JNK-AP1 기전을 통한 국화꽃 추출물의 MMP1 발현 변화 조절
Extracts of Chrysanthemum indicum Linne Mediated Regulation of MMP1 via JNK-AP1 Pathway
研究JNK-AP1 信号通路探索菊花提取物的MMP1 表达调节
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Abstract
목적
국화꽃은 다양한 항산화 물질을 내포하고 있어 한국, 중국 일본 등지에서 예로부터 감기, 두통, 어지러움, 고혈압 등에 사용되어 왔다. 그러나 지금까지 피부 진피에 국화꽃이 미치는 영향에 대해서는 잘 알려지지 않았다. 따라서 본 연구진은 실험을 통해, 국화꽃이 진피층의 세포외기질을 조절하여 피부노화를 경감시킬 수 있음을 제시하였다.
방법
실험에 사용한 국화꽃 추출물은 건조한 국화꽃을 분쇄하여 70% ethanol을 사용하여 침출하였고, MTT assay를 통해 세포독성실험과 이후 실험에 사용할 농도를 정하였다. qRT-PCR을 이용하여 MMP1의 mRNA 발현 변화를 확인하였으며, pGL-TRE luciferase reporter vector를 활용하여 AP1의 promoter 활성을 측정하였다. JNK와 p-JNK의 단백질 발현은 western blot을 통해 확인하였다.
결과
실험을 통해 국화꽃 추출물이 산화적 스트레스가 유도하는 MMP1 발현을 감소시키는 것을 증명하였으며 더불어, 이러한 현상이 국화꽃 추출물이 MMP1의 상위조절인자인 AP1의 전사활성을 조절하는 것으로부터 야기됨을 밝혔다. 마지막으로는 AP1이 JNK의 인산화를 저해하는 기작으로부터 조절되는 것을 증명하여 종합적으로 국화꽃 추출물이 JNK-AP1 경로를 통해 MMP1의 발현을 조절하는 것을 입증하였다.
결론
본 연구를 통해 국화꽃 추출물이 노화와 주름생성을 경감시킬 수 있는 잠재적인 화장품 원료로서의 가능성을 확인하였다.
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Purpose
Chrysanthemum morifolium flower, Chrysanthemum indicum Linne (C. indicum Linne), contains various antioxidants which are used to care cold, headache, dizziness, and hypertension in Korea, China, and Japan. However, in dermis, effects of C. indicum Linne are not understood, currently. Thus, in present study, we suggest an evidence that C. indicum Linne decreases skin aging by regulating extracellular matrix of dermis.
Methods
Dried C. indicum Linne was extracted with 70% ethanol and concentrations of this experiment were determined by cytotoxicity with MTT assay. Matrix metalloprotease 1 (MMP1) mRNA expression was confirmed by qRT-PCR and activity of AP1 promoter was measured with pGL-TRE luciferase reporter vector. Moreover, protein expression of JNK and p-JNK was assessed by western blot.
Results
As shown results, we demonstrated that C. indicum Linne extracts decreased MMP1 expression induced by oxidative stress. In addition, C. indicum Linne extracts repressed MMP1 transcription by regulating AP1 transcriptional activity. Lastly, we demonstrated AP1 was regulated by blocking phosphorylation of JNK. Overall, C. indicum Linne extracts regulates MMP1 expression using JNK-AP1 pathway.
Conclusion
C. indicum Linne extracts has potential to reduce aging and formation of wrinkle and to use as a cosmetic ingredient.
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目的
菊花含有多种抗氧化物质,在韩国、中国、日本等国家,从以前开始用于治疗感冒,头痛,头晕,高血压。但直到现在,还未查清菊花对皮肤真皮的影响。因此通过研究,提出菊花具有调节真皮层的细胞外基质, 减少皮肤老化的功效。
方法
实验中使用的菊花提取物是通过粉碎干燥的菊花,然后利用 70% 乙醇对其进行提取。通过MTT assay 测定细胞毒性,决定了菊花提取物的使用浓度。利用 qRT-PCR 确认 MMP1 的表达变化,利用 pGL-TRE luciferase reporter vector 测定 AP1的 promoter 活性,利用 western blot 确认 JNK 和 p-JNK的蛋白质表达。
结果
通过实验菊花提取物降低氧化应激诱导的MMP1表达,产生这种现象的原因是菊花提取物调节MMP1 上位调节因子 AP1的转录。而 AP1阻断JNK的磷酸化,因此菊花提取物通过JNK-AP1途径调节 MMP1的表达。
结论
通过研究菊花提取物作为潜在的化妆品原料时,具有降低老化和皱纹产生的功效。
Introduction
피부는 시간에 따라 노화가 진행되는데 대표적으로 자외선과 같은 외부 자극에 의해서 일어나는 광노화와 노화가 진행됨에 따라서 일어나는 자연노화로 나눌 수 있다(Chung et al., 1997; Rittié & Fisher, 2002). 광노화와 자연노화는 각각 다른 요인에 의해서 진행되기 때문에 특이한 특성을 가지며 노화가 진행되지만 공통적으로 주름이 발생한다는 특징을 가지고 있다(Fisher et al., 2002). 주름의 생성은 복합적인 요인에 의해서 생성되지만 그 중 핵심적인 요인은 진피층의 extracellular matrix (ECM) 변형이다. ECM은 collagen type I이 70%이상 구성되어 있고, 그 외에 collagen type III, V, VII와 elastin, proteoglycans, fibronectin 등이 얽혀있는 구조를 하고 있다(Uitto, 1986; Bateman et al., 1996). Collagen type I을 기반으로 ECM이 구성되어 있기 때문에 collagen type I의 생성과 분해의 조절불균형이 ECM 변형과 나아가서는 주름의 생성에 중요한 요인이 될 수 있다(Coulomb et al., 1984; Fisher & Voorhees, 1998; Chung et al., 1999). 이 중 collagen의 분해를 담당하는 matrix metalloprotease 1 (MMP1)은 자연노화 및 광노화에서 급격하게 증가되어 ECM의 변형과 주름 생성에 주요원인으로 알려져 있다(Uitto, 1986; Bateman et al., 1996). 노화가 진행될 때 자외선 또는 reactive oxygen species (ROS)는 c-Jun N-terminal kinase (JNK)-activator protein 1 (AP1) 기전의 활성화를 유도하고 이를 통해서 MMP1의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다(Fisher et al., 1997; Westermarck et al., 1998; Fisher et al., 2002; Poulalhon et al., 2006). 따라서 JNK-AP1 기전을 통한 MMP1 발현을 조절하는 활성물질에 대한 연구가 진행 중이며, 이를 통해서 ECM 변형을 막으려는 노력이 화장품 분야에서 진행 중이다(Dy et al., 1999; Gross et al., 1999; Angel et al., 2001; Varani et al., 2001; Dasgupta et al., 2010).
국화꽃은 다년생 초본으로 감국 또는 Chrysanthemum indicum Linne라는 생약명으로 알려져 있으며, 한국, 일본, 중국 등 동북아시아 지역에서 감기, 두통, 현기증, 고혈압 등에서 약재로 사용되고 있다(Park et al., 1998; Lee et al., 2011). 국화는 바이러스와 미생물 증식억제능력이 있고, 암세포의 성장을 저해할 뿐만 아니라(Nam & Yang, 1995), carbon tetrachloride 처리에 의한 간세포손상에 대해서 보호효과가 있는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2011). 또한 국화는 민간요법을 통해서 피부의 탄력과 아토피 개선에 효과적이라고 알려져 있지만 아직 관련된 효능 평가는 이뤄지지 않았다(An, 1998). 때문에 본 연구에서는 국화가 MMP1의 발현에 미치는 영향을 확인하고, 이에 대한 조절 기전을 규명하고자 한다.
Methods
1. 세포배양
인간진피섬유아세포(Lonza, Switzerland)는 Dulbecco’ s Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco), 10% penicillin (Gibco, 100 units/mL), streptomycin (Gibco, 100 μg/mL)를 첨가하여서 세포를 배양하였고, 배양조건은 37℃, 95% 습도, 5% CO2를 유지하는 배양기에서 배양하였다. 인간진피섬유아세포는 15계대 이하에서 collagen type I alpha 1 chain (COL1A1)과 MMP1의 발현이 양성대조군인 transforming growth factor beta (TGFβ; Sigma-Aldrich, USA)에 의해서 조절됨을 확인하였고, 이에 따라 3–15계대 사이의 인간진피섬유아세포를 이용하여 실험에 사용하였다.
2. 국화꽃 추출물 제조
국화꽃 추출물은 국화꽃을 세척하여 잘 건조하고, 건조 국화를 분쇄기에 분쇄하여 사용하였다. 분쇄된 파우더 형태의 국화꽃 100 g을 1 L의 70% ethanol에 넣고 30 min 동안 침출 후 추출하였고, 추출 조건은 60℃의 온도 조건에서 1 h 초음파를 가하여 추출하였다. 추출 후 여과지(Whatman No.2; GE Healthcare Life Sciences, USA)를 통해서 고형분과 분리하였으며, 걸러진 추출액은 감압농축기(EYELA, Japan)와 동결건조기(Ilshin, Korea)을 통해서 용매를 제거하고 분말형태로 만들었다. 분말 국화꽃 추출물은 세포에 처리하기 위해서 100 mg/mL로 dimethyl sulfoxide (DMSO; Biopure, Canada)에 녹여서 실험에 사용하였다.
3. 세포독성실험
세포독성실험은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich) assay를 통해서 수행하였다. 인간진피섬유아세포를 96 well에 각각 5×103개씩 접종하여 24 h 동안 배양하였다. 배양된 인간진피섬유아세포에 국화꽃 추출물을 각각 0–200 μg/mL 처리하였다. 국화꽃 추출물을 처리하고 24 h 배양 후 0.5 mg/mL의 농도로 MTT를 처리해준다. 빛을 차단한 상태에서 37℃에서 4 h 동안 MTT가 환원되어 formazan을 생성하도록 반응시켜주고, 상층액을 제거해준다. 이후 MTT formazan을 DMSO로 녹여, 595 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
4. MMP1 mRNA의 발현변화 확인
MMP1 mRNA의 발현변화는 quantitative real-time PCR (qRT-PCR)을 이용해서 측정하였다. 인간진피섬유아세포를 60 mm 배양접시에 5×105 개 접종하여 24 h 배양 후, H2O2와 국화꽃 추출물을 각 조건 별로 처리하고, 다시 24 h 배양하였다. qRT-PCR을 하기 위해서 먼저 trizol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용하여 total RNA를 추출하고, 추출된 RNA 1 μg을 2×reverse transcriptase mix (Enzynomics, Korea)를 이용하여 complementary DNA (cDNA)로 합성하였다. 각각의 샘플에서 합성된 cDNA를 qRT-PCR premix와 혼합하여 LineGene K (Bioer, China)에서 qRT-PCR을 수행하였다. MMP1을 증폭하기 위해서 MMP1 forward primer (5’-CTTTCTGGAAGGGCAAGGAC-3’)와 MMP1 reverse primer (5’-TTGCCTCCCATCATTCTTCA-3’)를 사용하였으며, normalization을 위해서 β-actin forward primer (5’-CGACAGGATGCAGAAGGAG-3’)와 β-actin reverse primer (5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGA-3’)를 이용하여 β-actin 증폭하였고, 이를 통해서 normalization을 하였다.
5. AP1 promoter 활성 측정
AP1의 활성은 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) responsive element (TRE)가 promoter에 삽입된 luciferase reporter vector를 이용하여서 수행하였다. 우선 luciferase reporter plasmid (pGL-TRE, 1 μg)와 normalization plasmid (pCMV-β-gal, 0.2 μg)을 동시에 Hilymix (Dojindo, Japan)로 인간진피섬유아세포에 형질전환을 하였고, 형질전환 후 국화꽃 추출물을 처리하고 24 h 뒤에 AP1 promoter의 활성을 측정하였다. 각각의 샘플을 1× luciferase lysis buffer (Promega, USA)에 파쇄하고, 원심분리 후 상층액을 분리하여 AP1의 활성을 보기 위해서 reporter gene으로 사용된 luciferase의 활성을 보았다. Luciferase 활성은 luciferase reagent (Promega)을 이용하였고, luciferase에 의한 luminescence의 발광정도는 Luminometer (Veritas; Turner BioSystems, USA)를 이용하여 측정하였다. Normalization은 동일한 샘플에 β-galactosidase의 활성을 ο-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 처리하여 변색여부를 흡광도로 측정하여서 luciferase assay값을 보정하였다.
6. JNK 활성 측정
JNK의 활성변화를 보기 위해서 JNK와 인산화된 JNK를 western blot으로 측정하였다. 인간진피섬유아세포를 60 mm 배양접시에 5×105 개 접종하여 24 h 배양 후, H2O2 와 국화꽃 추출물을 각 조건 별로 처리하고, 다시 24 h 배양하였다. 각 샘플을 RIPA buffer [50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), protease inhibitor]로 단백질을 추출한 후, 동량의 단백질을 SDS-gel을 이용하여 분리하였다. 이 후 nitrocellulose membrane (Whatman)으로 옮겨 anti-JNK, anti-p-JNK (Cell Signaling Technology, USA)와 β-actin (Sigma-Aldrich)를 이용하여 각각의 단백질을 검출하였다.
7. 통계처리
본 실험의 모든 실험은 3회 반복하여 진행하였고, 조건 간의 차이에 대한 유의성을 입증하는 방법으로 Student’s t–test을 이용하였다. Student’s t–test 결과 p<.05의 값을 유의성 있다고 판단하고, 유의적인 값에는 별표(*)를 하였다.
Results and Discussion
1. 인간진피섬유아세포에서 국화꽃 추출물의 세포독성 확인
인간진피섬유아세포에 국화꽃 추출물에 의한 세포독성을 확인하기 위해서, 국화꽃 추출물을 0–200 μg/mL로 인간진피섬유아세포에 24 h 처리 후 세포 생존율을 측정하였다. 100 μg/mL 이상의 농도에서 세포의 성장 억제가 농도의존적으로 일어나는 것을 확인하였고, 이에 따라 국화꽃 추출물의 독성이 없는 농도인 80 μg/mL 이하에서 MMP1 발현 변화에 대한 효능 실험을 진행하였다(Figure 1).
2. 인간진피섬유아세포에서 국화꽃 추출물의 산화적 스트레스에 의해 유도된 MMP1 발현 조절 확인
인간진피섬유아세포에서 국화꽃 추출물에 의한 MMP1의 발현 조절을 확인하기 위해서, H2O2로 산화적 스트레스를 유발시켜서 MMP1의 발현을 증가시키고, 동일 조건에서 국화꽃 추출물을 처리하였을 때 추출물에 의해서 MMP1의 발현이 감소되는지 확인하였다. Figure 2를 보면 인간진피섬유아세포에 600 μM H2O2를 처리하였을 때 MMP1의 발현이 170.28%로 증가하였고, 동일한 조건에서 국화꽃 추출물을 농도별로 처리한 결과 40 μg/mL 국화꽃 추출물에서 114.06%, 80 μg/mL 국화꽃 추출물에서 105.08%로 감소하였다.
3. 인간진피섬유아세포에서 국화꽃 추출물에 의한 TRE의 활성 변화
인간진피섬유아세포에서 산화적 스트레스에 의해서 MMP1의 발현이 조절될 때 JNK-AP1 pathway를 통해서 MMP1의 발현을 조절하는 것이 가장 대표적인 기전이다(Park et al., 2003). 때문에 본 논문에서도 AP1의 target promoter인 TRE의 활성 변화를 확인함으로써 AP1의 전사 활성이 국화꽃 추출물에 의해서 조절되는지 확인하였다(Risse et al., 1989; Park et al., 2003). 인간진피섬유아세포에 TRE-luciferase를 형질전환 후 600 μM H2O2 처리하여 산화적 스트레스가 유발됨에 따라 TRE 활성이 증가됨을 확인하였다. 동일한 조건에서 국화꽃 추출물을 농도별로 처리한 결과 대조군인 H2O2 처리군(293.54%)에 비해서 40 μg/mL 국화꽃 추출물에서 152.34%, 80 μg/mL 국화꽃 추출물에서 109.54%로 감소하였다(Figure 3).
4. 인간진피섬유아세포에서 국화꽃 추출물에 의한 JNK의 활성변화
국화꽃 추출물이 AP1의 활성 저해를 통해서 TRE 활성을 조절함을 확인하고, 이에 따라 AP1활성을 조절하는 상위의 분자신호기전인 JNK의 활성을 확인하였다(Karin, 1995; Leppäet al., 1998). 인간진피섬유아세포에 국화꽃 추출물 처리시에 600 μM H2O2를 처리하여 JNK의 활성을 인산화를 통해서 확인해본 결과, 산화적 스트레스에 의해 JNK의 인산화가 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 국화꽃 추출물에 의해서 JNK의 인산화가 감소됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 논문을 통하여 산화적 스트레스 상황에서 국화꽃 추출물의 MMP1 조절 작용을 확인하였고, 이러한 조절기전이 JNK-AP1 기전에 의해서 유발됨을 확인할 수 있었다. 또한 이를 통해서 산화적 스트레스가 유발되는 다양한 노화에서 국화꽃 추출물이 항주름 또는 항노화 화장품으로서 사용될 수 있는 가능성을 제시해 주었다(Figure 4).
Conclusion
국화꽃 추출물은 각종 항산화 물질과 항염증, 항암, 항균, 아토피 개선 등 다양한 작용이 밝혀져 있고, 향이 뛰어나기 때문에 차로도 즐겨 마신다. 하지만 피부노화에 대해서는 아직 명확하게 밝혀진 것이 없다. 때문에 본 논문에서는 국화꽃 추출물의 항노화 기전에 대해서 확인하고자 하였다. 본 논문의 결과에서 보는 것과 같이 국화꽃 추출물은 80 μg/mL 이하에서 세포의 독성이 없는 것으로 확인하였으며, 80 μg/mL 이하의 농도에서 산화적 스트레스에 의한 MMP1 발현 증가를 다시 원상태로 회복하는 것을 확인하였다. 또한 AP1의 binding site인 TRE을 이용하여 산화적 스트레스에 의한 MMP1 발현 조절의 전사인자로 작용하는 AP1의 활성을 측정하였다. 측정결과 산화적 스트레스에 의해서 증가하였던 전사활성이 국화꽃 추출물에 의해서 감소하는 것을 확인하였다. 또한 산화적 스트레스 상황에서 AP1에 c-Jun을 조절하여 AP1의 전사활성을 조절하는 mitogen-activated protein kinase (MAPK)인 JNK의 활성을 인산화를 확인하여 측정하였다. 그 결과 국화꽃 추출물은 산화적 스트레스에 의해 증가된 JNK의 인산화가 감소됨을 확인할 수 있었다. 종합적으로 보았을 때 국화꽃 추출물은 산화적 스트레스에 의한 JNK 인산화를 감소시켜 AP1의 활성을 감소시키고, 이를 통해서 MMP1의 발현을 조절함을 알 수 있다. 광노화, 자연노화 같은 피부노화에서 피부세포 내부에서는 산화적 스트레스가 유발되고 지속적인 산화적 스트레스에 의해서 MMP1의 발현은 증가되어 있다. 때문에 본 논문을 통해서 광노화 또는 자연노화에서 국화꽃 추출물은 JNK-AP1 pathway를 억제하여 MMP1을 조절함으로써 피부의 노화억제를 유도할 수 있는 새로운 화장품 원료임을 알 수 있다.
Acknowledgements
이 논문은 2016년도 오산대학교 교내 학술비지원에 의해서 수행됨.