화장품 소재로서 밀싹 추출물의 고온 보존이 항산화력 및 경피 수분 증발량에 미치는 영향
Impact of High Temperature Preservation of Wheat Sprout Extracts as Cosmetic Ingredient on Anti-oxidation Activity and Amount of Percutaneous Moisture Evaporation
化妆品原料-麦芽提取物在高温保存时抗氧化效果及经皮水分蒸发量的影响
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Abstract
목적:
본 연구는 밀싹 추출물을 활용하여 고온 보존 시 항산화력에 미치는 영향을 살펴보고, 밀싹 추출물을 함유한 크림이 화장품 소재로서 활용 가능성에 대하여 확인하고자 하였다.
방법:
고온 보존된 밀싹 추출물의 항산화력 변화와 피부 경피 수분 증발량 변화를 측정하였다.
결과:
밀싹 추출물은 고온 보존 시간에 따라 항산화력이 고온 보존 전보다 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 밀싹 추출물을 함유한 크림을 인체 피부에 적용하여 인체폐쇄첩포시험을 실시한 결과 시험 기간 중 피부 이상반응을 나타나지 않았으며, 밀싹을 함유한 크림은 일반 크림보다 손상된 피부 장벽 기능을 효과적으로 복원시켜 주고, 경피 수분 증발량을 효과적으로 줄여주어 피부 장벽 기능에 도움을 주는 것으로 확인하였다.
결론:
본 연구결과를 바탕으로 밀싹 추출물은 고온 보존에 불안정하여 화장품 소재로 활용 시 50℃ 이하에서 유화시키는 것이 항산화력 유지에 도움이 될 것으로 사료되며, 경피 수분 증발량을 효과적으로 줄여주는 것으로 보아 화장품 소재로서의 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
Trans Abstract
Purpose:
One of the objects in this study is to investigate the effect of high temperature preserved wheat sprout extracts on anti-oxidant activity. The other is to confirm the feasibility of the cream containing wheat sprout extracts as cosmetic materials.
Methods:
We performed the anti-oxidant assay and skin clinical testing to check the anti-oxidant activity and the transepidermal water loss index, respectively.
Results:
The anti-oxidant activity of wheat sprout extracts was decreased after the high temperature preservation than before. In the skin clinical testing of the cream with wheat sprout extracts, we found out that the cream restored the damaged skin barrier effectively by reducing the evaporation of skin.
Conclusion:
Based on our findings, we suggest that wheat sprout extracts should be melted below 50 degrees Celsius to preserve the anti-oxidant activity. As the extracts reduced skin moisture loss effectively, wheat sprout extracts are considered having the potential as cosmetic materials.
Trans Abstract
目的:
调查麦芽提取物在高温保存时,其抗氧化效果以及含有麦芽提取物的霜的适用可行性。
方法:
测定高温保存时麦芽提取物的抗氧化效果以及皮肤经皮水分蒸发量的变化。
结果:
麦芽提取物随着高温保存,发现抗氧化能力比高温保存前减少了。含有麦芽提取物的霜适用于人体皮肤,实施人体重复性损伤性斑贴试验结果,实验期间皮肤无任何异常反应,含有麦芽提取物成分的霜比一般霜有效地恢复损伤的皮肤屏障以及减少经皮水分蒸发量从而提高了皮肤屏障功能。
结论:
通过研究确认麦芽提取物在高温保存时不稳定,因此作为化妆品原料使用时,须在50℃以下进行乳化反应,可维持抗氧化效果以及减少经皮水分蒸发量。从而确定麦芽提取物作为化妆品原料充分具有可能性。
Introduction
인간의 피부는 체내에서 지나친 수분 방출을 막고, 기계적인 손상, 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아주며, 몸을 보호하는 내부와 외부 환경의 장벽 역할을 하며, 최대한으로 경피 수분 증발량(Transepidermal water loss, TEWL)을 감소시켜 신체 항상성 조절에 중요한 역할을 담당한다(Brandner et al., 2002; Chaqour et al., 1995).
계면활성제, 유기용매, tape stripping 등으로 피부 장벽기능을 빠르게 손상시키면 표피에서 항상성 회복 반응이 유발되어 장벽기능을 빠르게 회복하게 된다(Kim et al., 2011). 표피 항상성이란 기저층의 각질형성세포 성장분열과 이동이 수반되는 분화 과정을 통해 궁극적인 최종 분화(terminal differentiation)를 거쳐 각질층으로 불리는 피부 장벽을 형성하고 지속적으로 투과성 장벽(permeability barrier) 기능을 유지하는 것이라고 할 수 있다. 특히 장벽기능인 항상성 유지는 장벽의 구성 요소인 세포간 지질(mortar)과 각질세포(bricks)의 생성과 소멸이 균형을 이루도록 조절되어야 한다(Rissmann et al., 2009). 이처럼 피부 장벽의 손상은 피부 건조나 주름을 유발시킬 수 있으며, 현재 피부 장벽 기능에 대해 측정하는 방법으로 증발계(Evaporimeter)를 통해 경피 수분 증발량을 측정하는 방법이 가장 많이 사용되어 지고 있다(Jungersted et al., 2010).
밀싹은 wheat sprout 또는 wheat grass라 불리며 밀의 어린 새싹으로 밀이 발아하는 과정에서 밀의 마디 부위가 생성되기 전의 어린 새싹을 말한다(Meyerowitz, 1999). 일반적으로 새싹 종자는 다 자란 새싹보다 생리활성 물질을 4-200배 이상 함유하고 있는 것으로 알려져 있으며(Ha et al., 2009), 새싹을 생명력 넘치는 영양 덩어리라고도 한다(Kim & Lee, 2010). 현재까지 진행된 밀싹과 관련한 선행 연구로는 밀싹에 대한 항산화 연구(Aydos et al., 2011; Calzuola et al., 2005; Falcioni et al., 2002; Singh et al., 2010), 항암 효과(Bonfili et al., 2009; Okarter, 2012; Tudek et al., 1988; BarSela et al.,2007), 항염 효과(Janthachotikun et al., 2015; Reddy et al.,2000), 콜레스테롤 저해 효과(Calzuola et al., 2004), 혈액학적 질환 감소 효과(Choudhary et al., 2009) 등에 대하여 보고 되고 있으나 화장품 소재로서의 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 밀싹이 화장품의 고부가가치소재로 활용될 수 있도록 화장품 소재로 활용 시 문제가 되고 있는 항산화 유지력을 측정하고자 50% 에탄올 추출 방법을 이용하여 고온 보존 시 항산화력에 미치는 영향을 살펴보고, 밀싹 추출물을 함유한 크림을 인체 피부에 도포 시 피부 자극도와 경피 수분 증발량의 변화에 대해 평가하여 밀싹 추출물의 화장품 소재로서 활용 가능성에 대하여 연구하고자 한다.
Methods
1. 시료 준비
본 실험에 사용된 밀싹(Wheat sprout)은 경기도 성남시 분당 밀싹 농장에서 구입하여 50% ethanol을 20배 가한 후 37℃, 100 rpm 인큐베이터 안에서 72 h 추출하였다. 추출을 통해 얻어진 상층액을 정제하고, 정제된 추출물은 진공 감압한 후 동결 건조하여 시료 8 g을 얻어 시료로 사용하였다.
2. 시료 고온보존 처리 제조 방법
위와 같은 방법으로 제조한 밀싹 추출물을 50℃ h igh temperature drying oven (Chang-shin Scientific Co., Korea)에서 1일부터 5일까지 고온 보존하여 syringe filter (0.2 μm)로 filtering을 한 후 농도별로 사용하였다.
3. 항산화 측정
1) 총 폴리페놀 함량
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법(Folin & Denis, 1912)을 수정하여, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent가 시료의 페놀성 화합물에 의해 환원되어, 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 정량하였다(Gutfinger, 1981). 시료 400 μL와 Folin-Denis reagent 400 μL을 혼합하여 3 min 동안 반응시킨 뒤, 10% Na2CO3 를 400 μL를 혼합하여 암실에서 60 min 동안 반응시킨 후 새로운 96 well plate에 200 μL씩 분주하여 microplate reader (Synergy-HT, BIO-TEK instruments Inc., USA)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량 곡선은 caffeic acid를 이용하여 작성하였다.
2) 총 폴리페놀 표준검량선
총 폴리페놀 함량은 caffeic acid (0-100 μg/mL)의 만들어진 표준곡선에 sample의 흡광도 값(Y축)을 대입하여 농도(X축)을 결정하였다. 표준물질 농도를 X축, 피크 면적을 Y축으로 하여 검량선을 작성하였으며, 각각의 폴리페놀 성분에 대하여 작성된 검량선식은 직선을 나타내는 상관계수(R2)값이 0.963으로 직선성을 나타내어 표준곡선으로 사용이 가능하였다.
3) 총 플라보노이드 함량
총 플라보노이드 함량 측정은 Moreno 방법을 이용하였다(Moreno et al., 2000). 시료 100 μL와 1 M potassium acetate 20 μL, 10% aluminum nitrate 20 μL, 99.9% ethanol 860 μL를 혼합하여 실온에서 40 min 동안 방치한 후 원심분리기로 부유물을 가라앉힌 후 새로운 96 well plate에 상등액 200 μL씩 분주하여 microplate reader를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량 곡선은 quercetin을 이용하여 작성하였다.
4) 총 플라보노이드 표준검량선
총 플라보노이드 함량은 quercetin (0-100 μg/mL)의 만들어진 표준곡선에 sample의 흡광도 값(Y축)을 대입하여 농도(X축)을 결정하였다. 표준물질 농도를 X축, 피크 면적을 Y축으로 하여 검량선을 작성하였으며, 각각의 플라보노이드 성분에 대하여 작성된 검량선식은 직선을 나타내는 상관계수(R2)값이 0.999의 우수한 직선성을 나타내어 표준곡선으로 사용 가능하였다.
5) 전자공여능
전자공여능은 Blois의 방법을 이용하여 측정 하였다(Blois, 1958). 96 well plate에 ethanol에 녹인 10 mM DPPH 용액 180 μL와 고온처리 된 밀싹 추출물을 최종 농도 0.6-10 mg/mL가 되도록 희석한 후 20 μL를 혼합하여 37℃, 30 min 동안 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 임상실험
1) 임상실험용 크림 제조
본 실험에 사용된 임상실험용 크림은 Table 1의 처방에 따라 제조하였다. (A)상과 (B)상을 각각 80℃까지 가온한 후 (B)상을 (A)상에 투입하여 4,000 rpm에서 1차 유화를 실시하였다. 이후 50℃로 온도를 하강시킨 후 (C)상을 투입하여 4,000 rpm에서 15 min 동안 2차 유화를 실시하였고, 점도 있는 크림 제형을 얻어 실험에 사용하였다.
2) 피험자 선정
본 연구는 경기 지역에 거주하는 20-30대 성인 중에서 선정기준에 만족하며 제외기준에 해당되는 사항이 없는 사람을 대상으로 선정하였다. 연구목적, 내용 등에 관하여 충분한 설명을 듣고 자발적으로 연구 동의서에 서명한 사람을 대상으로 성인 남성과 여성 5명을 선정하였다.
3) 피부 자극도 시험
피험자의 상완의 안쪽에 0.5 mL의 밀싹 추출물이 함유된 크림을 사용하고 대조군은 아무것도 처리하지 않은 첩포를 사용하였다. 각각의 피험자에 대해 finn chambers (Epitest Ltd., Finland)가 부착된 테이프를 사용하였으며, 테이프를 부착한 뒤 48 h 후 제거한 다음 1 h 후와 48 h 후에 육안으로 분석하였다. 판정기준은 국제 접촉 피부염 연구회의 판정기준인 Table 2를 적용하였다.
4) 시험 방법
본 연구에서는 실내 온도 22-24℃, 실내 습도 40-60%를 유지하는 실내 환경 조건에서 해초 필링을 사용하여 측정부위를 손상시킨 후, 손상 후 및 도포 후 1 h 경과된 후에 측정하였다. 측정 시에는 팔 아래 안쪽 부위를 4곳으로 나누어 오른쪽(옆에서 2 cm지점), 왼쪽(옆에서 2 cm지점), 오른쪽 아래(위에서 2 cm지점), 왼쪽 아래(위에서 2 cm지점)으로 나누어 측정하였으며, 측정 시 항상 일정한 부위를 3회씩 반복 측정하였다. 경피 수분 증발량을 측정하기 위하여 피부 손상 전, 후 각각 vapometer (Delfin Technologies Ltd., Finland)를 이용하여 경피 수분 증발량을 측정하였다. 동일한 시험 담당자가 모든 연구대상자의 측정 부위에 기기를 접촉하여 10 s 동안 수평을 유지시키면서 일정한 부위를 3회 반복 측정하였고, 5일 동안 하루에 한번씩 TEWL을 측정하였다.
5. 통계처리 방법
본 연구의 모든 실험은 동일한 조건하에 독립적으로 3회 이상 실시하여 실험 결과를 얻었다. 모든 실험 결과는 평균±표준편차(Mean±S.D.)로 표기하였으며, 통계 처리는 SPSS Window Version 17.0 (SPSS Inc., USA)을 이용하여 분석하였으며, 유의성 검증은 Student’s t-test를 실시하였고, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
Results and Discussion
1. 항산화능
본 연구에서는 고온 보존 된 밀싹 추출물의 항산화력 변화에 대하여 알아보기 위하여 밀싹 추출물을 50℃에서 5일간 보존한 뒤 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 본 실험 결과, 밀싹 추출물의 control (1일차)군의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 각각 162.4 mg/mL, 240 mg/mL (1%)로 높은 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 함량을 나타내었으나, 50℃에서 5일간 고온 보존한 뒤 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 함량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 특히 10 mg/mL (1%) 농도에서 총 폴리페놀 함량이 23% 감소하는 것으로 확인되었으며(Figure 1), 총 플라보노이드 함량 역시 대조군에 비해 17.5%, 16.6%, 18.75%의 감소율을 나타내었다(Figure 2). 이는 고온 보존으로 인하여 밀싹 추출물의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량이 감소하는 것으로 확인되었다. 전자공여능 결과 고온 보존 5일째 10 mg/mL의 농도에서 control군에 비해 21.8%의 DPPH radical 소거능에 대한 감소율을 나타내었고, 고온 보존이 증가할수록 밀싹 추출물의 DPPH radical 소거능도 감소하는 것으로 확인되었다(Figure 3). 이와 같은 결과는 밀싹 추출물이 고온 보존에서 불안정하며, 고온 보존으로 인하여 밀싹 추출물의 항산화력에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
2. 첩포 시험에 의한 피부 자극 평가
피험자에 대한 인체 폐쇄첩포시험(closed patch test)을 실시한 결과는 Table 3과 같다. 판정시간은 30 min, 24 h, 48 h 후 첩포를 제거하고 2 h 지난 후 연구자에 의한 육안적 관찰 후 평가하였다. 시험 기간 중 피부 이상반응을 나타내는 지원자는 없었으며, 이상의 결과로 보아 밀싹 추출물이 함유된 크림은 피부에 적용 시 이상반응을 나타내지 않을 것으로 평가되었다.
3. 경피 수분 증발량 측정
본 실험에서는 해초 필링으로 피부장벽 손상을 유발시켜 경피 수분 증발량을 증가시킨 후 밀싹 추출물을 함유한 크림이 상처 회복에 미치는 영향을 조사하였다. 이에 본 실험에서는 해초 필링으로 피부장벽 손상을 유발시켜 경피 수분 증발량을 증가시킨 후 밀싹 추출물을 함유한 크림을 바른 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일째 측정을 통하여 피부장벽 손상 회복 정도를 확인하였다. control군은 손상을 유발한 후 아무 것도 바르지 않은 곳, BC군은 밀싹 추출물을 함유하지 않은 크림, WSC군은 밀싹 추출물을 함유한 크림으로, 총 5일 동안 실험을 진행하고 측정값을 표시하였다. 그 결과 Figure 4에서 보는 바와 같이 경피 수분 증발량은 피부장벽 손상 후 크게 증가하였다가, 1일째 되는 날부터 BC군과 WSC군은 control군에 비해 모두 급격한 감소를 나타내었다. 밀싹 추출물을 함유한 크림을 도포하였을 때 3일째 되는 날부터 유의한 경피 수분 증발량 감소를 확인하였으며(p<.001), 5일째 측정에서는 경피 수분 증발량이 더욱 더 감소하여 처음 시작할 때의 값들과 가까워지는 결과를 보였다. 최종적으로 BC군은 48.7%, WSC군은 53.69%의 개선율을 나타났으며, 무처치한 control군의 경피 수분 증발량은 전반적으로 서서히 감소를 보이는 것으로 확인되었다. 피부장벽구조 손상으로 인한 피부 수분 증발이 원활해짐에 따라 노화 및 각질의 들뜸, 가려움증의 현상을 나타낼 수 있다는 연구 결과(Kim, 2005)가 보고됨에 따라 밀싹 추출물을 함유한 크림이 이러한 피부 문제에 도움이 될 것으로 사료되고 있다.
Conclusion
본 연구에서는 밀싹 추출물을 화장품 원료로 이용할 경우 가장 문제가 되는 것은 항산화력의 유지력이다. 따라서 본 실험에서는 50% 에탄올에서 추출한 밀싹 추출물을 고온에서 보존하였을 때, 밀싹 추출물의 항산화력에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 조사하고, 화장품 소재로서 활용 가능성을 확인하고자 밀싹 추출물을 함유한 크림을 인체 피부에 도포 시 피부 자극도 평가와 경피 수분 증발량의 변화를 측정하였다. 본 연구 결과 밀싹 추출물을 고온 50℃에서 1일부터 5일까지 보존하였을 때 항산화력에 미치는 영향을 확인한 결과 고온 보존 시간에 따라 항산화력이 고온 보존 전보다 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 밀싹 추출물을 함유한 크림이 피부장벽이 손상된 피부의 회복력에 미치는 영향을 경피 수분 증발량으로 조사한 결과, 피부 장벽 손상 후 피부에 아무것도 바르지 않은 군은 24%, 밀싹 추출물이 첨가되지 않은 크림은 48.75%, 밀싹을 함유한 크림은 53.69%의 개선율이 나타났다. 이와 같은 결과는 밀싹의 뛰어난 항산화와 항염증 효과(You & Pyo, 2015)가 보고된 바와 같이 밀싹 추출물이 보이는 강력한 항염 작용이 피부 장벽 손상 후 나타나는 표피 투과 장벽 회복 과정에 일부 관여하는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구결과를 바탕으로 베리류보다 높은 항산화력을 가진 밀싹 추출물을 화장품 소재로 활용 시 고온 보존에 대하여 항산화 유지력이 불안정하므로 50℃ 이하에서 유화시키는 것이 항산화력 유지에 도움이 될 것으로 사료되며, 밀싹을 함유한 크림은 일반 크림보다 손상된 피부장벽 기능을 효과적으로 복원시켜 주고, 경피 수분 증발량을 효과적으로 줄여주어 피부장벽 기능에 도움을 줌으로써 화장품 소재로서의 활용가능성이 있음을 확인할 수 있었다.