells.
Marine plant PDRN was applied at concentrations of 1, 10, 50, and 100 μg/mL for 24 h. The MTS reagent was used for the cell viability assay. (A) CCD986-sk cells were treated with marine plant PDRN, with TGF-β1 as a positive control. (B) Raw264.7 cells were treated with marine plant PDRN, with L-NIL as a positive control. Results are expressed as the mean±SD. Student’s t-test with significance levels of *p<0.05 and **p<0.01 relative to the control (0 μg/mL) group was used for statistical analysis.
4. NO 저해 활성능 확인
세포 내 nitric oxide (NO)는 다양한 염증 반응에 관여하여 체내 항상성을 유지하지만 NO가 과도하게 생성되면 염증 반응을 유발시킨다. 본 연구에서는 NO 생성 억제능을 확인하여 염증 개선 효과가 있는지 확인하고자 하였다. 해조류 PDRN의 세포 내 NO 저해 활성을 확인하기 위하여 시험물질을 농도별로 처리하였으며, NO 생성을 억제하여 염증 반응을 조절하는 L-NIL을 대조군으로 사용하였다. 그 결과, NO 저해 활성이 16.47-21.66%로 LPS로 염증을 유도한 실험군 대비 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다(Figure 4). 연어에서 추출한 PDRN에서도 NO 저해 활성을 통한 염증 개선 효과를 확인할 수 있었으므로(Castellini et al., 2017) 해조류 PDRN 또한 NO 저해 활성을 통한 염증 개선 효과를 기대해볼 수 있다.
Cytotoxic effects of marine plant PDRN in CCD986-sk and Raw264.7 cells.
Marine plant PDRN was applied at concentrations of 1, 10, 50, and 100 μg/mL, and LPS was applied at 10 μM for 24 h. No inhibitory activity was detected in the cell culture medium. Results are expressed as mean±SD.
5. 프로콜라겐 생성능 확인
콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로 피부 구조 및 탄력을 유지하는 역할을 한다. 콜라겐 생성 감소는 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 해조류 PDRN의 프로콜라겐 생성능을 확인하여 주름 개선 효과가 있는지 확인하고자 하였다. 해조류 PDRN의 프로콜라겐 생성능을 확인하기 위하여 시험물질을 농도별로 처리하였다. 그 결과, 87.86-97.21%로 프로콜라겐 Type I 생성능이 농도 의존적으로 증가하였으며, 대조군으로 사용된 TGF-β1과 유사한 프로콜라겐 Type I 생성능이 확인되었다. 기존의 다양한 연구를 통하여 PDRN은 프로콜라겐 단계에서 콜라겐 합성을 촉진하는 것으로 알려져 있으며(Khan et al., 2022), MAPK/ERK pathway의 활성화를 통해 콜라겐 생성을 유도하는 것을 확인할 수 있었으므로(Shine et al., 2023) 해조류 PDRN 역시 유사한 기전을 가질 것으로 판단된다. 따라서 콜라겐 생성을 통한 피부 탄력 및 피부 주름 개선 효능을 가지는 원료로의 가능성을 제시할 수 있다(Figure 5).
Effects of marine plant PDRN on procollagen type-I synthesis activity in CCD986-sk cells.
Marine plant PDRN was applied at concentrations of 1, 10, 50, and 100 μg/mL, and TGF-β1 was applied at 100 ng/mL for 24 h. No inhibitory activity was detected in the cell culture medium. Results are expressed as mean±SD. For statistical analysis, we conducted Student’s t-tests relative to the control (0 μg/mL) group at a significance level of ***p<0.001.
6. 3차원 배양피부모델을 이용한 재생 ∙ 탄력 시험
본 연구에서는 인간의 피부세포를 이용하여 진피 및 표피를 재현한 실험용 피부모델인 3차원 배양피부모델(Neoderm-ED)을 통해 해조류 PDRN의 세포 재생 및 탄력 활성을 확인하고자 하였다. 그 결과, 표피층의 두께가 대조군과 유사하게 증가하였으며, 표피와 진피경계의 기저막에서 재생·탄력 마커인 콜라겐 Type IV 발현(Abreu-Velez & Howard, 2012)이 증가하였다(Figure 6A). 또한 대표적 세포 증식 마커인 ki-67 (Prabhu et al., 2022)의 발현이 19.1%로 증가하는 것으로 나타나 피부 재생 및 탄력 활성이 있음을 확인하였다(Figure 6B).
Effects of marine plant PDRN on skin regeneration and elasticity in the 3D culture skin model.
Marine plant PDRN was applied at a concentration of 5 μg/mL, and ascorbic acid was applied at a concentration of 200 μg/mL for 24 h. (A) The thickness of the epidermal layer was analyzed by H&E staining, and collagen type IV expression was analyzed by immunofluorescence staining. (B) Ki-67 expression was analyzed by immunofluorescence staining. Results are expressed as mean±SD. For statistical analysis, we conducted Student’s t-tests relative to the control (0 μg/mL) group at a significance level of *p<0.05.
7. 주름 개선 임상 평가
주름 개선 효능을 확인하기 위해 해조류 PDRN (1 ppm, 10.0%)을 적용한 마린 플랜트 PDRN 아쿠아 세럼의 안면 4대 주름 인체적용시험을 진행하였다. 본 시험은 만 36-60세 주름이 있는 성인 여성 22명을 대상으로 시험 제품을 4주 사용하였다. 눈가, 이마, 입가, 팔자 주름 모두 시험 제품 사용 전에 비해 사용 2-4주 후 모두 유의한 수준으로 감소하여 주름이 개선됨을 확인하였으며(Figure 7), 시험 제품을 사용하는 동안 특별한 이상반응에 대한 보고는 없었으므로, 안전한 제품으로 판단되었다. 따라서, 해조류 PDRN을 적용한 제품은 안면 4대 주름 개선에 도움을 주는 것으로 판단되었다.
Effects of marine plant PDRN on facial wrinkle improvement in human skin.
Products containing marine plant PDRN were used for 4 weeks. (A, B) Facial wrinkles were measured using Antera 3D CS. Results are expressed as the mean±SD. For statistical analysis, we used ANOVA with post hoc Bonferroni correction at a significance level of a<0.05. Additionally, a Friedman test with a post hoc Wilcoxon signed-rank test and Bonferroni correction was performed at a significant level of b<0.025.
Conclusion
PDRN이 갖는 세포 재생, 항염증 등의 생리활성은 화장품 뿐만 아니라 의학 분야에서도 현재까지 많은 연구가 진행되고 있다. 대부분의 연구와 사업화는 어류의 정액, 정소 DNA를 확보하여 이용하고 있으나, 환경오염, 동물성 바이러스에 따른 감염성 질환이나 염증 발생, 어류 자원 고갈 등이 한계에 따른 안전성과 안정성이 확보된 PDRN의 개발이 필요한 실정이다.
본 연구에서는 해조류에서 분리 및 정제를 통한 최종 저분자 PDRN을 추출하여 시험 분석에 사용하였고, 대조군과의 비교 분석을 통해 우수한 효능을 입증하였다. 아가로스 전기영동을 통해 5-40 kDa의 저분자화된 해조류 PDRN은 세포 독성이 나타나지 않았으므로, 피부 자극 가능성이 낮고 안전한 것으로 판단된다. 해조류 PDRN의 DPPH 라디칼 소거능을 확인하여 대조군인 ascorbic acid보다 높은 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 해조류 PDRN의 NO 저해 활성을 통한 염증 개선 효과를 확인하기 위하여 대식세포에 LPS로 염증 반응을 유도하고 해조류 PDRN을 농도별로 처리한 결과, 농도 의존적으로 NO 저해 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 해조류 PDRN의 세포 재생, 피부 탄력, 주름 개선 효능을 분석하기 위해 프로콜라겐 생성능을 확인하였으며, 대조군으로 사용한 TGF-β1과 유사하게 프로콜라겐이 생성된 것을 확인하였다. 또한 인공피부 분석을 통해 표피층의 두께 증가 및 진피층에서의 콜라겐 IV, ki-67 발현의 증가를 통해 세포 재생 및 피부 탄력 활성이 있음을 확인하였다. 게다가 해조류 PDRN을 적용한 제품의 안면 4대 주름 인체 적용 시험을 진행하여 눈가, 이마, 입가, 팔자 주름 모두 시험 제품 사용 전에 비해 사용 2-4주 후 모두 유의한 수준으로 감소하여 주름이 개선됨을 확인하였다.
이러한 결과를 통하여 본 연구에서 사용된 해조류 PDRN은 항산화, 염증 개선 효과를 가지며, 프로콜라겐 생성을 유도하여 주름개선·탄력 효과가 있음을 증명하였다. 뿐만 아니라, 해조류 PDRN을 적용한 제품의 인체 적용 시험을 통해 기능성 화장품 원료로 사용될 수 있음을 확인하였다. 따라서 해조류 PDRN은 우수한 항산화 효과, 염증 개선, 주름 개선 및 피부 탄력 효과를 포함하는 기능성 화장품 소재로의 활용 가능성을 제시할 수 있다.
Notes
Author's contribution
J.S.H, supervised the project, H.S.K and W.S.L contributed equally to this work and designed all experimental and wrote the manuscript. R.S.J analyzed the data and performed this experiment. I.W.C assisted with experimental design.
Author details
Hyun Suk Ko (Researcher)/Su Jeong Ryu (Researcher), DERMARE, 86, Sesil-ro, Haeundae-gu, Busan 48107, Korea; WonSe Lee (Researcher), ALL IN ONE GENE TECH, 111, Hyoyeol-ro, Buk-gu, Busan 46508, Korea; Il Whan Choi (Professor), Department of Microbiology, Inje University College of Medicine, Bokji-ro 75, Busanjin-gu, Busan 47392, Korea; Ji sung Han (CEO), DERMARE, 86, Sesil-ro, Haeundae-gu, Busan 48107, Korea & ALL IN ONE GENE TECH, 111, Hyoyeol-ro, Buk-gu, Busan 46508, Korea.